膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎大鼠模型中TNF-α、IL-6、相關(guān)AMS 水平變化的研究

劉亞男，王哲，常鴻杰，胡立華

黑龍江省醫(yī)院香坊消化內(nèi)二科，黑龍江哈爾濱 150036

急性重癥胰腺炎是伴有全身及局部并發(fā)癥的機(jī)械胰腺炎，屬于急性胰腺炎的特殊類型，是一種病情險惡、并發(fā)癥多、病死率較高的急腹癥，占整個急性胰腺炎的10%～20%[1]。隨著近年來對重癥急性胰腺炎的病理機(jī)制認(rèn)知的逐漸加深，研究指出，重癥急性胰腺炎患者機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)炎性因子風(fēng)暴，其胰腺外組織器官和胰腺細(xì)胞內(nèi)的活動與免疫功能密切相關(guān)，炎性因子指標(biāo)變化可引發(fā)重癥急性胰腺炎炎性介質(zhì)變化、胰腺微循環(huán)改變，進(jìn)而促使病情加重，其主要的炎性介質(zhì)損傷因子包括腫瘤壞死因子-α、白介素6[2]。本研究納入黑龍江省醫(yī)院實驗中心2021 年1 月—2022 年7 月的成年大鼠（Wistar）50 只，分析膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎大鼠模型中相關(guān)AMS、IL-6、TNF-α 指標(biāo)變化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入本實驗中心成年大鼠（Wistar）50 只，其中雌性24 只，雄性26 只；體質(zhì)量239～280 g，平均（265.7±6.2）g，根據(jù)隨機(jī)雙盲法分組，分為膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組（n=26）、假手術(shù)組（n=24）。膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組雌性12 只，雄性14 只；體質(zhì)量239～280 g，平均（264.3±6.0）g。假手術(shù)組雌性12 只，雄性12 只；體質(zhì)量239～280 g，平均（265.6±6.3）g。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（倫理審批號：S2022-066-02）。

1.2 材料

美國Sigma 公司生產(chǎn)的牛黃膽酸鈉，美國Genzyine 公司生產(chǎn)的抗人單克隆抗體，TNF-α、IL-6 試劑盒，檢測TNF-α、IL-6最小值分別為40、12 ng/L；上海滬東儀器廠生產(chǎn)的微量輸液泵，天津南開大學(xué)電子儀器廠生產(chǎn)的LDF-III型激光多普勒血流計。

1.3 方法

全部研究對象操作前12 h 禁食，飲水自由，予以6 mg/kg 20%烏拉坦肌肉注射麻醉，后予以頸靜脈插管，另一側(cè)連接上海滬東儀器廠生產(chǎn)的微量輸液泵，膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組將5%牛黃膽酸鈉注射至胰管內(nèi)，用藥劑量為0.1 g/100 g 計算，用藥速度為0.2 mL/min，假手術(shù)組予以開腹，予以十二指腸、胰腺輕揉，兩組均監(jiān)測12 h。予以LDF-Ⅲ型激光多普勒血流儀在大鼠的體尾交界、胰頭處選擇相對固定、辨別度較高的部位，組織輕觸探頭即可，分析兩組實驗動物在開始0.5、1、1.5 、2、2.5、3 h 的胰腺血流量，基數(shù)為初始數(shù)據(jù)，計算各檢測值的百分?jǐn)?shù)；在操作前、操作后2、4、6、12 h 經(jīng)頸靜脈采集1 mL 血液，10 min 離心，速度為4 000 r/min，分離血清，置于-72°C 保存，予以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中TNF-α、IL-6 指標(biāo)變化；在操作前、操作后12 h 采集血清，監(jiān)測其脂肪酶、淀粉酶含量；操作后12 h 將大鼠處死，10%福爾馬林固定胰腺組織，包埋石蠟，蘇木染色，光鏡監(jiān)測下予以病理檢查，由病理科醫(yī)師評估其病理變化。

1.4 評定標(biāo)準(zhǔn)

