養(yǎng)陰活血方干預(yù)ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠DNA甲基化酶的研究

繆蓉,周李煜,白丹丹,楊云君,陳艷冉,姜林宏,袁冬平,龍軍,吉娟

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所,江蘇 南京 210042)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是脂質(zhì)沉積驅(qū)動的慢性炎癥性疾病,機(jī)體亢進(jìn)的免疫應(yīng)答與脂質(zhì)負(fù)載共同參與AS病變[1]。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族催化,將甲基添加到CpG位點5′位置的胞嘧啶碳上的表觀遺傳修飾過程[2]。異常的DNA甲基化通過參與炎癥形成、平滑肌增殖、脂代謝調(diào)控和血管損傷等過程在AS病程中發(fā)揮重要作用[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方可以對DNA甲基化進(jìn)行調(diào)控從而干預(yù)疾病的進(jìn)程,包括AS、腫瘤等[4-5]。中醫(yī)理論認(rèn)為,AS的病機(jī)是肝腎陰虛,痰濁瘀阻,瘀熱蘊毒損脈[6]。養(yǎng)陰活血方是江蘇省名老中醫(yī)唐蜀華教授依據(jù)多年治療AS的臨床經(jīng)驗,以補益肝腎陰血、活血清熱解毒并治為原則創(chuàng)立的復(fù)方。課題組前期在高脂飲食(High fat diet,HFD)聯(lián)合HSP65免疫和HFD聯(lián)合LPS注射誘導(dǎo)的2種ApoE-/-小鼠AS模型中發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰活血方對AS具有積極的治療作用[7],這些作用與其調(diào)節(jié)免疫和炎癥有密切關(guān)系。然而養(yǎng)陰活血方能否通過調(diào)節(jié)感染性炎癥條件下DNA甲基化的酶水平來減輕AS尚不清楚。本研究在構(gòu)建HFD聯(lián)合LPS注射形成AS疾病模型[8]的基礎(chǔ)上,研究養(yǎng)陰活血方對感染性炎癥誘發(fā)的ApoE-/-AS小鼠DNA甲基化酶水平的影響。

1 材料

1.1 動物

ApoE-/-小鼠(6～7周,18～22 g,雄性,SPF級),由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究所提供,許可證號:SCXK(蘇)2015-0001,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境。動物實驗由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)通過,倫理批號:201804A011。

1.2 藥物與試劑

養(yǎng)陰活血方由制何首烏20 g,酒黃精10 g,虎杖30 g,漏蘆30 g,姜黃10 g,紅花10 g組成(江陰天江藥業(yè)有限公司),批號:1511048、1512161、1510034、1506035、1507084、1512165。養(yǎng)陰單元由制何首烏、酒黃精組成,清熱單元由虎杖、漏蘆組成,活血單元由姜黃、紅花組成。按前期報道方法制備養(yǎng)陰活血方及各功效單元[7],藥物劑量(生藥量)為:全方,18 g·kg-1;養(yǎng)陰,5 g·kg-1;清熱,10 g·kg-1;活血,3.3 g·kg-1。辛伐他汀(河南天方藥業(yè)有限公司,批號:160409174)。高脂飼料(含1.25%膽固醇以及20%豬油,南京市青龍山實驗動物養(yǎng)殖場)。

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)生化試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所,批號:20210401、20210401、20210331、20210331);油紅O粉末(北京索萊寶科技有限公司,批號:20210426);5×All-In-One逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix-Low ROX試劑盒(上海愛必夢生物科技有限公司,批號:Q20C22A、1051855127001);Anti-Dnmt1抗體(英國Abcam公司,批號:GR193233-1);Dnmt3b(E4I4O)Rabbit mAb(Mouse Specific)、Dnmt3a (D23G1) Rabbit mAb(美國CST公司,批號:1、5);Goat anti-rabbit IgG(H+L)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:20000199);Mouse IL-2 ELISA檢測試劑盒(聯(lián)科生物,批號:A20220755)、Mouse IL-6 ELISA檢測試劑盒(聯(lián)科生物,批號:A20630415)、Mouse TGF-β1 ELISA檢測試劑盒(聯(lián)科生物,批號:A98130432)。

