藤梨根乙醇提取物通過AKT/PUMA通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

王曉戎,黃禹舒,陳仁杰,陳欣德,張?zhí)锔?NISHIMWE Ange,程峰,吳志浩

(1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)系,安徽 蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院腫瘤微環(huán)境研究室,安徽 蕪湖 241002)

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1],已成為癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[2]。盡管手術(shù)切除仍然是唯一能夠治愈結(jié)直腸癌的方法,但輔助治療在預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用[3]。近年來,中醫(yī)藥在結(jié)直腸癌的臨床治療中起到重要作用,逐漸成為癌癥綜合治療中不可分割的環(huán)節(jié)[4]。

1 材料與方法

1.1 藥物

將購自亳州市京皖中藥飲片廠的藤梨根(產(chǎn)地:四川樂山)2 kg陰干,采用超速破碎儀粉碎,然后用400目濾網(wǎng)過篩備用。取400 g藤梨根粉末加入1 600 mL 95%乙醇,加熱、回流、過濾,重復(fù)操作2次。將2次得到的澄清液合并,懸蒸至膏狀,去離子水50 mL溶解后真空低溫干燥4 d,得23.18 g固體粉末(藤梨根生藥含量>99%)。取20 mg加入1 mL二甲基亞砜(DMSO)溶解成20 mg·mL-1的儲存液以備用。

1.2 細(xì)胞株、主要試劑和儀器

結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-15、LoVo(中科院細(xì)胞庫),Hoechst-33258凋亡試劑(Beyotime,C0003),Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD,556547),Cell Stain染色液(Beyotime,20294),PUMA siRNA(通用生物公司,RX053889),GSK-3β抑制劑1(MEC,HY-126144),AKT cDNA(Addgene,#78778),AKT抗體(CST,#9272)、p-AKT抗體(CST,#4060)、GSK-3β抗體(CST,#9325)、p-GSK-3β抗體(CST,#9323)、Caspase-3抗體(CST,#9662)、PUMA抗體(CST,#4976)、p65抗體(CST,#8242)、PARP抗體(CST,#9532)、β-actin抗體(CST,#3700),PUMA啟動子(Addgene,#16591)、NF-κB啟動子(Addgene,#61293)。

垂直電泳儀(BioRad,043BR61501),凝膠成像儀(GE,AI600),酶標(biāo)儀(BioTek, GluMAX96),硝酸纖維素膜(GE Healthcare,66485),微孔板發(fā)光檢測儀(Promega, E6521)。

1.3 方法

1.3.1 MTT實驗 將HCT-15、LoVo細(xì)胞鋪48孔培養(yǎng)板中,分為DMSO溶媒對照組、加藥組(10、20、30、40、50 μg·mL-1)。各加藥組用TLG處理24、36、48 h。加入0.5 g·L-1的MTT溶液處理4 h,后每孔用300 μL DMSO溶解,搖15 min,用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度。

1.3.2 細(xì)胞平板克隆實驗 每孔吸取500～600個HCT-15、LoVo細(xì)胞均勻鋪到6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,饑餓過夜,分為DMSO溶媒對照組、藥物低濃度組(12.5 μg·mL-1)、藥物中濃度組(25 μg·mL-1)、藥物高濃度組(50 μg·mL-1)。TLG處理培養(yǎng)4 h,培養(yǎng)1周,隔日換液,結(jié)束后采用甲醇固定細(xì)胞,PBS洗3次,5%Cell Stain染色后拍照。利用Image Pro7.6對圖片染色程度量化分析。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù) 將HCT-15、LoVo細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板中,分為空白對照組、單染FITC對照組、單染PI對照組、DMSO溶媒對照組、加藥組(25、50 μg·mL-1)。TLG處理4 h,0.25%胰酶(不含EDTA)消化6 min,2 000 r·min-1離心4 min,預(yù)冷PBS重懸清洗細(xì)胞,再次1 500 r·min-1離心3 min后去上清液。加入500 μL Binding buffer,混勻后依次加入5 μL FITC及5 μL PI,室溫避光靜置30 min。用Flowjo7.6軟件分析。

1.3.4 Hoechst-33258染色法 將HCT-15細(xì)胞接種于6孔板中,分為DMSO溶媒對照組、加藥組(25、50 μg·mL-1),其中加藥組加藥處理4 h。PBS清洗2次,用甲醇固定15 min,再用PBS洗2次,Hoechst 33258染色液于弱光處染色30 min。置于酶標(biāo)儀下,觀察,拍照。利用Image J對圖片染色程度量化分析。

