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    鮮食糯玉米己醛和己醇的生成與LOX活性及其基因表達(dá)的相關(guān)性

    2018-09-10 10:11:35牛麗影沈凌雁劉春菊李大婧劉春泉肖麗霞
    關(guān)鍵詞:己醛

    牛麗影 沈凌雁 劉春菊 李大婧 劉春泉 肖麗霞

    摘要:為探討生鮮糯玉米汁主要揮發(fā)性成分己醛與己醇的生成與脂氧合酶(LOX)的關(guān)系,對4個(gè)籽粒發(fā)育期的鮮食糯玉米京甜紫花糯2號和蘇玉糯11號生鮮玉米汁中己醛與己醇含量、脂氧合酶活性以及ZmLOX1、Zm-LOX2、ZmLOX3、ZmLOX10基因的相對表達(dá)量進(jìn)行了測定和比較。結(jié)果顯示己醛與己醇含量顯著正相關(guān)(P<0.05),4種LOX基因的表達(dá)量之間顯著正相關(guān)(P<0.05),但LOX活性與其他指標(biāo)之間未表現(xiàn)出顯著的相關(guān)關(guān)系。主成分分析( PCA)結(jié)果顯示所有指標(biāo)聚為3類:4種LOX基因表達(dá)量、己醛與己醇含量、LOX活性,三者之間未表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:鮮食糯玉米;己醛;脂氧合酶(LOX;基因表達(dá)量

    中圖分類號:S513.01

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A

    文章編號: 1000-4440(2018)05-1138-06

    糯玉米為起源中國的玉米類型,作為鮮食玉米廣受消費(fèi)者喜愛。鮮食糯玉米蒸煮后散發(fā)的玉米香與類似青葉、青草的清香是其重要特征之一。在鮮食糯玉米揮發(fā)性成分與香氣變化研究中發(fā)現(xiàn),來自脂氧合酶(LOX)途徑的己醛和己醇為生鮮玉米汁揮發(fā)性成分的主要成分,并可能與糯玉米的青香有關(guān)。LOX途徑為LOX啟動的具異戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的氧化過程,植物中多以亞油酸和亞麻酸為底物,在LOX作用下生成9-氫過氧化物(9-HPOT)和13-氫過氧化物(13-HPOT),然后由氫過氧化物裂解酶(HPL)作用生成的C6醛和C9醛,并在乙醇脫氫酶(ADH)的作用下生成相應(yīng)的醇。其中C6的醛、醇、酮以及衍生的酯類被稱為青葉揮發(fā)性成分(Green leaf volatile, GLV)。GLV在植物生理研究中被作為抗逆反應(yīng)的標(biāo)志性成分,在番茄、黃瓜或柑橘中為新鮮香氣的表征成分,在豆類、速凍玉米、水稻等谷物中則與油脂氧化味等不良風(fēng)味相關(guān)。

    從基因水平研究LOX途徑及風(fēng)味調(diào)控是近年來的趨勢。LOX是一個(gè)大基因家族,每種植物中都會有多個(gè)LOX同工酶,在番茄、蘋果等植物中只有某特定的LOX同工酶調(diào)控GLV的生成。目前已知玉米中有13種LOX,ZmLOX1基因存在于成熟籽粒中,具有9-LOX和13-LOX的非傳統(tǒng)型雙位點(diǎn)特異性;ZmLOX2基因在玉米生長發(fā)育過程中表達(dá).ZmLOX3存在于玉米植株的根部以及發(fā)育的胚中;ZmLOX10位于葉綠體中,主要調(diào)節(jié)GLV的生成。在對鮮食糯玉米LOX酶特性研究中發(fā)現(xiàn),鮮食糯玉米中至少存在2種LOX同工酶,并且生鮮糯玉米汁的GLV則主要為己醛與己醇。為了在基因表達(dá)水平上探討鮮食糯玉米中GLV生成和香氣變化機(jī)制,本研究對2個(gè)品種4個(gè)發(fā)育期的鮮食糯玉米中己醛和己醇含量、LOX酶活性以及Zm-LOX1、ZmLOX2、ZmLOX3、Zm LOX10的相對基因表達(dá)量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析,為鮮食糯玉米香氣的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    糯玉米京甜紫花糯2號(JT)、蘇玉糯11號(SY)均采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物科學(xué)基地試驗(yàn)田。2種糯玉米于授粉后14d、19d、25d、31d進(jìn)行采收,分別對應(yīng)于籽粒建成期、乳熟前期、乳熟后期和蠟熟期,記為JT1—4和SY1~4。采收當(dāng)日手工去除苞葉,分離完整玉米籽粒,液氮速凍后真空包裝,置于-80℃冰箱待用。