1.3 主要儀器

5417R高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);7500實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司);EPS300雙穩(wěn)定時電泳儀(上海天能公司);GelDoc XR+全自動凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);Heraeus Multifuge X1R離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司);Infinite M200PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司);JB-L6生物組織包埋機(jī)(武漢俊杰公司);KZ-Ⅱ高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司);Micro17R高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司);Pannoramic MIDI組織切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司);PowerPac HV電泳儀(美國Bio-Rad公司);RM2235病理切片機(jī)(上海徠卡公司);SynergyH1全功能微孔板檢測儀(美國Biotek公司);Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度逆轉(zhuǎn)錄PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

ApoE-/-小鼠分為對照組、模型組、辛伐他汀組、養(yǎng)陰活血方組、養(yǎng)陰組、清熱組及活血組,每組10只。正常組飼喂普通飼料,其余各組給予高脂飼料(含1.25%膽固醇,20%豬油)喂養(yǎng),持續(xù)20周。分別于第10、12、14、16、18周,對照組以外的各組動物腹腔注射10 μg LPS,對照組小鼠腹腔注射等體積無菌PBS。灌胃給藥與高脂飲食同期進(jìn)行,均采用臨床等效量給藥(辛伐他汀,3.3 mg·kg-1;養(yǎng)陰活血方,18 g·kg-1;養(yǎng)陰,5 g·kg-1;清熱,10 g·kg-1;活血,3.3 g·kg-1),每日灌胃給藥1次。

2.2 血脂檢測

TC、TG、LDL-C和HDL-C生化試劑盒檢測血脂,酶標(biāo)儀讀取OD值,再按公式計算得到血清中血脂含量。非高密度脂蛋白膽固醇(Non-HDL-C)的含量以TC扣除HDL-C計算得到。

2.3 qPCR檢測小鼠脾臟和主動脈Tets和Dnmts mRNA表達(dá)

低溫條件下稱取約50 mg組織(脾臟/主動脈),剪碎后放入EP管,每份組織中加入1 mL TRIzol提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄成模板DNA前,RNA通過微量紫外分光光度計將脾臟/主動脈RNA定量為10 μg·mL-1后,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA。qPCR操作及反應(yīng)條件按試劑盒說明書進(jìn)行,引物委托上海生工合成(見表1)。數(shù)據(jù)按2-ΔΔCt法(內(nèi)參β-actin)分析。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used in qPCR

2.4 Western blot檢測小鼠脾臟/主動脈蛋白表達(dá)

低溫條件下稱取約50 mg組織(脾臟/主動脈),剪碎后放入EP管,管內(nèi)加入2枚鋼珠。采用蛋白裂解液提取組織中Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b。通過BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度后,加入上樣緩沖液在100 ℃金屬浴中變性10 min。樣品以30 μg的上樣量進(jìn)行電泳(先60 V,30 min;后90 V,60 min)。再轉(zhuǎn)膜,封閉,加入兔抗鼠抗體Dnmt1(1∶1 000)、Dnmt3a(1∶1 000)、Dnmt3b(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000),4 ℃過夜,次日洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)搖床孵育2 h,洗膜后,全自動凝膠成像儀獲取條帶圖像,Image Lab 4.0.1軟件分析。

2.5 主動脈斑塊面積測定及冠脈病理分析

將主動脈從主動脈弓至左右髂總動脈分支分離,多余組織在解剖鏡下進(jìn)一步精密剖離,并在4%多聚甲醛中固定12 h。生理鹽水洗滌后滴加油紅O染色。Image J軟件測量主動脈斑塊面積,計算斑塊與血管總面積的比值。心臟取下后于4%多聚甲醛中固定,進(jìn)行HE冠脈染色。滴加中性樹膠,封片后制成玻片標(biāo)本,顯微鏡下拍攝(放大倍數(shù):×400,標(biāo)尺:50 μm)并分析病變程度。

