氣相色譜法鑒別柴辛注射液中的柴胡

于曉輝，王 雷，王 琦，趙富華，楊 星，馬秋冉，顧進華*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. 牧原食品股份有限公司，河南南陽 473000)

獸用藥柴辛注射液用于治療馬、牛、羊、豬、犬、貓的感冒發(fā)熱，其生產(chǎn)企業(yè)眾多，臨床應(yīng)用廣泛。該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第1759號[1]中，其中的【鑒別】(2)項是采用氣相色譜法對其中的柴胡進行鑒別，具體的方法為“取本品，作為供試品溶液。另取正己酸對照品，加丙酮制成每1 mL含35 μg的溶液，作為對照品溶液。照含量測定項下色譜條件，吸取對照品溶液及供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，測定。供試品色譜中，應(yīng)呈現(xiàn)與對照品保留時間相同的色譜峰?！薄?/p>

在應(yīng)用上述方法對柴辛注射液進行檢驗時，發(fā)現(xiàn)其存在如下問題：現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求采用強極性的硝基對苯二甲酚改性的聚乙二醇(FFAP)為固定相的毛細管色譜柱，對供試品原液直接進樣測定。但是，該供試品原液是水溶液，將其直接注入FFAP色譜柱進行測定時，會對色譜柱的固定相造成不可逆的損傷，實驗結(jié)果表明，進供試品原液5次后，色譜柱的檢測限就由5 μg/mL升高至30 μg/mL，即色譜柱的靈敏度快速下降，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確鑒別供試品中是否含有柴胡，容易出現(xiàn)“假陰性”的實驗結(jié)果。

為了解決上述問題，本研究新建了一種“柴辛注射液”中柴胡的鑒別方法，以期更好的控制該類產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 AE240電子天平，Mettler公司； 7890A氣相色譜儀，Agilent公司； DB-FFAP色譜柱，30 m×0.53 mm, 1.00 μm，Agilent公司；HP-INNOWAX，30 m×0.53 mm, 1.00 μm色譜柱，Agilent公司；DB-624，75 m×0.530 mm，3.00 μm色譜柱，Agilent公司；HP-5，30 m×0.32 mm, 0.25 μm色譜柱，Agilent公司；7694E頂空進樣器，Agilent公司；LDZ5-2離心機，京立公司。

正己烷和乙酸乙酯均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 試藥 對照品：正己醛(批號：US7 NB-BK)，>98.0%，東京化成工業(yè)株式會社。

供試品：共6家企業(yè)生產(chǎn)的8批柴辛注射液，規(guī)格均為10 mL(相當(dāng)于原生藥30 g)。

1.3 實驗方法

取本品5 mL，置于分液漏斗中，加入正己烷5 mL，強力振搖5 min，移至玻璃離心管中，以5000轉(zhuǎn)/分鐘的速率離心15 min，取上層溶液作為供試品溶液。另取正己醛對照品適量，加正己烷制成每1 mL含6 μg的溶液，作為對照品溶液。照含量測定項下的色譜條件，吸取對照品溶液和供試品溶液各3 μL，注入氣相色譜儀，測定。

氣相色譜條件：以硝基對苯二甲酚改性的聚乙二醇(FFAP)為固定相的毛細管色譜柱(柱長30 m，內(nèi)徑0.530 mm，膜厚1.00 μm)，柱溫為程序升溫，初始溫度為70 ℃，保持1 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至170 ℃，保持10 min，再以每分鐘5 ℃的速率升溫至240 ℃，保持10 min；用氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度250 ℃；進樣口溫度210 ℃；以氮氣為載氣，流速為每分鐘5 mL，分流比10∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴胡標(biāo)記物的選擇 現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中是以己酸作為柴胡標(biāo)記物對其進行鑒別的，而在研究過程中發(fā)現(xiàn)，以己酸作為標(biāo)記物存在如下兩個問題：

問題① 響應(yīng)因子較低：采用DB-624色譜柱時，35 μg/mL的己酸丙酮溶液的峰面積僅約為10；采用DB-FFAP色譜柱時，上述溶液的峰面積約為60。以己酸作為標(biāo)記物，方法的靈敏度較差，容易出現(xiàn)“假陰性”的結(jié)果。

問題② 提取困難：當(dāng)采用DB-FFAP色譜柱進行測定時，無法直接進水溶液，即必須用非極性溶劑將己酸從強極性的供試品溶液中提取出來。本研究曾嘗試用乙醚、乙酸乙酯、正己烷等非極性溶劑對己酸進行提取，但均未能成功，這可能是由于己酸極性較強、活性較大、難以從強極性的水溶液中被提取出來。

為了解決上述問題，本研究參考了《中國獸藥典》二部柴胡注射液中的標(biāo)記物[2-3]，采用己醛作為柴胡的標(biāo)記物對其進行了測定。

2.2 色譜柱的選擇 分別采用DB-FFAP、DB-624和HP-5色譜柱，按照1.3中的色譜條件進行操作，對濃度為6 μg/ml的己醛正己烷對照品溶液進行測定，比較不同色譜柱條件下，己醛峰面積的差異，結(jié)果見表1。

表1 不同色譜柱時己醛的峰面積Tab 1 Peak area of hexanal utilizing different chromatographic columns

