奶香木生藥學(xué)研究

曾業(yè)達(dá)，楊 麗，張丹雁，班夢夢，范紫穎

（廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

奶香木別名“奶沉”“蜜香木”，來源于?？萍蠃o腎樹屬植物假鵲腎樹Pseudostreblus indicusBureau倒地陳化形成的芳香木材，分布于中國的云南、廣西、海南等省區(qū)及老撾[1-2]，木材行業(yè)又將假鵲腎樹稱為“水坡壘”“香坡壘”[3-4]。因散發(fā)特殊的奶香氣，在香業(yè)市場常被制成熏香材料或文玩工藝品。《中國藥用植物志》[5]記載假鵲腎樹在我國西南地區(qū)民間常以樹皮入藥，藥名為“滑葉跌打”“青樹跌打”，具有散淤消腫、止痛、活血止血等功效，可治療內(nèi)外出血、跌打損傷及風(fēng)濕痹痛等，該樹皮以“滑葉跌打”中藥名收錄于1974 年版和1996 年版《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》，相關(guān)書籍與文獻(xiàn)[6-12]均有藥用記載及研究，“滑葉跌打”還是云南紅藥散的配方組成之一[13]。然而目前未見奶香木在藥用方面的研究報(bào)道，奶香木是否與樹皮一樣具有藥用價(jià)值，尚待研究。為探究奶香木的藥用價(jià)值，本文初步研究奶香木的外觀性狀、顯微組織及化學(xué)成分，為開發(fā)假鵲腎樹藥用植物新資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 供試樣品

共收集20 批不同產(chǎn)地的奶香木樣品，批號(hào)S1、S2 為對照樣品，收集的實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)張丹雁教授鑒定為來源于假鵲腎樹Pseudostreblus indicusBureau 的莖、根部木材及樹皮。樣品保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。樣品信息見表1。

表1 奶香木樣品信息Tab.1 The sample information of Naixiangmu

1.2 儀器

Canon PowerShot SX 70HS 型數(shù)碼相機(jī)（日本佳能株式會(huì)社）；JJ-12J 型脫水機(jī)、JB-P5 型包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 型切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；B302 型生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；DFY-300 型多功能高速粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；CAMAGATS4 型全自動(dòng)點(diǎn)樣器（瑞士卡瑪公司）；WFH-201B 型紫外透射反射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）。

1.3 試劑

50% FAA 固定液（批號(hào)：20210310，福州飛凈生物科技有限公司）；水合氯醛（批號(hào)：C10107964，上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇（批號(hào)：2021100208）、濃硫酸（批號(hào)：20210305）、鹽酸（批號(hào)：20190503）、石油醚（沸程 60 ～ 90℃，批號(hào)：20210401）、三氯化鐵（批號(hào)：2014120107）、三氯甲烷（批號(hào)：2021030103），均購于廣州化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯（批號(hào)：2020041039）、無水乙醇（批號(hào)：2020060149）、氫氧化鈉（批號(hào)：2019102008）、甘油（批號(hào)：20180220）、冰醋酸（批號(hào)：2018101012）、二甲苯（批號(hào)：20200407），均購于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氯化鋁（批號(hào)：20171114，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；苦味酸（批號(hào)：20170102，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；邪蒿素（純度 ≥ 96.5%，批號(hào)：NO3GB166576，上海源葉生物科技有限公司）；布拉易林（純度 ≥ 98%，批號(hào)：OK210211D，北京沃凱生物科技有限公司）；濱蒿內(nèi)酯（純度 ≥ 98%，批號(hào)：201112，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司）；佛手苷內(nèi)酯（純度：98%，批號(hào)：BD14410-0.25，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司）；7-羥基香豆素（純度：98%，批號(hào)：FY00B6109）、東莨菪內(nèi)酯（純度：98%，批號(hào)：FY1155B1218），均購于南通飛宇生物科技有限公司。甲醇（色譜級，批號(hào)：0212220402，上海麥克林生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 性狀鑒定

