基于超快速氣相電子鼻對(duì)不同產(chǎn)地枸杞子快速識(shí)別及氣味差異物質(zhì)研究

趙秋龍,江群艷,嚴(yán)輝,瞿城,郭盛,樊歡,包蓉蓉,何潤(rùn)天,康宏杰,段金廒

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室,江蘇 南京 210023;2.寧夏枸杞創(chuàng)新中心,寧夏 銀川 750002)

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實(shí),始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,氣微,味甜,具有滋補(bǔ)肝腎,益精明目的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明,枸杞子主要含多糖、生物堿、類胡蘿卜素、黃酮等化學(xué)成分[2],具有抗衰老[3]、抗高血壓[4]、抗腫瘤[5]、降血糖[6]、降血脂[7]及神經(jīng)保護(hù)[8]等藥理活性。目前枸杞子主要分布于甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、新疆和青海等地[9-10],但由于氣候、土壤不同,各地枸杞子的氣味可能存在一定差異。目前,陳棟杰等[11-12]已利用電子舌測(cè)定不同產(chǎn)地枸杞子的“味”以描述其性狀特征;雖有通過電子鼻對(duì)枸杞子的“氣”進(jìn)行研究的報(bào)道[13-15],但收集的樣品來源單一、樣本量少。本研究基于超快速氣相電子鼻對(duì)56批枸杞子樣品進(jìn)行分析,結(jié)合判別因子分析(Discriminant factor analysis,DFA)、卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Convolutional neural networks,CNN)、主成分分析(Principal component analysis,PCA)及偏最小二乘判別分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)比較五大產(chǎn)區(qū)枸杞子藥材的差異[16-17],為枸杞子藥材的質(zhì)量控制和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Heracles Neo型超快速氣相電子鼻(配備PAL RSI型全自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、MXT-5非極性毛細(xì)管柱、MXT-1701中極性毛細(xì)管柱,法國(guó)Alpha Mos公司);GA-380N型低噪音空氣泵(北京中興匯利科技發(fā)展有限公司);GH-380N型高純氫氣發(fā)生器(北京中興匯利科技發(fā)展有限公司);Mettler Toledo XS105型電子分析天平(瑞士Mettler公司);電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品(批號(hào):A0168401,每100 g混合物中含正構(gòu)烷烴0.02～53.27 g),購(gòu)自美國(guó)Restek公司。

1.2 枸杞子樣本采集

于甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、青海及新疆采集56批栽培枸杞子樣品(2018、2019年7～8月),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實(shí),具體信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地枸杞子信息表Table 1 Information of Lycium barbarum L. from distinct origins

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品制備

取大小形狀均勻的枸杞子,于55 ℃烘箱中通風(fēng)烘干,去除冷藏保存中產(chǎn)生的冷凝水。取出冷卻至室溫,粉碎過3號(hào)篩,密封備用。

2.2 單因素考察[18]

2.2.1 樣品用量 設(shè)置孵化溫度70 ℃,孵化時(shí)間20 min,進(jìn)樣量5 000 μL,考察同一樣品(編號(hào)S25)的不同用量(1、2、3、4、5 g)對(duì)氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結(jié)果顯示,隨著樣品用量增加,氣味峰的峰面積也逐漸增加,峰形良好,見圖1。當(dāng)樣品用量為4 g或5 g時(shí),峰面積增加不明顯,故選擇樣品用量為3 g。

圖1 不同樣品用量、進(jìn)樣量、孵化溫度及孵化時(shí)間對(duì)峰面積的影響Fig.1 The influence of distinct sample dosage, injection volumes, incubation temperatures and time on peak area

2.2.2 進(jìn)樣量 取枸杞子(編號(hào)S25)粉末3 g,精密稱定,設(shè)置孵化溫度70 ℃,孵化時(shí)間20 min。考察不同進(jìn)樣量(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL)對(duì)氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結(jié)果顯示,隨著進(jìn)樣量增加,氣味峰的峰面積均逐漸增大,且當(dāng)進(jìn)樣量在5 000 μL時(shí),峰形良好,見圖1,故選擇進(jìn)樣量為5 000 μL。