    1.2 主要儀器和試劑

    Agilent 7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司產(chǎn)品;CAR/PDMS/DVB固相微萃取萃取頭,美國supelco公司產(chǎn)品;HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱,美國Agilent公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀,美國Roche公司產(chǎn)品。Trizol試劑盒,美國Gibco公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 己醛、己醇含量的測定冷凍玉米粒10g加入40ml 4℃預(yù)冷的蒸餾水,迅速研磨,用5ml水轉(zhuǎn)移至均質(zhì)儀進(jìn)行均質(zhì)后定容到50ml,取5ml于15ml頂空瓶中并加入攪拌子及1.6g NaCl,密封后40℃水浴平衡15min,插入萃取頭(CAR/PDMS/DVB),使之與液面保持1.5cm的距離,加入攪拌子置于磁力攪拌器上,攪拌速度200 r/min,在40℃下萃取15min。色譜條件:色譜柱為HP-INNOWAX(30mx0.32mmx0.25μm)分析柱;升溫程序?yàn)椋浩鸪鯗囟?0℃保持2 min,然后5μ/min升溫至220cC,進(jìn)樣口溫度250℃,解析2min,采用不分流進(jìn)樣;載氣:He。質(zhì)譜條件:離子源溫度230℃,傳輸線溫度為150℃,電離化方式為EI、電子能量70eV,質(zhì)量掃描范圍m/z 30~ 450,掃描速率為5.27scan/s,溶劑延遲l min。定量方法采用外標(biāo)法,首先用色譜純甲醇配置1mg/ml的貯備液,再稀釋為0.2~200.0 mg/L的測定液,建立待測組分標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與對應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.2 LOX活性的測定同牛麗影等的方法 。

    1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定LOX基因表達(dá)量使用Trizol試劑盒提取樣品總RNA,用隨機(jī)引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDN。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為25℃10 min,42℃30 min.85℃5 min。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,采用SYBR GREEN染料法,以GA PDH為內(nèi)參基因,測定LOX基因表達(dá)量,以乳熟期甜玉米晶甜3號為對照。引物序列見表l。PCR反應(yīng)條件為:94℃30s;94℃10s,60℃12s,72℃30s,循環(huán)45次,72℃單點(diǎn)檢測信號。采用2-??法對結(jié)果進(jìn)行相對定量分析。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用JMP(JMP 10.0,SAS Institute Inc.)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和主成分分析(PCA)。各指標(biāo)重復(fù)測定3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析(ANOVA) Tukey HSD進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同采收期兩種鮮食糯玉米中己醛和己醇含量比較

    4個(gè)采收期兩種鮮食糯玉米京甜紫花糯2號(JT)和蘇玉糯11號(SY)中己醛含量為6.00~59.90μg/kg,己醇含量為0.11~8.29μg/kg。兩種糯玉米的己醛均在籽粒建成期含量最高,在乳熟期含量最低,到蠟熟期略有回升,但蠟熟期蘇玉糯11號的己醛含量與乳熟前期和乳熟后期京甜紫花糯2號差異未達(dá)顯著水平(圖1)。JT的己醇含量隨籽粒發(fā)育期的延長而呈降低趨勢,而SY的己醇含量變化不顯著。

    2.2 兩種鮮食糯玉米脂氧合酶(LOX)活性比較

    LOX活性測定結(jié)果(圖2)顯示,兩種糯玉米京甜紫花糯2號(JT)和蘇玉糯11號(SY) LOX活性均隨籽粒發(fā)育期延長呈現(xiàn)直線上升趨勢(R2=0.980 6、R2= 0.9978),在4個(gè)發(fā)育期兩種玉米的LOX活性并未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

    2.3 兩種鮮食糯玉米ZmLOX1、Zm LOX2、Zm-LOX3、ZmLOX10基因表達(dá)量差異

    京甜紫花糯2號的4種LOX基因表達(dá)量在發(fā)育過程中變化趨勢一致,均為籽粒建成期≤乳熟后期≤乳熟前期<蠟熟期(圖3)。蘇玉糯11號的變化趨勢與京甜紫花糯2號不同,京甜紫花糯2號的4種LOX基因表達(dá)量均為蠟熟期最高,而蘇玉糯11號中ZmLOX3在乳熟后期表達(dá)量最高。另外,蘇玉糯11號ZmLOX1、ZmLOX2、ZmLOX10的表達(dá)量在4個(gè)時(shí)期均等于甚至低于京甜紫花糯2號籽粒建成期的最低值。2種玉米差異較大的為乳熟前期和蠟熟期,乳熟前期京甜紫花糯2號的ZmLOX2和Zm-LOX3基因表達(dá)量分別為蘇玉糯11號的117.25和4.92倍,蠟熟期京甜紫花糯2號的ZmLOX3基因表達(dá)量為蘇玉糯11號的5.54倍。另外,與GLV相關(guān)的ZmLOX10基因表達(dá)量京甜紫花糯2號大于蘇玉糯11號,對應(yīng)4個(gè)發(fā)育期京甜紫花糯2號的基因表達(dá)量分別為蘇玉糯11號的2.56、92.96、10.52和45.15倍。