采用眼看、手摸、鼻聞及口嘗等性狀鑒定法觀察奶香木外觀形態(tài)，總結(jié)記錄其鑒別特征。

2.2 顯微鑒定

2.2.1 三向切面鑒定 采用常規(guī)石蠟切片法制備奶香木莖、根部三切面，顯微裝片，鏡檢。

2.2.2 粉末鑒定 取適量奶香木粉末（過5 號(hào)篩），制片完成后鏡檢觀察。

2.3 薄層色譜鑒別

取表1 中供試與對照樣品粉末（過2 號(hào)篩），置100 mL 帶塞錐形瓶中，加入甲醇15 mL，40 kHz 超聲輔助提取30 min，濾過得供試品溶液。另精密稱取邪蒿素、布拉易林、濱蒿內(nèi)酯、佛手苷內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯及東莨菪內(nèi)酯對照品適量，加甲醇定容制成0.5 mg/mL 的對照品溶液。分別吸取供試品與對照品溶液3 μL，點(diǎn)于硅膠G 薄層板上，展開系統(tǒng)為石油醚∶乙酸乙酯（3 ∶2），展開完成后取出晾干，置365 nm 紫外光下檢識(shí)。

2.4 指標(biāo)成分含量測定

2.4.1 溶液制備 供試品溶液制備：取表1 中供試與對照樣品共19 份（無S2），粉碎過5 號(hào)篩，精密稱取0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入30 mL 甲醇，用封口膜封口，室溫40 kHz 超聲輔助提取30 min，充分搖勻，過濾，再經(jīng)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜過濾，備用。每份供試品平行制備3 份。

對照品溶液制備：各取邪蒿素、布拉易林適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成濃度為1 mg/mL 的母液。然后將邪蒿素母液逐級稀釋成220、180、140、100、60、20 μg/mL 的對照品溶液，將布拉易林母液逐級稀釋成120、100、80、60、40、20 μg/mL 的對照品溶液。

2.4.2 色譜條件 色譜柱為安捷倫Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速為1 mL/min；柱溫為30℃；邪蒿素檢測波長為292 nm；布拉易林檢測波長為257 nm；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為水 （A）和甲醇（B），梯度洗脫：0 ～ 10 min，5%→35%B；10 ～25 min，35%→85%B；25 ～ 35 min，85%→95%B。

2.4.3 方法學(xué)考察 （1）線性關(guān)系 分別進(jìn)樣測定邪蒿素與布拉易林對照品溶液的色譜峰面積與保留時(shí)間，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X，μg/mL）作線性回歸方程。

（2）精密度試驗(yàn) 取220 μg/mL 邪蒿素對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定邪蒿素峰面積并計(jì)算RSD 值。

（3）重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.4.1”項(xiàng)下方法平行制備奶香木供試品（批號(hào)4-1）溶液6 份，進(jìn)樣測定邪蒿素與布拉易林峰面積并計(jì)算RSD 值。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備奶香木供試品（批號(hào)2-1）溶液，在0、3、6、9、12、24 h 進(jìn)樣測定邪蒿素與布拉易林峰面積并計(jì)算RSD 值。

（5）加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.4.3（3）”項(xiàng)下已知質(zhì)量濃度的6 份供試品溶液各100 μL，精密加入220 μg/mL 邪蒿素對照品溶液50 μL 與100 μg/mL 布拉易林對照品溶液50 μL，得200 μL混合供試品溶液。依照方法對6 份混合供試品溶液進(jìn)行峰面積檢測，計(jì)算回收率與RSD 值。

2.4.4 含量測定 取“2.4.1 ”項(xiàng)下的供試品溶液，依法進(jìn)樣，記錄邪蒿素與布拉易林的峰面積與保留時(shí)間。

3 結(jié)果

3.1 性狀鑒定

奶香木表面及斷面見縱向及橫向木纖維紋，黃白色、黃色及灰黑色，橫切面偶見深淺不一的同心環(huán)紋，縱切面可見色澤深淺不一的條狀紋理，表面及斷面偶見白霜析出，具濃郁奶香氣，味淡，木質(zhì)堅(jiān)硬，色深者香氣更濃，質(zhì)地更加致密。燃燒冒黑煙，體輕易浮水。見圖1。

圖1 奶香木性狀特征圖Fig.1 The macroscopical characteristics of Naixiangmu

3.2 顯微鑒定

3.2.1 三向切面鑒定 莖部橫切面：木射線組織徑向排列，較密，寬窄不一，遇導(dǎo)管處常彎曲，寬多數(shù)1 ～ 3 列，少數(shù)4 列，射線細(xì)胞類長方形，胞腔較寬，可見紋孔。導(dǎo)管類圓形，多數(shù)2 ～ 3 個(gè)復(fù)管狀或單個(gè)散在。木纖維呈類圓形或多角形，排列密集，壁厚。軸向薄壁組織整體成翼狀、環(huán)管狀或離管帶狀，離管薄壁細(xì)胞1 ～ 6 列。