2.2.3 孵化溫度 取枸杞子(編號(hào)S25)粉末3 g,精密稱定,設(shè)置孵化時(shí)間20 min,進(jìn)樣量5 000 μL?？疾觳煌趸瘻囟?40、50、60、70、80 ℃)對(duì)氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結(jié)果顯示,隨著溫度升高,氣味峰的峰面積先增大后減小,當(dāng)溫度為70 ℃時(shí),峰面積最大,見圖1,故選擇孵化溫度為70 ℃。

2.2.4 孵化時(shí)間 取枸杞子(編號(hào)S25)粉末3 g,精密稱定,設(shè)置孵化時(shí)間20 min,孵化溫度70 ℃,進(jìn)樣量5 000 μL?？疾觳煌趸瘯r(shí)間(10、15、20、25、30 min)對(duì)氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結(jié)果顯示,孵化20 min后氣味峰峰面積無明顯增大,趨于飽和穩(wěn)定,見圖1,故選擇孵化時(shí)間為20 min。

2.3 檢測(cè)條件

色譜柱為低極性MXT-5(交聯(lián)5%聯(lián)苯/95%二甲基聚硅氧烷)、中極性MXT-1701(交聯(lián)14%氰丙基苯/86%二甲基聚硅氧烷)金屬毛細(xì)管柱,規(guī)格均為10 m×0.18 mm×0.4 μm;樣品瓶規(guī)格為20 mL;樣品用量為3 g,進(jìn)樣量為5 000 μL,孵化溫度為70 ℃,孵化時(shí)間為20 min;進(jìn)樣速度為125 μL·s-1;進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間為45 s;進(jìn)樣口溫度為200 ℃,捕集阱補(bǔ)集溫度為50 ℃;捕集阱分流速度為10 mL·min-1;捕集持續(xù)時(shí)間為50 s;捕集阱最終補(bǔ)集溫度為250 ℃;色譜柱初始溫度為50 ℃,程序升溫(以0.5 ℃·s-1升至80 ℃,以1 ℃·s-1升至100 ℃,以3 ℃·s-1升至250 ℃,保持20 s);采集時(shí)間為150 s;火焰離子化檢測(cè)器(FID)增益為12[19]。

2.4 樣品的進(jìn)樣分析

樣品在超快速氣相電子鼻Heracles上進(jìn)行測(cè)定分析,每份樣品平行測(cè)定2次,準(zhǔn)確吸取3 g枸杞子樣品于20 mL的電子鼻專用頂空瓶中,使用PTFE隔墊密封,將準(zhǔn)備好的樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器裝置上,采用頂空進(jìn)樣進(jìn)行分析。

2.5 方法學(xué)考察

取枸杞子(編號(hào)S25)粉末約3 g,共6份,精密稱定,按“2.3”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行分析,記錄峰面積,考察精密度和重復(fù)性;取枸杞子(編號(hào)S25)粉末約3 g,共6份,精密稱定,分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.3”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行分析,記錄峰面積,考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,樣品氣味峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.19%～6.27%之間,保留時(shí)間的RSD值在0.03%～0.13%之間,表明該方法精密度高,重復(fù)性好,室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 不同產(chǎn)地枸杞子氣味指紋圖譜研究

2.6.1 指紋圖譜的建立和分析[20]按照“2.3”項(xiàng)下的檢測(cè)條件,通過超快速氣相色譜電子鼻對(duì)56批枸杞子進(jìn)行檢測(cè)。以MXT-5色譜柱扣除空白后采集的信號(hào)為主,將所得圖譜信息導(dǎo)入OriginPro 2021軟件,獲得枸杞子的氣味指紋圖譜,見圖2;各產(chǎn)地特征指紋圖譜的比較,見圖3;13個(gè)特征峰相對(duì)峰面積熱圖,見圖4;不同產(chǎn)地氣味色譜平均峰面積,見表2。結(jié)果表明,枸杞子氣味指紋圖譜中共檢出13個(gè)共有峰,不同產(chǎn)地枸杞子氣味峰的數(shù)量沒有差異,而峰面積明顯不同。此外,60 s前所出的氣味峰較密集、峰面積大;60 s后所出的氣味峰較少、峰面積小。