    2.4玉米己醇和己醛含量與LOX活性、LOX基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

    己醛和己醇是生鮮玉米汁中最主要的揮發(fā)性成分。通過調(diào)節(jié)pH以及加熱等方法抑制LOX的活性可以減少二者的生成,說明LOX途徑是二者生成的主要途徑。相關(guān)性分析結(jié)果(表2)顯示,己醛含量與己醇含量之間以及4種LOX基因表達(dá)量之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。己醇含量與己醛含量呈顯著正相關(guān),說明生成的己醛越多,才能生成更多的己醇,但是二者的量與LOX活性、LOX基因表達(dá)量的相關(guān)性不顯著。

    主成分分析(PCA)結(jié)果(圖4)表明,主成分l與主成分2可解釋總方差的87. 0%。從圖4中可以看出己醛與己醇含量、4種ZmLOX基因分別在第1象限和第2象限聚集。而樣品與指標(biāo)在空間上的接近則表明此樣品在此指標(biāo)上具有突出的特征,例如籽粒建成期的京甜紫花糯2號己醛與己醇含量最高,蠟熟期的京甜紫花糯2號ZmLOX基因表達(dá)量最高。

    3 討論

    不同植物的LOX代謝機(jī)制存在差別。本研究中京甜紫花糯2號和蘇玉糯11號2種糯玉米之間也存在顯著差異,例如在乳熟后期京甜紫花糯2號ZmLOX1、ZmLOX2、ZmLOX10基因表達(dá)量均高于蘇玉糯11號,在籽粒建成期和蠟熟期京甜紫花糯2號的己醛和己醇含量也高于蘇玉糯11號。京甜紫花糯2號和蘇玉糯11號糯玉米在發(fā)育過程中GLV的生成量和LOX活性存在顯著變化,但是與LOX基因表達(dá)量隨生長期的變化并不一致,未表現(xiàn)為顯著的相關(guān)性關(guān)系。獼猴桃中隨果實(shí)發(fā)育階段的延長,6種LOX基因表達(dá)量不同.AdLOX1和AdLOX5在成熟期間上調(diào),而AdLOX2、AdLOX3、AdLOX4和AdLOX6則下調(diào)。番茄中TomLOXC基因只有在成熟時(shí)才被檢測到,被認(rèn)為是C6醛醇生成的功能基因。ZmLOX10在玉米植株受到傷害時(shí)表達(dá)量迅速增加,促進(jìn)GLV的產(chǎn)生。但在本研究中,在糯玉米籽粒建成期己醛與己醇含量最高,但籽粒發(fā)育后期ZmLOX10表達(dá)量最高,二者的變化并不一致。陳巧等研究發(fā)現(xiàn)黃瓜GLV含量與LOX基因表達(dá)間也未呈現(xiàn)顯著相關(guān)性,而且黃瓜中Cs LOX2基因表達(dá)高峰的出現(xiàn)先于LOX活性高峰。但是,Zhang等發(fā)現(xiàn)桃成熟過程中GLV含量與PpLOX一2、PpLOX一3、PpHPL-1和PpADHl-3等基因表達(dá)水平存在一致的變化趨勢。Boukobza等發(fā)現(xiàn)添加外源亞油酸/亞麻酸可以增加番茄GLV的生成,但是添加LOX或者乙醇脫氫酶(ADH)都不能影響GLV的生成。在氫過氧化物裂解酶(HPL)過度表達(dá)的番茄中,揮發(fā)性短鏈醛醇的量幾乎沒有改變。這些結(jié)果說明在番茄中GLV含量并不取決于LOX途徑中酶的基因表達(dá)量以及酶的活性。鮮食玉米中LOX活性與C6醛醇含量之間的相關(guān)性不顯著,而與亞油酸含量顯著相關(guān)。谷物(如水稻、玉米)種子中LOX基因表達(dá)量與病原菌入侵引發(fā)的抗逆機(jī)制以及發(fā)芽時(shí)的生理變化有關(guān)。LOX雖然是催化脂肪氧化的酶,但是在谷物中有水的情況下會加速反應(yīng)。鮮食糯玉米作為發(fā)育中的谷物種子,水分含量與果蔬接近,在蒸煮.制汁等條件下LOX作用的微環(huán)境和生化機(jī)制,及其對產(chǎn)品新鮮風(fēng)味的影響仍待進(jìn)一步研究。

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