胰腺病理學(xué)檢查評分：中性粒細(xì)胞浸潤（4 分）、壞死（3 分）、出血（2 分）、水腫（1 分）、正常（0 分）[3]。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察兩組實驗開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 的胰頭部微循環(huán)血流量、胰體尾部微循環(huán)血量、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、血清淀粉酶、血清脂肪酶、胰腺病理學(xué)檢查評分。

1.6 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠胰頭部微循環(huán)血流量比較

膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組實驗動物在開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 的胰頭部微循環(huán)血流量低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠胰頭部微循環(huán)血流量比較[(±s)，mL]

表1 兩組大鼠胰頭部微循環(huán)血流量比較[(±s)，mL]

組別膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺組（n=26）假手術(shù)組（n=24）t 值P 值0.5 h 86.3±3.5 106.4±7.5 12.299＜0.001 1 h 81.3±3.4 109.7±5.6 21.869＜0.001 1.5 h 76.4±2.8 116.2±5.2 34.061＜0.001 2 h 61.3±2.4 109.7±4.6 47.170＜0.001 2.5 h 56.4±2.1 106.2±3.2 65.549＜0.001 3 h 39.3±1.7 100.7±2.6 99.583＜0.001

2.2 兩組大鼠胰體尾部微循環(huán)血流量比較

膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組實驗動物在開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 的胰體尾部微循環(huán)血流量低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組大鼠胰體尾部微循環(huán)血流量比較[(±s)，mL]

表2 兩組大鼠胰體尾部微循環(huán)血流量比較[(±s)，mL]

組別膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺組（n=26）假手術(shù)組（n=24）t 值P 值0.5 h 66.3±3.6 106.3±7.3 24.870＜0.001 1 h 62.3±3.3 102.7±5.6 31.370＜0.001 1.5 h 59.4±2.7 100.2±5.1 35.744＜0.001 2 h 53.3±2.2 102.7±4.5 49.915＜0.001 2.5 h 50.4±2.0 106.2±3.1 76.224＜0.001 3 h 30.3±1.8 97.7±2.5 110.037＜0.001

2.3 兩組大鼠實驗前后的腫瘤壞死因子-α 指標(biāo)比較

膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組大鼠在術(shù)后2、4、6、12 h腫瘤壞死因子-α 指標(biāo)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組大鼠實驗前后的腫瘤壞死因子-α 指標(biāo)比較[(±s)，pg/mL]

表3 兩組大鼠實驗前后的腫瘤壞死因子-α 指標(biāo)比較[(±s)，pg/mL]

組別膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺組（n=26）假手術(shù)組（n=24）t 值P 值術(shù)前60.3±7.6 59.2±7.3 0.521 0.605術(shù)后2 h 209.3±20.3 114.7±15.6 18.362＜0.001術(shù)后4 h 278.4±19.7 116.2±15.1 32.472＜0.001術(shù)后6 h 306.3±18.2 122.7±15.5 38.243＜0.001術(shù)后12 h 281.5±17.4 116.4±12.6 38.148＜0.001

2.4 兩組大鼠實驗前后的白介素-6 指標(biāo)比較

膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組大鼠在術(shù)后2、4、6、12 h的白介素-6 指標(biāo)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組大鼠實驗前后的白介素-6 指標(biāo)比較[(±s)，pg/mL]

表4 兩組大鼠實驗前后的白介素-6 指標(biāo)比較[(±s)，pg/mL]

組別膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺組（n=26）假手術(shù)組（n=24）t 值P 值術(shù)前96.3±7.6 96.2±7.3 0.047 0.962術(shù)后2 h 273.3±60.3 104.7±32.6 12.150＜0.001術(shù)后4 h 459.4±89.7 116.2±35.1 17.535＜0.001術(shù)后6 h 403.3±70.2 162.7±45.5 14.248＜0.001術(shù)后12 h 361.5±30.4 98.4±22.6 34.494＜0.001

2.5 兩組大鼠實驗前后的血清脂肪酶、血清淀粉酶指標(biāo)比較

與實驗前相比，實驗后兩組的脂肪酶、血清淀粉酶均增高，且膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 兩組大鼠實驗前后的血清脂肪酶、血清淀粉酶指標(biāo)比較[(±s)，U/L]