2.6 ELISA法檢測小鼠血清細(xì)胞因子表達(dá)

眼眶后靜脈叢采血收集小鼠外周血,靜置2 h,室溫下3 000 r·min-1離心10 min獲取血清,-80 ℃超低溫冰箱分裝保存?zhèn)溆?。使用提供的IL-2、IL-6、TGF-β1 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測,ELISA酶標(biāo)板每孔血清上樣量為20 μL,實驗操作嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行,加入顯色劑后,使用酶標(biāo)儀讀取規(guī)定波長下的OD值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線以及說明書中的公式計算各細(xì)胞因子含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.995。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對ApoE-/-小鼠AS斑塊的影響

油紅O染色結(jié)果如圖1A所示。與對照組相比,模型組小鼠主動脈斑塊顯著增多,且主動脈弓處尤為明顯(P<0.01)。與模型組相比,給藥各組斑塊面積均有所減少,其中養(yǎng)陰活血方組與清熱組抑制斑塊面積的效果更佳(P<0.01)。冠脈HE染色顯示(圖1B),與對照組相比,模型組小鼠出現(xiàn)明顯管腔狹窄,管腔面積變小(P<0.05)。與模型組比較,辛伐他汀組、養(yǎng)陰活血方組及清熱組管腔狹窄情況和管腔面積有明顯改善(P<0.01)。以上結(jié)果表明,20周高脂飲食聯(lián)合5次LPS注射造成了ApoE-/-小鼠嚴(yán)重的AS病變,表現(xiàn)為主動脈斑塊增加與冠脈血管腔狹窄。養(yǎng)陰活血方及其功效單元對主動脈斑塊形成和冠脈壁管腔變窄均有抑制作用。

注:A.油紅O染色;B.HE染色;a.對照組;b.模型組;c.辛伐他汀組;d.養(yǎng)陰活血方組;e.養(yǎng)陰組;f.清熱組;g.活血組;與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,圖1 各組主動脈斑塊油紅O染色(n=3)和冠脈HE染色(n=5)Fig.1 Aortic plaque oil red O staining (n=3) and coronary artery HE staining(n=5)

3.2 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對ApoE-/-小鼠體質(zhì)量和血脂的影響

各組小鼠體質(zhì)量在20周內(nèi)整體穩(wěn)步上升。但在第12周,除對照組外,其他組體質(zhì)量有所下降,第14周又恢復(fù)正常水平(圖2A)。

注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,圖2 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對ApoE-/-小鼠體質(zhì)量及血脂水平的影響Fig.2 Effects of Yangyin Huoxue Prescription and its efficacy units on weight and serum lipid levels of ApoE-/- mice

實驗初期(第0周)各組小鼠血脂水平基本保持一致(圖2B)。在實驗中期(第10周,圖2C),與對照組相比,模型組小鼠TC、non-HDL-C、LDL-C水平顯著升高(P<0.01,P<0.001),而TG與HDL-C無變化。與模型組比較,各給藥組non-HDL-C水平均明顯升高(P<0.05)。在實驗?zāi)┢?第20周,圖2D),與對照組相比,模型組小鼠TC、TG、non-HDL-C和LDL-C水平顯著升高(P<0.05,P<0.01),HDL-C水平顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,養(yǎng)陰活血方組TG、LDL-C水平顯著降低(P<0.01),而HDL-C水平顯著升高(P<0.05),TC與non-HDL-C無變化;養(yǎng)陰組TC、non-HDL-C、LDL-C水平顯著降低(P<0.05,P<0.01),而HDL-C升高(P<0.05);清熱組TC(P<0.01)和TG(P<0.001)水平顯著降低;活血組LDL-C、non-HDL-C、TG水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)。以上結(jié)果表明,養(yǎng)陰活血方及其功效單元對高脂飲食聯(lián)合LPS刺激引起的AS ApoE-/-小鼠的血脂水平具有不同程度的調(diào)節(jié)作用,但對體質(zhì)量無影響。