莖部弦切面：木射線組織長梭形或紡錘形，寬1 ～ 4 列細(xì)胞，高4 ～ 33 個(gè)細(xì)胞，射線細(xì)胞類圓形或長橢圓形，非疊生。具緣紋孔導(dǎo)管長管狀，兩端平截或稍偏斜，紋孔密集。木纖維長梭形，排列緊密，壁厚且胞腔小。木薄壁細(xì)胞長楔形或長方形，一端平截或稍尖，部分細(xì)胞壁呈連珠狀增厚。

莖部徑切面：木射線排列成橫向帶狀，高4 ～ 33個(gè)細(xì)胞，與木纖維、木薄壁細(xì)胞群垂直相交；射線細(xì)胞異形，呈橫臥式或長方形，壁呈連珠狀增厚。木薄壁細(xì)胞與木射線細(xì)胞偶含草酸鈣方晶，余同弦切面。根部三切面顯微與莖部相似。見圖2 。

圖2 奶香木莖部三切面顯微圖Fig.2 The microscopic characteristics of tri-directional section of Naixiangmu trunk

根部三向切面顯微特征與莖部相似。橫切面木射線組織徑向排列，射線細(xì)胞類長方形；導(dǎo)管多復(fù)管狀；軸向薄壁組織為翼狀、環(huán)管狀或離管帶狀。弦切面木射線組織寬1 ～ 4 列細(xì)胞，高4 ～ 30 個(gè)細(xì)胞；具緣紋孔導(dǎo)管，管腔稍大；木薄壁細(xì)胞為長楔形或長方形。徑切面木射線組織高4 ～ 30 列細(xì)胞。見圖3。

圖3 奶香木根部三切面顯微圖Fig.3 The microscopic characteristics of tri-directional section of Naixiangmu root

3.2.2 粉末鑒定 奶香木粉末黃色。木纖維成束，黃棕色，長梭形，壁厚，胞腔小，外側(cè)包圍著含草酸鈣方晶的薄壁細(xì)胞形成的晶鞘纖維。導(dǎo)管常破碎，具緣紋孔清晰呈短縫狀，排列緊密。木薄壁細(xì)胞呈長楔形或長方形，一端平截或稍尖，部分壁微厚，具單紋孔，偶含方晶。木射線細(xì)胞長方形、類圓形或長橢圓形，壁有連珠狀增厚，可見單紋孔。色素塊黃棕色，呈不規(guī)則塊狀，大小不一。草酸鈣方晶散在。見圖4。

圖4 奶香木粉末顯微特征圖Fig.4 The microscopic characteristics of powder from Naixiangmu

3.3 薄層色譜鑒別

薄層色譜圖見圖5，供試品與對照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。初步檢識(shí)出奶香木含邪蒿素（Rf≈ 0.62 ～ 0.7）、布拉易林（Rf≈ 0.37 ～ 0.43）及濱蒿內(nèi)酯（Rf≈ 0.27 ～ 0.33），可能含有佛手苷內(nèi)酯等香豆素類成分。假鵲腎樹樹皮含有佛手苷內(nèi)酯、7-羥基香豆素（傘形花內(nèi)酯）與東莨菪內(nèi)酯。故選取邪蒿素與布拉易林作為奶香木的指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定。

圖5 奶香木薄層色譜圖Fig.5 The thin layer chromatography of Naixiangmu

3.4 指標(biāo)成分含量測定

3.4.1 方法學(xué)考察 （1）線性關(guān)系 邪蒿素線性回歸方程為Y= 209.35X+ 415.24，R2= 0.999 4，在20 ～ 220 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均保留時(shí)間為25.430 min；布拉易林線性回歸方程為Y= 156.05X-385.99，R2= 0.999 7，在20 ～ 120 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均保留時(shí)間為22.987 min。

（2）精密度試驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)樣6 次測定的邪蒿素峰面積RSD 值為0.1%，表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性試驗(yàn) 6 份供試品溶液的邪蒿素峰面積RSD 值為0.49%，布拉易林峰面積RSD 值為1.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn) 不同時(shí)間段進(jìn)樣測定供試品溶液邪蒿素峰面積RSD 值為0.24%，布拉易林峰面積RSD 值為0.19%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（5）加樣回收率試驗(yàn) 6 份混合供試品溶液的邪蒿素平均回收率為100.11%，RSD 值為1.18%，布拉易林平均回收率為99.46%，RSD 值為0.69%。