圖2 56批枸杞子樣品的氣味指紋圖譜(S1～S56)Fig.2 Odor chromatogram fingerprints of 56 batches of Lycium barbarum L. (S1-S56)

注:P1～P13.色譜峰1～13;GS1～GS14.甘肅1～14;NM1～NM10.內(nèi)蒙古1～10;NX1～NX15.寧夏1～15;XJ1～XJ8.新疆1～8;QH1～QH9.青海1～9圖4 不同產(chǎn)地枸杞子氣味峰相對(duì)峰面積熱圖分析Fig.4 Heatmap analysis of odor chromatogram relative peak area of distinct origin-derived Lycium barbarum L.

表2 不同產(chǎn)地枸杞子13個(gè)特征氣味峰的平均峰面積Table 2 The average area of 13 characteristic odor chromatogram peaks from distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.2 枸杞子氣味定性分析研究 為明確不同產(chǎn)地枸杞子氣味特征成分組成,對(duì)比正構(gòu)烷烴nC6～nC16混合對(duì)照品的保留時(shí)間,將“2.5.1”項(xiàng)下所得枸杞子氣味指紋圖譜中13個(gè)共有峰保留時(shí)間(tR)轉(zhuǎn)換為Kovats保留指數(shù)(RI),并與AroChemBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)[21-22]鑒定出13個(gè)可能的共有化合物,具體見表3及圖5。結(jié)果顯示,峰面積最大的2號(hào)峰可能為丙烯醛,峰面積最小的9號(hào)峰可能為糠醛。圖5氣味輪顯示,13個(gè)化合物主要分為6個(gè)主觀感知類別,被感知為“辛辣的”的化合物個(gè)數(shù)最多。

圖5 不同產(chǎn)地枸杞子氣味特征成分(中圈)、主觀感知類別(內(nèi)圈)及相關(guān)氣味描述(外圈)的氣味輪Fig.5 Flavor wheel of 13 main odor characteristiccomponents(middle circle), subjective perception category(inner circle)and related odor description(outer circle)in distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.3 不同產(chǎn)地枸杞子的快速鑒別分析

2.6.3.1 DFA判別模型的建立 為分析不同產(chǎn)地枸杞子的氣味差異,實(shí)現(xiàn)對(duì)其快速鑒別,本實(shí)驗(yàn)使用Alpha Soft 17.0軟件對(duì)不同產(chǎn)地枸杞子的氣味色譜圖進(jìn)行DFA[23],具體見圖6。結(jié)果顯示,DFA二維模型中,橫縱坐標(biāo)兩判別因子的累積區(qū)分指數(shù)為81.903%(DF1:66.338%;DF2:15.565%);DFA三維模型中,三判別因子的累積區(qū)分指數(shù)為94.198%(DF1:66.338%;DF2:15.565%;DF3:12.295%),表明該判別模型能充分代表所有樣品的氣味信息。

注:GS.甘肅;NM.內(nèi)蒙古;NX.寧夏;XJ.新疆;QH.青海圖6 不同產(chǎn)地枸杞子的超快速氣相電子鼻信號(hào)DFA分析Fig.6 The DFA analysis of distinct origin-derived Lycium barbarum L. based on ultra-fast gas phase electronic nose