3.3 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對ApoE-/-小鼠DNA甲基化相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果如圖3顯示,與對照組比較,模型組小鼠脾臟及主動脈Tets mRNA含量均沒有顯著變化。與模型組比較,各給藥組小鼠脾臟及主動脈Tets mRNA水平均沒有顯著變化。以上結(jié)果表明,高脂飲食聯(lián)合LPS刺激不影響Tets mRNA的表達(dá),養(yǎng)陰活血方及其功效單元對Tets mRNA的表達(dá)也無顯著影響。

注:與對照組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,圖3 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對ApoE-/-小鼠脾臟和主動脈Tets、Dnmts mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Yangyin Huoxue Prescription and its efficacy units on mRNA expression of Tets and Dnmts in spleen and aorta of ApoE-/-mice

與對照組比較,模型組小鼠脾臟Dnmt3b mRNA含量增加(P<0.05),主動脈Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA含量顯著增加(P<0.05,P<0.001)。與模型組比較,養(yǎng)陰活血方組降低主動脈Dnmt1(P<0.001)和Dnmt3b(P<0.05)的mRNA含量;養(yǎng)陰組降低脾臟和主動脈Dnmt3b mRNA表達(dá)量(P<0.05,P<0.001);清熱組降低主動脈Dnmt1和Dnmt3b mRNA含量(P<0.05);活血組對脾臟和主動脈Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA含量均無顯著影響。以上結(jié)果表明,高脂復(fù)合LPS形成的感染型AS小鼠脾臟Dnmt3b及主動脈Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表達(dá)均增加,而養(yǎng)陰活血方及其功效單元降低主動脈Dnmt1和Dnmt3b mRNA表達(dá)的作用比較突出。

3.4 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對ApoE-/-小鼠Dnmts相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠脾臟和主動脈Dnmt1(P<0.05)、Dnmt3a(P<0.05,P<0.01)、Dnmt3b(P<0.01)蛋白的表達(dá)增加(圖4)。與模型組比較,養(yǎng)陰活血方降低脾臟Dnmt1和Dnmt3a的表達(dá)(P<0.05),降低主動脈Dnmt1和Dnmt3b的表達(dá)(P<0.05);養(yǎng)陰組降低主動脈Dnmt3a的表達(dá)(P<0.05);清熱組降低脾臟Dnmt1的表達(dá)(P<0.05),降低主動脈Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)(P<0.05);活血組降低主動脈Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)(P<0.05)。以上結(jié)果表明,高脂復(fù)合LPS形成的感染型AS小鼠脾臟和主動脈Dnmts蛋白表達(dá)均異常升高,而養(yǎng)陰活血方及其功效單元可以不同程度地降低脾臟和主動脈Dnmts蛋白的表達(dá),其中,清熱組對主動脈Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表達(dá)的調(diào)控作用最為明顯。

注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,

3.5 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對ApoE-/-小鼠細(xì)胞因子的影響

ELISA結(jié)果顯示(圖5),與對照組比較,模型組小鼠血清IL-6和IL-2水平增加(P<0.05,P<0.01),TGF-β1水平明顯下降(P<0.05)。與模型組比較,養(yǎng)陰活血方組降低IL-6水平(P<0.05),升高IL-2、TGF-β1水平(P<0.05);養(yǎng)陰組升高TGF-β1水平(P<0.05);清熱組降低IL-6水平(P<0.05),增加TGF-β1水平(P<0.05);活血組降低IL-6水平(P<0.05),升高IL-2水平(P<0.05)。以上結(jié)果表明,高脂復(fù)合LPS形成的感染型AS小鼠血清中促炎因子IL-6和調(diào)節(jié)性因子IL-2水平升高,抑炎因子TGF-β1水平下降,而養(yǎng)陰活血方及其功效單元可以不同程度地降低促炎因子表達(dá)并提高抑炎因子表達(dá)。

注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,圖5 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對ApoE-/-小鼠細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effects of Yangyin Huoxue Prescription and its efficacy units on cytokines of ApoE-/- mice