1.3.5 Western blot實驗 將HCT-15細(xì)胞均勻鋪于6孔板,分為DMSO溶媒對照組、加藥組(10、20、30、40、50 μg·mL-1)。TLG處理4 h,采用于100 ℃加熱5 min的1×Laemmli sample buffer,每孔加80 μL充分裂解后收集蛋白樣本到1.5 mL離心管中,金屬浴加熱8 min,再上樣,80 V電泳分離蛋白,將ACR膠上的蛋白泳道轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上;之后再用麗春紅顯色,封閉1 h,4 ℃孵一抗12 h,TBST清洗5 min,室溫孵二抗1 h,TBST清洗條帶5 min,曝光,保存條帶,Image J分析灰度值。重復(fù)以上實驗步驟,獨(dú)立實驗3次。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將HCT-15細(xì)胞均勻鋪在6孔板中,密度達(dá)60%左右時轉(zhuǎn)染NF-κB啟動子、PUMA啟動子。質(zhì)粒環(huán)中啟動子下游為編碼螢火蟲熒光素酶蛋白的序列,若啟動子被激活,則螢火蟲熒光素酶含量上升,然后向細(xì)胞裂解液中加入底物后,在Promega微孔板發(fā)光檢測儀檢測熒光值。為使各樣本間細(xì)胞含量具有可比性,需同時轉(zhuǎn)染編碼海腎熒光素酶的CMV超級啟動子,作為內(nèi)參。細(xì)胞分為DMSO溶媒對照組,加藥組(10、20、30、40、50 μg·mL-1)。TLG處理4 h,裂解細(xì)胞并收集于EP管中,取上清液上機(jī)檢測熒光值。重復(fù)以上實驗步驟,獨(dú)立實驗3次。

企業(yè)財務(wù)會計風(fēng)險管理工作的順利開展，必須有一個完善的、專業(yè)的風(fēng)險防范體系來作為基本保障。因為國內(nèi)對財務(wù)會計風(fēng)險管理方面的研究尚處于起步階段，不少專業(yè)人員樂觀認(rèn)為財務(wù)會計工作中不會有風(fēng)險產(chǎn)生，同時很多企業(yè)高層的會計風(fēng)險意識相對不足，不愿花費(fèi)較大經(jīng)理來構(gòu)建會計風(fēng)險防范體系。而有些企業(yè)盡管建立了自身的會計風(fēng)險防范管理體系，但該體系十分不完善，甚至對企業(yè)財務(wù)會計風(fēng)險防范管理工作毫無使用價值。除此之外，很多企業(yè)沒有立足自身實際來建立財務(wù)會計風(fēng)險相關(guān)管理制度，從而造成風(fēng)險防范管理體系無法正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

1.3.7 質(zhì)粒cDNA轉(zhuǎn)染和siRNA轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期HCT-15細(xì)胞,均勻鋪在6孔板中,密度達(dá)60%左右時,更換為不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基孵育30 min,轉(zhuǎn)染AKT cDNA,6～8 h后換液,培養(yǎng)36 h后,饑餓過夜。細(xì)胞分為DMSO溶媒對照組、加藥組(50 μg·mL-1TLG)、轉(zhuǎn)染加藥組(50 μg·mL-1TLG+AKT cDNA),處理4 h后收樣。PUMA siRNA的正義鏈序列為5′-GAGCGGCGGAGACAAGAAGAGUUdTdT-3′,反義鏈序列為5′-AACUCUUCUUGUCUCCGCCGCUCdTdT-3′。

1.3.8 GSK-3β抑制劑實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞均勻鋪在6孔板中,密度達(dá)80%左右時,饑餓過夜。細(xì)胞分為DMSO溶媒對照組、加藥組( 50 μg·mL-1TLG)、加藥同時加抑制劑組(50 μg·mL-1TLG+GSK-3β抑制劑)處理4 h后收樣。其中GSK-3β抑制劑的初始儲存液濃度為1 mmol·mL-1(4.50 mL DMSO+1 mg粉末配置),取2 μL加入每孔1 mL的細(xì)胞培養(yǎng)板中,終濃度為2 μmol·mL-1,處理細(xì)胞4 h。

