木犀草素抑制NF-κB 增敏TRAIL 誘導肝癌HepG2 細胞凋亡作用的研究

吳文明，侯雄軍，何 潔，胡建新

［江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院）藥學部，江西 南昌 330006］

木犀草素為3’,4’,5,7-四羥基黃酮，廣泛存在于各種天然藥用植物和蔬菜果實中。木犀草素已被證明具有抗癌活性，如誘導細胞凋亡、細胞周期停滯及血管生成抑制等[1-2]。研究表明，木犀草素具有增敏（包括TRAIL 在內(nèi)的TNF 家族凋亡分子誘導多種人癌細胞凋亡）的作用，其增敏作用與下調(diào)NF-κB 表達、上調(diào)DR5 水平、抑制蛋白激酶活性以及降解XIAP 有關[3-5]。木犀草素具有安全低毒的特點，使其成為化療增敏劑的理想候選物[3]。目前，尚沒有關于木犀草素通過抑制NF-κB 活性，從而增敏TRAIL 誘導肝癌HepG2 細胞凋亡的相關研究。因此，本研究以亞細胞毒性濃度的木犀草素為研究對象，探討其抑制NF-κB 的活性，從而增敏TRAIL 誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用，為木犀草素聯(lián)合TRAIL 臨床治療肝細胞肝癌提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 細胞株

人肝癌HepG2 細胞（貨號：CL-0103，武漢普諾賽科技有限公司）。

1.2 藥物與試劑

木犀草素（HY-N0162，MCE）；TRAIL（C022，Novoprotein）；DMEM 培養(yǎng)基（含雙抗，KGM12800S，凱基生物）；胎牛血清（A8020, Solarbio）；1× PBS（0.01M，pH = 7.4）（KGB5001，凱基生物）；CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒（KGA317，凱基生物）；Annexin V-APC/7-AAD 細胞凋亡試劑盒（AP105-100kit，聯(lián)科生物）；細胞周期染色試劑盒（CCS102，聯(lián)科生物）；BCA Protein Assay Kit（E-BC-K318-M，Elabscience）；Marker（#26617，美國賽默飛）；內(nèi)參一抗：Mouse Anti-β-Actin（HC201，TransGen Biotech，1/2 000）；二 抗：HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG （H+L）（GB23301，Servicebio，1/2 000）；目的 一 抗：Mouse Anti NF-κB p65 （66535-1-Ig，Proteintech，1/500），Rabbit Anti IκBα（10268-1-AP，Proteintech，1/1 000），Rabbit Anti p-IκBα（AF2002，Affinity，1/1 000）；二抗：HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG （H+L）（GB23303，Servicebio，1/2 000）。

1.3 主要儀器

BPN-80CW 型CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；MF53 型熒光倒置顯微鏡（廣州市明美光電有限公司）；BBS-SDC 型超凈工作臺（山東博科科學儀器）；SuPerMax3100 型多功能酶標分析儀（上海閃譜生物科技有限公司）；NovoCyte 2060R 型流式細胞儀（ACEA Biosciences Inc.）；NP80 型紫外分光光度儀（NanoPhotometer）；DYY-8C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；WD-2102B 型全自動酶標儀及DYY-6C 型蛋白垂直電泳儀（北京市六一儀器廠）；Tanon-5200 型全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

取長勢良好的細胞進行傳代。操作如下：吸棄培養(yǎng)上清，1×PBS 洗凈兩次，0.25%胰酶消化，細胞變圓后終止消化，加入培養(yǎng)基輕輕吹打，然后將細胞懸液轉移至10 mL 離心管中，離心后棄上清，加入培養(yǎng)基反復吹打至均勻。按1 ∶3 的比例，將細胞懸液分置于預備好的培養(yǎng)皿中，做好標記，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，完成細胞傳代。根據(jù)實驗需要將細胞鋪至6 孔板、96 孔板、6 cm 培養(yǎng)皿，按細胞傳代方法，根據(jù)實驗需要，將細胞進行稀釋，以6 孔板每孔約2×105個細胞，96 孔板每孔約1×104個細胞，6 cm培養(yǎng)皿每皿約5×105個細胞種板，完全貼壁后即可進行下一步實驗。

2.2 CCK8 法檢測細胞增殖情況

取對數(shù)期細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h 后，分別加入終濃度為200、100、75、50、25 μmol/L 的木犀草素，100、80、60、40、20 ng/mL 的TRAIL 以及50 μmol/L 木犀草素加不同終濃度的TRAIL，處理24 h，每孔加入10 μL CCK8檢測試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h；取出搖勻，在波長450 nm 下，測定每孔OD值，計算細胞存活率。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡和周期情況