甘肅產(chǎn)枸杞子與其他四產(chǎn)區(qū)藥材在DF1上有明顯差異,寧夏產(chǎn)枸杞子與內(nèi)蒙古產(chǎn)枸杞子在DF2上有明顯差異,青海產(chǎn)枸杞子與新疆產(chǎn)枸杞子在DF1與DF2上均有差異。從二維和三維模型上,56批枸杞子樣品均能得到分離,所有樣品按產(chǎn)區(qū)分為5類,說明超快速氣相電子鼻可快速鑒別不同產(chǎn)地枸杞子。

2.6.3.2 CNN判別模型的建立 利用枸杞子13個(gè)氣味峰數(shù)據(jù)構(gòu)建CNN模型[24],隨機(jī)分為訓(xùn)練集和測(cè)試集,訓(xùn)練集共有45(×2)批樣品,測(cè)試集共10(×2)批樣品。將13個(gè)氣味峰峰面積數(shù)據(jù)作為輸入層。卷積層中,一維卷積層為尺寸2×1,數(shù)目32,二維卷積層尺寸2×32,數(shù)目64。輸出卷積層結(jié)果時(shí),通過ELU激活函數(shù)對(duì)卷積結(jié)果進(jìn)行非線性映射。池化層選擇平均池化法,池化窗口為2×2。訓(xùn)練模型時(shí),采用交叉熵函數(shù)來反應(yīng)誤差。最終,獲得基于超快速氣相電子鼻的CNN判別模型,模型訓(xùn)練的學(xué)習(xí)率為初始值0.000 1,以1/e為衰減指數(shù),隨訓(xùn)練次數(shù)增加逐步衰減。模型的訓(xùn)練集平均準(zhǔn)確率為100%,測(cè)試集平均準(zhǔn)確率為80.5%,其中前兩輪測(cè)試集準(zhǔn)確率高達(dá)95.2%,說明該模型對(duì)不同產(chǎn)地的枸杞子可進(jìn)行產(chǎn)地判別,具體見表4。

表4 不同產(chǎn)地枸杞子的超快速氣相電子鼻信號(hào)CNN分析Table 4 The CNN analysis of distinct origin-derived Lycium barbarum L. based on ultra-fast gas phase electronic nose

2.6.4 不同產(chǎn)地枸杞子的主要?dú)馕恫町愇镔|(zhì)分析

2.6.4.1 不同產(chǎn)地枸杞子的主要?dú)馕冻煞植町惓醪椒治?為分析不同產(chǎn)地枸杞子的氣味差異成分,先利用SPSS軟件對(duì)枸杞子13個(gè)氣味峰的峰面積進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),將符合正態(tài)分布的氣味峰進(jìn)行單因素方差分析,不符合正態(tài)分布的氣味峰進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(K-W檢驗(yàn)),具體見圖7。結(jié)果顯示,五大產(chǎn)區(qū)枸杞子主要在8(己醛)、9(糠醛)、10(二甘醇單乙醚)、11(硝基苯)及12(正庚基丙烯酸酯)號(hào)氣味峰上有明顯差異。

注:GS.甘肅;NM.內(nèi)蒙古;NX.寧夏;XJ.新疆;QH.青海;各組間比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。圖7 不同產(chǎn)地枸杞子13個(gè)氣味峰峰面積的比較Fig.7 The odor chromatogram peak area comparison of distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.4.2 PCA結(jié)果 為進(jìn)一步鑒別不同產(chǎn)地枸杞子的氣味差異成分,將“2.5.4.1”項(xiàng)下所得5個(gè)差異成分己醛(8)、糠醛(9)、二甘醇單乙醚(10)、硝基苯(11)及正庚基丙烯酸酯(12)的峰面積作為變量,利用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA[25],具體見圖8。結(jié)果顯示,由PCA得分圖所得2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為97.30%(PC1 85.9%,PC2 11.4%),模型預(yù)測(cè)Q2值為0.616(>0.5),說明該模型能較好地反映樣品中的氣味信息[26]。5個(gè)不同產(chǎn)地枸杞子樣本在PCA圖上能區(qū)分開,有明顯差異。

圖8 不同產(chǎn)地枸杞子氣味成分的PCA分析Fig.8 The PCA analysis of odor components from distinct origin-derived Lycium barbarum L.