4 討論

AS是一種復(fù)雜的慢性疾病,脂質(zhì)紊亂伴隨慢性炎癥是其主要特征,增加了AS發(fā)生的概率[9]。除高水平脂質(zhì)引起低強(qiáng)度全身性炎癥反應(yīng)外,細(xì)菌感染亦是AS形成的原因之一[10]。當(dāng)機(jī)體感染革蘭氏陰性菌時,其細(xì)胞壁外膜的構(gòu)成成分之一脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可以通過Toll樣受體(Toll-Like receptor,TLR)介導(dǎo)的信號誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化,促進(jìn)炎癥因子分泌,引起全身炎癥[11]。拮抗TLR4可以干擾LPS的促炎作用,從而延緩AS的發(fā)展[12]。本研究利用對ApoE-/-小鼠進(jìn)行高脂飼養(yǎng)并腹腔注射LPS的方法,模擬高脂伴隨感染的AS炎癥特征,并在此基礎(chǔ)上開展復(fù)方作用研究。

養(yǎng)陰活血方以制何首烏、黃精為君藥,滋陰,化濁降脂;以姜黃、紅花為臣藥,通利血脈,化瘀行氣;漏蘆與虎杖共為佐使,清熱解毒,活血化瘀。養(yǎng)陰活血方可分為3個功效單元,為養(yǎng)陰單元(制何首烏、酒黃精)、清熱單元(虎杖、漏蘆)、活血單元(紅花、姜黃),3個功效單元在AS治療中各有側(cè)重。脂質(zhì)代謝紊亂和慢性炎癥是AS形成的關(guān)鍵病機(jī)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)陰活血方在長期(第20周)使用時調(diào)控血脂的作用較短期(第10周)更為明顯。養(yǎng)陰組降低TC(P<0.05)和LDL-C(P<0.01)、增加HDL-C水平(P<0.05)的作用比較突出,清熱組降低TC、TG(P<0.01,P<0.001)作用也較為突出,活血組降低TG、LDL-C(P<0.05,P<0.01)的作用比較明顯,養(yǎng)陰活血方組的調(diào)脂作用主要表現(xiàn)在降低TG(P<0.01)和LDL-C(P<0.01)、增加HDL(P<0.05)。高血脂是促進(jìn)AS斑塊形成的重要因素[14]。因此,降低血脂對減少AS斑塊的形成是有利的。養(yǎng)陰活血方及其功效單元都能降低冠脈厚度,改善冠脈血管狹窄和面積并且減少主動脈斑塊面積,其中養(yǎng)陰活血方組及清熱組尤為明顯(P<0.01)?？梢?養(yǎng)陰活血方及其功效單元對AS斑塊形成的改善作用與其長期應(yīng)用有較好的調(diào)脂作用有密切關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn),AS斑塊中多種基因存在甲基化異常的現(xiàn)象,表明甲基化參與了AS疾病進(jìn)展[15]。甲基化通過與基因組中CpG二核苷酸胞嘧啶5′碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)而發(fā)生可逆DNA甲基化修飾,通常能使基因表達(dá)沉默[2]。DNA高甲基化通常會導(dǎo)致長期且穩(wěn)定的基因抑制,相反DNA低甲基化會促進(jìn)基因表達(dá)[16]。Tets和Dnmts是調(diào)控基因甲基化的關(guān)鍵酶。Tets家族(包括Tet1、Tet2、Tet3)介導(dǎo)DNA去甲基化,而Dnmts家族(包括Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b)介導(dǎo)DNA甲基化[15]。Tet2過表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)Beclin1依賴性的自噬來減緩ApoE-/-小鼠AS發(fā)展,而Tet2缺失則加速AS發(fā)展[17]。造血細(xì)胞Tet2可以通過抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)以及炎癥小體的激活來預(yù)防AS[18]。AS的炎癥狀態(tài)與DNA的高甲基化有關(guān)[19]。Dnmts介導(dǎo)的甲基化可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號引發(fā)炎癥,炎癥也可以改變DNA甲基化[20]。Dnmt1和Dnmt3a介導(dǎo)了AS過程中DNA的甲基化[21]。Dnmt1是細(xì)胞內(nèi)的主要Dnmts,負(fù)責(zé)維持甲基化水平。