參照細胞凋亡檢測試劑盒操作說明書及文獻[6]：收集1 ～ 3×106個細胞，加1 mL PBS，1 500 r/min 離心3 min，洗凈兩次，取500 μL 預冷的1×Binding Buffer 重懸細胞，每管各加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，輕微混勻，室溫避光孵育10 min后，混勻，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。參照細胞周期檢測試劑盒操作說明書及文獻[7]：收集2×105～3×106個細胞，離心3 min，棄上清液；加入1 mL PBS，1 500 r/min 離心棄上清液；加入1 mL DNA 染色液和10 μL 滲透溶液，渦旋振蕩5 ～ 10 s 混勻，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測分析細胞周期。

2.4 Western-Blotting 檢測NF-κB 相關蛋白

參考文獻[8]報道的方法，將培養(yǎng)皿中細胞培養(yǎng)液吸棄，加入100 μL 的細胞裂解液，冰上放置20 min。將細胞刮至一側，液體轉移至標記好的EP 管中，12 000 r/min 離心10 min，取上清，即為總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，電泳2 h，在300 mA恒流轉膜80 min。一抗孵育，4 ℃過夜；二抗室溫孵育2 h。膜上滴加發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用Image Pro 軟件分析各條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 木犀草素與TRAIL 對HepG2 細胞增殖的影響

分別用不同濃度的木犀草素和TRAIL處理HepG2細胞24 h，結果顯示，木犀草素在25 ～ 200 μmol/L的濃度范圍內(nèi)皆有抑制HepG2 細胞增殖的作用，見圖1。這與文獻[9]報道的一致。其抑制率分別為5.04%、11.67%、26.88%、45.46% 和84.10%，因此選擇亞細胞毒性濃度50 μmol/L 的木犀草素作為本次研究的對象。TRAIL 在20 ～ 100 ng/mL 濃度范圍內(nèi)對HepG2 細胞的增殖亦表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率分別為6.61%、10.30%、14.98%、16.19%和16.32%。將50 μmol/L 木犀草素分別和不同濃度的TRAIL 共同作用于HepG2 細胞。結果顯示，50 μmol/L 木犀草素和20 ng/mLTRAIL 對誘導HepG2 細胞生長的抑制率最小 （P＜ 0.05），協(xié)同因子達到1.802，見表1。因此，選定 50 μmol/L 的木犀草素和20 ng/mL 的TRAIL 進行接下來的實驗研究。

表1 50 μmol/L 的木犀草素和不同濃度TRAIL 聯(lián)合用藥對HepG2 細胞生長的抑制率及協(xié)同因子的影響（n = 3）Tab.1 Growth inhibition rates of HepG2 cellsand co-factors treated with 50 μmol/L luteolin in combination with various concentrations of TRAIL（n = 3）

圖1 不同濃度的木犀草素與TRAIL 對HepG2 細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of luteolin and TRAIL on proliferation of HepG2 cells

3.2 各實驗組對HepG2 細胞凋亡及周期的影響

空白對照組細胞的自然凋亡率為4.80%，而由50 μmol/L 的木犀草素引起的HepG2 細胞凋亡率為20.80%，明顯高于空白對照組（P＜0.05），且主要是晚期凋亡。20 ng/mL TRAIL 引起的HepG2 細胞凋亡亦主要是晚期凋亡，凋亡率為11.46%。與空白對照組、木犀草素組和TRAIL 組相比，木犀草素+TRAIL 組引起的HepG2 細胞凋亡率明顯上升為41.91%（P＜0.05），主要為早期凋亡，見圖2A。

圖2 各實驗組對HepG2 細胞凋亡（A）及周期（B）的影響Fig.2 Effects of different experimental groups on apoptosis（A）and cycle（B）of HepG2 cells

空白對照組的G0/G1期、S 期和G2/M 期的細胞數(shù)分別占比57.12%、30.54%和12.34%。與空白對照組相比，TRAIL 組細胞各周期細胞數(shù)無明顯變化；木犀草素組G0/G1期細胞數(shù)量減少為46.14%，S 期和G2/M 細胞數(shù)量增加，分別為39.49%和14.37%。與空白對照組和單獨用藥組相比，木犀草素+TRAIL 組G0/G1期和G2/M 期細胞數(shù)量減少，分別占比30.98%和11.30%，S 期細胞明顯增加，占比57.72%，細胞停滯于S 期，見圖2B。