2 結(jié)果

2.1 TLG對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果如圖1A所示,與溶媒對照組相比,各濃度處理組結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、LoVo隨藥物濃度增加及處理時間延長,細(xì)胞活力下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.000 1)。在圖1B中,與溶媒對照組相比,各濃度藥物處理組單細(xì)胞克隆集落數(shù)下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.001,P<0.000 1)。其中,TLG在HCT-15中的增殖抑制效果明顯優(yōu)于LoVo。

注:A.MTT實驗檢測不同濃度TLG分別處理HCT-15、LoVo細(xì)胞24、36、48 h的細(xì)胞活力情況;B.平板克隆實驗檢測不同濃度TLG處理HCT-15、LoVo細(xì)胞4 h,培養(yǎng)1周后細(xì)胞克隆集落數(shù)量;與溶媒對照組比較,圖1 TLG對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響Fig.1 The effect of TLG on the proliferation ability of colorectal cancer cells

2.2 TLG對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響

圖2A中利用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞流式術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平,結(jié)果顯示:TLG(25、50 μg·mL-1)作用于HCT-15、LoVo細(xì)胞4 h后,與溶媒對照組相比,藥物組隨濃度的增加,凋亡細(xì)胞數(shù)增多,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.001)。同濃度藥量處理下,HCT-15細(xì)胞的凋亡水平明顯高于LoVo細(xì)胞。圖2B選取HCT-15細(xì)胞進(jìn)行Hoechst-33258染色實驗,結(jié)果顯示:TLG(25、50 μg·mL-1)作用于HCT-15細(xì)胞4 h后,與溶媒對照相比,加藥組中細(xì)胞核固縮、白染的細(xì)胞數(shù)增多,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

注:A.Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞流式術(shù)檢測TLG對HCT-15、LoVo細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的情況;B.Hoechst-33258染色,觀察HCT-15細(xì)胞中核固縮、白染的細(xì)胞數(shù)量;與溶媒對照組比較,圖2 TLG對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 TLG promoted apoptosis of colorectal cancer cell line HCT-15

2.3 TLG對HCT-15細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

本研究發(fā)現(xiàn)TLG在HCT-15細(xì)胞系中的抑制效果更強(qiáng),因此,之后的實驗選擇HCT-15進(jìn)行進(jìn)一步研究。Western blot結(jié)果顯示,TLG(10、20、30、40、50 μg·mL-1)作用于HCT-15細(xì)胞4 h后,與溶媒對照組相比,Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-PARP/PARP蛋白表達(dá)水平均有明顯上升(P<0.01,P<0.001)(圖3)。

注:與溶媒對照組(0 μg·mL-1)比較,

2.4 TLG誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15細(xì)胞系凋亡可能與NF-κB/PUMA通路有關(guān)

與溶媒對照組相比,p65、PUMA的蛋白表達(dá)量上升(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖4A)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果如圖4B～C所示,與溶媒對照組相比,NF-κB、PUMA的啟動子活性上升(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。為進(jìn)一步確認(rèn)TLG是通過NF-κB/PUMA通路誘導(dǎo)凋亡,HCT-15轉(zhuǎn)染PUMA siRNA后,TLG對PUMA、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-PARP/PARP蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用受到了抑制(P<0.001)(圖4D),并且經(jīng)MTT細(xì)胞活力檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染PUMA siRNA后,TLG對HCT-15細(xì)胞的抑制作用有所降低(P<0.001,P<0.000 1)(圖4E)。

注:A.Western blot實驗檢測不同濃度TLG對HCT-15細(xì)胞中p65、PUMA蛋白表達(dá)水平調(diào)控的情況;B～C.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測不同濃度TLG對HCT-15細(xì)胞中NF-κB、PUMA啟動子的影響;D.Western blot實驗檢測HCT-15細(xì)胞在利用PUMA siRNA敲低PUMA蛋白表達(dá)后,對下游Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-PARP/PARP的表達(dá)影響;E.MTT實驗檢測HCT-15細(xì)胞在利用PUMA siRNA敲低PUMA蛋白表達(dá)后,TLG對HCT-15細(xì)胞的抑制效果改變情況。與溶媒對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1;與50 μg·mL-1 TLG組比較,圖4 TLG誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15細(xì)胞系凋亡與NF-κB/PUMA通路有關(guān)Fig.4 TLG induced apoptosis in human colorectal cancer cell line HCT-15 by NF-κB/PUMA pathway