表5 兩組大鼠實驗前后的血清脂肪酶、血清淀粉酶指標(biāo)比較[(±s)，U/L]

組別膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺組（n=26）假手術(shù)組（n=24）t 值P 值血清脂肪酶實驗前30.7±2.4 29.8±2.1 1.406 0.166實驗后12 h 3 023.2±780.2 86.6±27.2 18.414＜0.001血清淀粉酶實驗前82.7±8.6 83.7±8.7 0.408 0.685實驗后12 h 1 740.7±55.6 148.7±37.1 118.052＜0.001

2.6 兩組大鼠胰腺病理組織學(xué)評分比較

膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組胰腺病理學(xué)中性粒細(xì)胞浸潤、壞死、出血、水腫評分高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 兩組大鼠胰腺病理組織學(xué)評分比較[(±s)，分]

表6 兩組大鼠胰腺病理組織學(xué)評分比較[(±s)，分]

組別膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺組（n=26）假手術(shù)組（n=24）t 值P 值中性粒細(xì)胞浸潤3.2±0.7 1.6±0.3 8.289＜0.001壞死2.7±0.2 1.3±0.7 5.690＜0.001出血1.2±0.3 0.9±0.2 4.124＜0.001水腫0.7±0.3 0.3±0.1 6.217＜0.001

假手術(shù)組胰腺病理示：腺泡、間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤，少量散在出血壞死灶，見圖1；膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎胰腺病理示：鏡下可見胰腺組織高度充血水腫，呈紫黑色、深紅色，胰腺組織結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，大片出血壞死灶，見圖2。

圖2 膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎胰腺病理

3 討論

近年隨著大量深入研究，人們對重癥急性胰腺炎的病理機(jī)制有了更全面、更深入的了解。重癥急性胰腺炎發(fā)病的中心環(huán)節(jié)包括激活異位胰蛋白酶原、WBC 依賴性炎性因子反應(yīng)變化、胰腺的微循環(huán)受限[4-6]。目前，有研究指出，重癥急性胰腺炎除了具有以上局部病變外，屬于一種侵襲胰腺遠(yuǎn)隔系統(tǒng)、臟腑組織、鄰近組織的全身性、急性、系統(tǒng)性炎性反應(yīng)病變[7-8]。重癥急性胰腺炎其臨床特征為腎功能、呼吸功能不同程度的高動力循環(huán)，引發(fā)各臟腑組織器官功能衰竭。重癥急性胰腺炎的最初的受損反應(yīng)為細(xì)胞分子網(wǎng)的炎性病變，機(jī)體啟動了各種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子，進(jìn)而引發(fā)炎性因子級聯(lián)反應(yīng)、全身性病變，引發(fā)炎性因子反應(yīng)風(fēng)暴，導(dǎo)致病情迅速進(jìn)展。而在重癥急性胰腺炎的病程中，腫瘤壞死因子-α、白介素-6 可在生物學(xué)效應(yīng)、調(diào)節(jié)受體、誘生等不同層面相互影響，在發(fā)揮作用時與其他炎性介質(zhì)形成級聯(lián)反應(yīng)，屬于立體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[9-10]。