3.3 各實驗組對HepG2 細胞NF-κB 相關蛋白的影響

與空白對照組相比，木犀草素組IκBα、p-IκBα和NF-κB p65 蛋白表達下降（P＜0.05），TRAIL組IκBα、p-IκBα 和NF-κB p65 表達上升；與空白對照組和單獨用藥組比較，木犀草素+TRAIL組IκBα、p-IκBα 和NF-κB p65 蛋白均下降 （P＜0.05），見圖3。結果表明，木犀草素能夠抑制IκBα 磷酸化，從而抑制NF-κB 的活化；而木犀草素與TRAIL 合用，IκBα、p-IκBα 和NF-κB p65 蛋白表達下降更甚，說明對NF-κB 的抑制更強。

圖3 各實驗組對HepG2 細胞NF-κB 相關蛋白的影響Fig.3 Effects of different experimental groups on NF-κB-related proteins in HepG2 cells

4 討論

TRAIL 具有廣譜、高效、特異的誘導腫瘤細胞凋亡的作用，并且對正常細胞沒有殺傷作用。60%的腫瘤細胞對TRAIL 誘導的凋亡并不敏感，但TRAIL與化療藥物聯(lián)合應用時對大多數(shù)腫瘤細胞表現(xiàn)出協(xié)同殺傷效應，具有較好的應用前景[11-13]。本研究結果顯示，HepG2 細胞經(jīng)TRAIL 處理24 h 后出現(xiàn)了凋亡，說明TRAIL 具有一定的誘導HepG2 細胞凋亡的作用，這與相關文獻[3-4]報道的一致。但有文獻報道，經(jīng)TRAIL 處理的肝癌細胞其Bcl-2 和Bcl-XL 等抗凋亡蛋白表達上調(diào)，而促凋亡蛋白Bax、Bcl-Xs 表達下降，這可能與NF-κB 的活化有關[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TRAIL 處理后，細胞內(nèi)的NF-κB 蛋白表達增加，而NF-κB 又能導致cIAP-1、cIAP-2、XIAP、cFLIP、Bcl-XL 和TRAIL-R3 等抗凋亡蛋白表達上調(diào)，從而抑制肝癌細胞的凋亡，這是大多數(shù)腫瘤細胞對TRAIL 誘導的凋亡不敏感的一個因素[11]。因此，抑制NF-κB 的活化，增敏TRAIL 誘導HepG2細胞的凋亡值得進一步研究。

在正常情況下，NF-κB 與其抑制蛋白IκB 以聚合體的形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)，無轉錄活性；當受到外界刺激時，IκB 發(fā)生磷酸化水解，并與NF-κB分離，NF-κB 被釋放轉位進入細胞核，從而引起特定靶基因的表達，促進腫瘤的形成和進展[16]。目前，已有大量的研究證明，通過下調(diào)NF-κB 的表達能夠誘導肝癌細胞的凋亡[17-19]。因此，抑制IκB 的降解以及NF-κB 的活性，是誘導肝癌細胞的凋亡的一個重要靶點[20]。目前，木犀草素已被證實具有抑制肝癌HepG2 細胞NF-κB 活性，與TRAIL 合用能否增敏TRAIL 誘導HepG2 細胞凋亡是本研究的重點。研究結果顯示，亞細胞毒性的木犀草素與TRAIL 聯(lián)合應用后，細胞凋亡程度明顯高于單獨使用TRAIL 組。同時，Western Blotting 實驗結果顯示，兩者聯(lián)合應用后，木犀草素組、木犀草素+ TRAIL 組中IκB、p-IκB和NF-κB 蛋白明顯降低，表明木犀草素能抑制IκB 的磷酸化，使NF-κB 無法被激活，降低了藥物抵抗性，從而增強了TRAIL 誘導細胞凋亡的作用，這可能是木犀草素增敏TRAIL 誘導肝癌HepG2 細胞凋亡的一個重要因素。

5 結論

木犀草素與TRAIL 合用可以抑制HepG2 細胞IκBα 的磷酸化，從而抑制NF-κB 活化，抵抗TRAIL激活NF-κB的作用，增加HepG2細胞對TRAIL的敏感性，促進HepG2 細胞凋亡。然而NF-κB 被抑制后，cIAP-1、cIAP-2、XIAP、cFLIP、Bcl-XL 等抗凋亡蛋白和Bax、Bcl-Xs 等促凋亡蛋白的表達尚無相關研究，這可能與木犀草素增敏TRAIL誘導肝癌HepG2細胞凋亡的機制有關，有待進一步探究。木犀草素與TRAIL 合用，不僅可以減少木犀草素在抗腫瘤中的用量，降低對正常細胞的細胞毒性，也為木犀草素聯(lián)合TRAIL 在臨床治療肝癌提供理論基礎和實驗依據(jù)，為開發(fā)具有增敏TRAIL 誘導腫瘤細胞凋亡的藥物提供實驗思路。