2.5 TLG可能通過AKT/GSK-3β信號通路影響NF-κB/PUMA通路

為探究TLG是通過何種機(jī)制調(diào)控NF-κB/PUMA通路,本研究采用Western blot實驗檢測NF-κB/PUMA通路關(guān)聯(lián)蛋白,發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度升高,p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β水平降低(P<0.001)(圖5A)。為進(jìn)一步驗證這一發(fā)現(xiàn),本研究分別在加藥的同時轉(zhuǎn)染AKT cDNA或加入GSK-3β抑制劑作為恢復(fù)實驗組,利用雙熒光素酶報告基因檢測啟動子活性,與單加藥相比,恢復(fù)實驗組中NF-κB、PUMA的啟動子活性得以恢復(fù)(P<0.01,P<0.001)(圖5B～C);另外,利用Western blot實驗檢測下游蛋白表達(dá)水平,與單加藥相比,恢復(fù)實驗組中隨p-AKT/AKT及p-GSK-3β/GSK-3β水平上升后,下游蛋白p65、PUMA、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-PARP/PARP重新下降(P<0.01,P<0.001)(圖5D～E)。

注:A.Western blot實驗檢測不同濃度TLG對HCT-15細(xì)胞中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達(dá)水平調(diào)控的情況;B～C.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HCT-15細(xì)胞過表達(dá)AKT蛋白(GSK-3β抑制劑)同時TLG加藥處理對NF-κB、PUMA啟動子的影響;D～E.Western blot實驗檢測HCT-15細(xì)胞過表達(dá)AKT蛋白(GSK-3β抑制劑)同時TLG加藥處理對下游蛋白的表達(dá)影響;與溶媒對照組比較,**P<0.01,***P<0.001;與50 μg·mL-1 TLG組比較,圖5 TLG可能通過AKT/GSK-3β信號通路影響NF-κB/PUMA通路Fig.5 TLG may affect NF-κB/PUMA pathway by AKT/GSK-3β signaling pathway

2.6 GSK-3β抑制劑和AKT cDNA有效削弱TLG對HCT-15的抑制作用

至此,本研究在蛋白水平證明TLG能夠通過AKT/GSK-3β信號通路激活NF-κB/PUMA通路,因此猜想TLG可能通過AKT/GSK-3β/NF-κB/PUMA通路誘導(dǎo)HCT-15細(xì)胞凋亡。為驗證這一猜想,同樣在加藥的同時轉(zhuǎn)染AKT cDNA或加入GSK-3β抑制劑作為恢復(fù)實驗組,利用MTT檢測細(xì)胞活力。與單加藥組相比,恢復(fù)實驗組中細(xì)胞活力重新上升(P<0.001)(圖6A～B)。然后,以同樣的方式構(gòu)建恢復(fù)實驗組,再利用平板克隆實驗檢測細(xì)胞增殖能力,與單加藥組相比,恢復(fù)實驗組中增殖能力重新恢復(fù)(P<0.01,P<0.001)(圖6C)。另外,利用Hoechst-33258染色實驗檢測細(xì)胞凋亡水平,與單加藥組相比,恢復(fù)實驗組中凋亡水平重新下降(P<0.01,P<0.001)(圖6D)。

注:A～B.MTT實驗檢測HCT-15細(xì)胞在利用AKT cDNA過表達(dá)及GSK-3β抑制劑處理后,TLG對HCT-15細(xì)胞活力的抑制效果改變情況;C.平板克隆實驗檢測HCT-15細(xì)胞在利用AKT cDNA過表達(dá)及GSK-3β抑制劑處理后,TLG對HCT-15細(xì)胞克隆集落數(shù)量的抑制效果改變情況;D.Hoechst-33258染色實驗檢測HCT-15細(xì)胞在利用AKT cDNA過表達(dá)及GSK-3β抑制劑處理后,TLG對HCT-15細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效果改變情況;與溶媒對照組比較,**P<0.01,***P<0.001;與50 μg·mL-1 TLG組比較,##P<0.01,###P<0.001。圖6 GSK-3β抑制劑和AKT-cDNA能夠有效遏制TLG對HCT-15的殺傷效果Fig.6 Utilization of GSK-3β inhibitor and overexpression of AKT cDNA to effectivelysuppress the killing effect of TLG on HCT-15