Dnmt1可以促進(jìn)ABCA1甲基化,從而影響巨噬細(xì)胞膽固醇外流和泡沫細(xì)胞的形成[22]。因此,DNA甲基化酶參與了AS斑塊部位細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。許多與AS發(fā)病相關(guān)的基因都受DNA甲基化的調(diào)節(jié)[16]。有研究表明,人頸AS斑塊中Dnmt1的表達(dá)減少,Dnmt3a檢測不到,Dnmt3b沒有改變,Tet1增加[23]。給予高脂飲食的ApoE-/-小鼠AS斑塊中Tet2表達(dá)水平下調(diào),而過表達(dá)Tet2有效逆轉(zhuǎn)AS病變[24]。在感染型炎癥性疾病發(fā)展過程中也存在DNA甲基化修飾的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)[25]在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥炎癥小鼠的肺組織中,Dnmt1上調(diào),而下調(diào)Dnmt1則可以抑制LPS對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷作用。本研究發(fā)現(xiàn),在高脂飲食聯(lián)合LPS刺激引起的AS ApoE-/-小鼠脾臟及主動脈中,Tets mRNA的表達(dá)未發(fā)生顯著變化,但是脾臟中Dnmt1 mRNA(P<0.05)和主動脈中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA(P<0.05,P<0.001)的表達(dá)增加,脾臟和主動脈中Dnmt1(P<0.05)、Dnmt3a(P<0.05,P<0.01)、Dnmt3b(P<0.01)蛋白的表達(dá)都增加。本實驗結(jié)果可以推測,高脂飲食聯(lián)合LPS注射造成ApoE-/-小鼠體內(nèi)呈現(xiàn)炎癥狀態(tài),進(jìn)而出現(xiàn)高DNA甲基化水平,促使AS迅速發(fā)展。干預(yù)基因的甲基化可以對AS的發(fā)展產(chǎn)生影響[26]。本研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)陰活血方及其功效單元對AS ApoE-/-小鼠脾臟及主動脈中Tets mRNA水平無顯著影響。然而,在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平對主動脈Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)具有不同程度的下調(diào)作用。養(yǎng)陰活血方可以減輕AS炎癥水平[9]。實驗結(jié)果表明,養(yǎng)陰活血方及清熱、活血單元降低促炎因子IL-6表達(dá)(P<0.05),而養(yǎng)陰活血方及養(yǎng)陰、清熱單元提高抑炎因子TGF-β1表達(dá)(P<0.05)。以上實驗結(jié)果提示養(yǎng)陰活血方及其功效單元可能下調(diào)了主動脈斑塊的甲基化水平,并進(jìn)一步減輕了炎癥水平,這可能是養(yǎng)陰活血方減少AS斑塊形成的內(nèi)在原因。

綜上所述,養(yǎng)陰活血方能夠顯著調(diào)節(jié)AS小鼠脂質(zhì)水平,下調(diào)DNA甲基化水平,有效減少炎癥因子的分泌,因而減少AS斑塊面積。養(yǎng)陰組調(diào)節(jié)AS的效果主要來源于對血脂和抗炎因子的調(diào)節(jié),清熱組和活血組調(diào)節(jié)AS的效果則體現(xiàn)在對血脂、甲基化酶Dnmts、促炎和抗炎因子的調(diào)節(jié)方面。本實驗發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰活血方中清熱組和活血組可以下調(diào)Dnmts的表達(dá),這可能與清熱單元中虎杖主要成分白藜蘆醇和活血單元中姜黃素的Dnmts抑制作用有密切關(guān)系[27-28]。養(yǎng)陰活血方全方對于AS的改善作用體現(xiàn)在將各功效單元的作用進(jìn)行整合,對血脂、甲基化水平和炎癥水平進(jìn)行綜合調(diào)節(jié),揭示了中藥復(fù)方在治療AS這類復(fù)雜疾病時的整體作用的優(yōu)勢,但其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的闡明。