白介素-6 屬于急性反應(yīng)期的關(guān)鍵性炎性介質(zhì)，屬于巨噬/單核細(xì)胞，可在腫瘤壞死因子-α、白介素1、內(nèi)毒素等各種細(xì)胞作用下生成。對重癥急性胰腺炎的病情進(jìn)展評估敏感指標(biāo)之一為白介素-6；白介素-6 可在各種靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，通過對炎性成熟細(xì)胞成分肝功能予以調(diào)節(jié)，進(jìn)而促使炎性因子進(jìn)展，促使炎性因子在炎性細(xì)胞的激化效應(yīng)下引發(fā)多臟衰[10-11]。白介素-6 的具體病理機(jī)制包括：①和腫瘤壞死因子-α 發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，可在微血管系統(tǒng)廣泛存在，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞的表型誘導(dǎo)為炎癥型，促使外源性凝血系統(tǒng)被激活，促進(jìn)組織因子的急驟增高表達(dá)，過度激化血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)組織受損、形成微循環(huán)血栓[12-13]；②促使中性粒細(xì)胞凋亡周期延長，確保中性粒細(xì)胞生成氧自由基；③生成抗體、促進(jìn)分化B 細(xì)胞、對白介素1 產(chǎn)生協(xié)同作用，對肝細(xì)胞的毒性、炎性因子反應(yīng)發(fā)達(dá)，促進(jìn)催化急性反應(yīng)肝細(xì)胞合成蛋白，引發(fā)細(xì)胞組織受損[14-15]。重癥急性胰腺炎的TNF-α 的作用機(jī)制為：①在重癥急性胰腺炎早期最早增高的炎性介質(zhì)為TNF-α，是導(dǎo)致白介素相關(guān)因子、自身表達(dá)基因，造成級聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子，可導(dǎo)致炎性介質(zhì)釋放具有失控性；②可促使膜磷脂酶A1 激活，導(dǎo)致代謝花生四烯酸失衡，出現(xiàn)血小板活化因子，促使微循環(huán)障礙嚴(yán)重受限；對血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行刺激，生成氧自由基、一氧化氮等介質(zhì)[16-17]；③對炎性因子細(xì)胞激活，促使粘附分子增高，在血管內(nèi)皮中粘附白細(xì)胞，促使血管的通透性增高；對組織纖溶酶原激活物進(jìn)行滅活，進(jìn)而對纖溶反應(yīng)進(jìn)行抑制，促使組織因子表達(dá)急驟增高，血栓調(diào)理素降低表達(dá)，對凝血系統(tǒng)激活，形成毛細(xì)血管微血栓。

本研究觀察膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎大鼠模型中相關(guān)淀粉酶中白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α 指標(biāo)變化，結(jié)果顯示：膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組實驗動物在開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 的胰頭部微循環(huán)血流量和假手術(shù)組相比較低（P＜0.05）；膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組實驗動物在開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h的胰體尾部微循環(huán)血流量和假手術(shù)組相比較低（P＜0.05）；說明膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎大鼠可出現(xiàn)胰頭、胰體尾部微循環(huán)血流下降，形成微循環(huán)血栓；膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組大鼠在術(shù)后2、4、6、12 h腫瘤壞死因子-α 指標(biāo)與假手術(shù)組相比較高（P＜0.05）；膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組大鼠在術(shù)后2、4、6、12 h 中白介素-6 指標(biāo)與假手術(shù)組較高（P＜0.05）；說明膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎大鼠的炎性因子IL-6、TNF-α 急驟增高，引發(fā)機(jī)體的級聯(lián)炎性反應(yīng)；膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組實驗后的血清脂肪酶、血清淀粉酶指標(biāo)分別為（3 023.2±780.2）、（1 740.7±55.6）U/L與假手術(shù)組（86.6±27.2）、（148.7±37.1）U/L 相比較高（P＜0.05），與張順等[18]的研究結(jié)果大體一致，張順等研究中急性重癥胰腺炎大鼠的SAP 組實驗前血清淀粉酶（81.5±9.6）、血清脂肪酶（29.5±2.6）U/L；而實驗12 h 后SAP 組的血清淀粉酶為（1 739.2±57.9）、血清脂肪酶為（3 041.9±779.2）U/L（P＜0.05）。本研究說明膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎的血清脂肪酶、淀粉酶大幅度增高；膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎組與假手術(shù)組相比，胰腺病理學(xué)中性粒細(xì)胞浸潤、壞死、出血、水腫評分較高（P＜0.05），說明膽鹽誘導(dǎo)急性胰腺炎病理學(xué)中性粒細(xì)胞浸潤、壞死、出血、水腫等變化。

綜上所述，急性重癥胰腺炎患者胰腺區(qū)域血流量大幅度降低，產(chǎn)生微循環(huán)障礙，加重病情的炎性因子指標(biāo)為腫瘤壞死因子-α、白介素-6 指標(biāo)。