3 討論

結(jié)直腸癌屬于中醫(yī)“腸蕈”“腸積”“下利”“積聚”等范疇,其發(fā)病原因為正氣不足、飲食內(nèi)傷、情志失調(diào)、外邪侵襲等導(dǎo)致氣滯、血瘀、痰濕、熱毒等互結(jié)于大腸,日久而成。前期調(diào)查研究顯示,大腸濕熱證、脾胃氣虛證、肝腎陰虛證、氣血兩虛證、瘀毒阻滯證等在大腸癌證候類型中發(fā)生頻率較高,為大腸癌的常見證候類型[14]。中藥藤梨根味甘可補(bǔ)虛,性寒可清熱,其清熱解毒、祛風(fēng)除濕、利尿止血等功效與結(jié)直腸癌濕、熱、毒、瘀、虛等病理相契合。

本文前期細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),TLG對于結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、LoVo均有抑制效果,其中對HCT-15更為明顯。之后,本實驗選取了HCT-15細(xì)胞系進(jìn)行機(jī)制探究實驗。通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)隨TLG濃度增高其凋亡標(biāo)志蛋白Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-PARP/PARP蛋白水平明顯上升。目前報道最經(jīng)典的細(xì)胞凋亡通路是p53/PUMA通路[15],PUMA是Bcl-2家族蛋白,它通過誘導(dǎo)線粒體外膜透化釋放大量凋亡因子介導(dǎo)凋亡,其中p53能夠直接結(jié)合PUMA啟動子來調(diào)控細(xì)胞凋亡,但多數(shù)癌細(xì)胞中p53基因是突變基因,HCT-15細(xì)胞即是典型的p53突變細(xì)胞株[16]。有文獻(xiàn)報道,在某些p53突變細(xì)胞株中,NF-κB可以繞開p53直接促進(jìn)PUMA表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。因此,本研究檢測了NF-κB、PUMA的蛋白水平及啟動子活力,發(fā)現(xiàn)TLG可以在轉(zhuǎn)錄水平上激活NF-κB/PUMA通路。另外,有研究報道AKT/GSK-3β通路可以直接調(diào)控NF-κB/PUMA通路[18]。本實驗首先利用Western blot實驗檢測了AKT/GSK-3β通路蛋白,發(fā)現(xiàn)TLG降低了p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β的表達(dá)。由于本實驗采用的p-AKT抗體為473號位上絲氨酸磷酸化的抗體,表示AKT的激活形式[19],而p-GSK-3β抗體為9號位上絲氨酸磷酸化的抗體,表示GSK-3β抑制形式[20]。因此可以得出TLG可能是通過抑制AKT的活性從而間接提高GSK-3β活性發(fā)揮下游調(diào)控機(jī)制的。之后采用AKT cDNA過表達(dá)以及加入GSK-3β抑制劑來構(gòu)建恢復(fù)實驗組,并利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blot實驗分別從轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平證實TLG可以通過抑制AKT的活性間接升高GSK-3β活性并發(fā)揮下游調(diào)控機(jī)制。

有研究表明β-谷甾醇能夠介導(dǎo)p53/NF-κB/BCRP信號軸,調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌對化療的反應(yīng),并發(fā)現(xiàn)其與奧沙利鉑的聯(lián)合應(yīng)用可能是改善結(jié)直腸癌的潛在方法[21]。另外蘆薈大黃素可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮治療結(jié)直腸癌的作用[22]。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺得知β-谷甾醇、蘆薈大黃素是藤梨根乙醇提取的復(fù)雜物質(zhì)成分[23]。因此本文對藤梨根乙醇提取物的深入研究可以為結(jié)直腸癌的臨床治療提供潛在方案。

綜上實驗結(jié)果表明,藤梨根乙醇提取物能夠顯著誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮有效抗腫瘤作用,其機(jī)制可能與AKT/PUMA信號通路有關(guān)。我國是藤梨根的主產(chǎn)區(qū),藥材價廉易得。接下來仍需深入對體內(nèi)實驗加以驗證,并初步設(shè)立開展相關(guān)臨床研究,希冀藤梨根能夠逐步成為一種高效抗癌候選藥物,使其發(fā)揮中醫(yī)藥防治惡性腫瘤的優(yōu)勢。