載荷圖上,己醛、糠醛、二甘醇單乙醚、硝基苯及正庚基丙烯酸酯這5個(gè)成分距原點(diǎn)均較遠(yuǎn),表明5個(gè)成分對(duì)區(qū)分不同產(chǎn)地枸杞子貢獻(xiàn)較大[27]。

2.6.4.3 PLS-DA結(jié)果 PCA是一種無監(jiān)督的分析方法,在確定差異成分時(shí),無法忽略組內(nèi)差異與隨機(jī)誤差。為進(jìn)一步探究不同產(chǎn)地枸杞子的氣味差異物質(zhì),采用有監(jiān)督的PLS-DA[28],具體見圖9。結(jié)果顯示,56批枸杞子被分為5類,不同產(chǎn)地的枸杞子之間有差異,與PCA分析結(jié)果互相驗(yàn)證。

注:GS.甘肅;NM.內(nèi)蒙古;NX.寧夏;XJ.新疆;QH.青海

此外,在變量重要性排序(Variable importance in projection,VIP)圖上,己醛(VIP=1.317)、糠醛(VIP=1.020)的VIP值均>1[29],表明己醛與糠醛是5個(gè)產(chǎn)地枸杞子的氣味差異物質(zhì)。由表2可知,枸杞子中,按己醛含量大小的產(chǎn)地排序?yàn)?內(nèi)蒙古>甘肅>寧夏>新疆>青海,內(nèi)蒙古產(chǎn)枸杞子中的己醛含量是青海產(chǎn)枸杞子中己醛的1.63～3.54倍,是新疆產(chǎn)枸杞子中己醛的1.47～2.49倍;按糠醛含量大小的產(chǎn)地排序?yàn)?甘肅>新疆>寧夏>青海>內(nèi)蒙古,甘肅產(chǎn)枸杞中的己醛含量是內(nèi)蒙古產(chǎn)枸杞子中己醛的1.17～2.37倍,是青海產(chǎn)枸杞子中己醛的1.15～2.01倍。

3 討論

本研究采用Heracles超快速氣相電子鼻技術(shù)從不同產(chǎn)地枸杞子中鑒定出氯乙烷、丙烯醛、叔丁醇等13種共有化合物,通過繪制“氣味輪”發(fā)現(xiàn),除正庚基丙烯酸酯外的12個(gè)化合物,是對(duì)枸杞子氣味起到關(guān)鍵作用的化合物。由VIP值圖可知,己醛(VIP=1.3)和糠醛(VIP=1.03)是不同產(chǎn)地枸杞子的主要差異化合物,可作為區(qū)分枸杞子產(chǎn)地的潛在差異氣味分子指標(biāo)。枸杞子中己醛含量高低的產(chǎn)地排序?yàn)?內(nèi)蒙古>甘肅>寧夏>新疆>青海;糠醛含量高低的產(chǎn)地排序?yàn)?甘肅>新疆>寧夏>青海>內(nèi)蒙古。建立DFA、CNN判別模型及PCA和OPLS-DA化學(xué)計(jì)量模型,DFA模型的判別因子累積區(qū)分指數(shù)為81.903%,CNN的測(cè)試平均準(zhǔn)確率為80.5%,PCA模型的累計(jì)貢獻(xiàn)率為97.30%,OPLS-DA模型的累計(jì)貢獻(xiàn)率為97.20%,說明以上模型均能區(qū)分不同產(chǎn)地枸杞子氣味,能夠?qū)﹁坭阶訕悠窔馕哆M(jìn)行快速鑒別分析。因此,本研究通過Heracles超快速氣相電子鼻技術(shù)[30],不僅確定枸杞子氣味貢獻(xiàn)程度較大的揮發(fā)性氣味化合物,還可以實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地枸杞子快速鑒別,為其質(zhì)量控制和產(chǎn)地溯源提供了科學(xué)依據(jù)[31-33]。