3.4.2 含量測定 采用外標(biāo)法并根據(jù)線性回歸方程，將峰面積換算成供試品中邪蒿素與布拉易林的含量。供試品與對照品液相色譜圖見圖6，供試品含量測定結(jié)果見表2。

圖6 供試品與對照品溶液高效液相色譜圖Fig.6 The high performance liquid chromatogram of test and reference solutions

表2 供試品含量測定結(jié)果（mg/g，±s，n = 3）Tab.2 Content determination results of test sample（mg/g，±s，n = 3）

表2 供試品含量測定結(jié)果（mg/g，±s，n = 3）Tab.2 Content determination results of test sample（mg/g，±s，n = 3）

批號(hào)邪蒿素布拉易林1-1 32.7 ± 0.424.3 ± 0.3 1-2 31.7 ± 0.527.1 ± 0.6 1-3 26.2 ± 0.521.6 ± 0.5 1-4 42.8 ± 0.326.5 ± 0.5 2-1 7.2 ± 0.225.3 ± 0.7 2-2 28.4 ± 0.428.5 ± 0.2 2-3 11.0 ± 0.126.8 ± 0.3 2-4 18.7 ± 0.326.2 ± 0.3 3-1 27.4 ± 0.630.2 ± 0.7 3-2 15.7 ± 0.316.2 ± 0.3 3-3 22.7 ± 0.343.6 ± 0.2 3-4 34.0 ± 0.232.5 ± 0.6 4-1 35.1 ± 0.225.2 ± 0.4 4-2 34.3 ± 0.335.4 ± 0.5 4-3 31.1 ± 0.352.5 ± 0.4 5-1 20.9 ± 0.260.1 ± 0.6 5-2 18.7 ± 0.344.1 ± 0.3 5-3 7.8 ± 0.249.0 ± 0.4 S1 28.4 ± 0.120.3 ± 0.1

4 討論

奶香木具有豐富的纖維紋、同心環(huán)紋及奶香氣等性狀特征。顯微鑒別特征為具緣紋孔導(dǎo)管，木射線組織寬1 ～ 4 列細(xì)胞，高4 ～ 33 個(gè)細(xì)胞，射線細(xì)胞異形，非疊生，木薄壁細(xì)胞長楔形或長方形，木薄壁細(xì)胞與射線細(xì)胞均具單紋孔且壁有連珠狀增厚現(xiàn)象，可見草酸鈣方晶與色素塊。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]發(fā)現(xiàn)香豆素類成分可作為奶香木薄層色譜的鑒別成分，經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)篩選出適宜的薄層色譜條件，該薄層方法簡便高效、分離度好，適用于奶香木的鑒別。

六個(gè)對照品均為文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道從假鵲腎樹樹皮中分離出的活性成分，其中，邪蒿素與布拉易林為奶香木薄層斑點(diǎn)的主要成分，因具有多種藥理活性，可作為奶香木的指標(biāo)成分并通過高效液相色譜進(jìn)行含量測定。紫外全波長掃描確定邪蒿素最大吸收波長為292 nm，布拉易林最大吸收波長為257 nm。液相色譜條件篩選過程中，以兩個(gè)指標(biāo)性成分的分離效果為指標(biāo)，分析檢測時(shí)間與色譜圖基線是否平穩(wěn)，考察了不同有機(jī)相（甲醇、乙腈）與水相（0.1%甲酸、0.1%磷酸-水溶液及超純水）對色譜峰的影響，最終選用甲醇與超純水作為流動(dòng)相體系，綜合考量指標(biāo)成分保留時(shí)間與各成分分離度后，篩選出適宜的流動(dòng)相配比與時(shí)間梯度。該色譜條件下，供試品指標(biāo)成分的保留時(shí)間與對照品吻合，分離度與穩(wěn)定性良好，同時(shí)方法學(xué)考察RSD 值均小于3%，說明該分析設(shè)備與檢測條件具備可行性，適用于奶香木指標(biāo)成分的含量測定。由測定結(jié)果可知，不同產(chǎn)地奶香木的邪蒿素含量為7 ～ 43 mg/g，布拉易林為15 ～ 60 mg/g，兩成分的平均含量較高。產(chǎn)地氣候條件與自然陳化過程是否對邪蒿素與布拉易林含量產(chǎn)生影響，尚待研究。

5 結(jié)論

本研究鑒定了奶香木的性狀與顯微組織特征，建立了薄層與液相色譜鑒別方法，分析發(fā)現(xiàn)奶香木含多種香豆素類活性成分，為奶香木進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。