根據(jù)上述結(jié)果得知，三種色譜柱條件下，己醛峰面積值基本一致，表明己醛的響應(yīng)值幾乎不受色譜柱極性的影響。另外，本研究還應(yīng)用該色譜條件同時測定了甲基丁香酚，所以，為了方便操作，最終選擇甲基丁香酚測定時采用的DB-FFAP色譜柱對己醛進行鑒別檢查。

2.3 提取方法

2.3.1 提取溶劑的選擇 根據(jù)制劑的特點及文獻查閱的結(jié)果，以1號樣品為研究對象，分別以正己烷和乙酸乙酯為提取溶劑，比較二者的提取效果。結(jié)果，以乙酸乙酯為提取溶劑時，供試品溶液中己醛色譜峰峰形較差，溶劑峰干擾嚴重；而以正己烷做溶劑時，己醛峰峰形對稱，周圍的干擾峰較少。二者的色譜圖見圖1。

圖1 不同提取溶劑的比較Fig 1 Comparison of different extraction solvents

2.3.2 正己烷用量的考察 以1、2、3號樣品為研究對象，分別取三種供試品各5 mL，平行取樣3次，置于9個分液漏斗中，向每個分液漏斗中分別加入正己烷5 mL、10 mL、15 mL，按照1.3中的方法進行操作測定，比較供試品溶液中己醛的峰面積，結(jié)果見表2。

表2 不同量提取溶劑時己醛的峰面積Tab 2 Peak area of hexanal changing with the amount of extraction solvent

根據(jù)上述結(jié)果得知，隨著提取溶劑正己烷用量的增加，供試品溶液中己醛峰面積呈現(xiàn)相應(yīng)比例的變化，表明5 mL、10 mL和15 mL正己烷的提取效果基本一致。為了便于觀察實驗結(jié)果，本研究最終以己醛響應(yīng)值較大時正己烷的用量(5 mL)為提取溶劑的用量。

2.3.3 提取時間的考察 以1、2、3號樣品為研究對象，分別取三種供試品各5 mL，平行取樣3次，置于9個分液漏斗中，加入正己烷5 mL，分別強力振搖2、5和10 min，按照1.3中的方法進行操作測定，比較供試品溶液中己醛的峰面積，結(jié)果見表3。

表3 不同提取時間時己醛的峰面積Tab 3 Peak area of hexanal changing with extraction time

根據(jù)上述結(jié)果得知，強力振搖2分鐘、5分鐘和10分鐘后，供試品溶液中的己醛峰面積基本一致。為了兼顧提取效果和時間效率，本研究最終選擇5分鐘為提取時間。

2.3.4 乳化問題及離心注意事項 研究過程中發(fā)現(xiàn)，向5 mL供試品中加入5 mL正己烷，強力振搖5分鐘后，溶液較易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。為了解決乳化問題，我們采用了將乳化液靜置過夜、低溫加熱、加少量氯化鈉、離心四種方法。結(jié)果顯示，前三種方法對乳化問題的解決效果均較差，而離心方式能夠快速有效的解決乳化問題。

另外，本研究還比較了塑料材質(zhì)離心管和玻璃材質(zhì)離心管的離心效果，結(jié)果顯示，將乳化液置于塑料離心管中離心15 min后，上清液中會出現(xiàn)干擾物，造成己醛峰面積增加2～3倍。這可能是由于正己烷是一種非極性溶劑，容易將塑料材質(zhì)中的某些成分浸出，從而對己醛測定產(chǎn)生干擾。

根據(jù)上述研究結(jié)果，新建方法中采用“玻璃離心管”對乳化液進行離心操作。

2.4 進樣方式

2.4.1 提取溶液直接進樣與供試品原液頂空進樣測定結(jié)果比較 為了更準(zhǔn)確的測定供試品溶液中的己醛，本研究對1.2中的8批供試品分別采用提取溶液直接進樣法與供試品原液頂空進樣法兩種方式進行己醛含量測定，比較不同進樣方式下己醛測定結(jié)果之間的差異。其中，頂空進樣條件是按照《中國獸藥典》二部柴胡注射液【特征圖譜】項下的條件進行的(頂空瓶平衡溫度85 ℃，平衡時間15 min，進樣閥溫度100 ℃，傳輸線溫度115 ℃，頂空瓶充壓時間0.2 min，定量環(huán)填充時間0.2 min，定量環(huán)平衡時間0.5 min，進樣時間1.0 min)。兩種進樣方式下，己醛含量測定結(jié)果見表4。

表4 不同進樣方式時柴辛注射液中的己醛含量Tab 4 Content of hexanal in chaixin injection with different injection mode

從上表結(jié)果得知，8批樣品中7批樣品直接進樣的測定結(jié)果高于供試品原液頂空進樣的結(jié)果，尤其7號樣品，兩種進樣方式測得結(jié)果之間的差異高達16倍。之所以會出現(xiàn)這樣的差異，可能是由于己醛的沸點較高(130～131 ℃)，在上述頂空平衡條件下，難以使己醛從供試品中充分揮發(fā)出來，以至于頂空進樣方式測定結(jié)果偏低；另外，不同企業(yè)生產(chǎn)的制劑中添加的丙二醇等輔料的量也存在較大差異，這也會造成頂空進樣時揮發(fā)出的己醛量不充分，從而導(dǎo)致己醛測得結(jié)果偏低。

根據(jù)上述研究結(jié)果，新建方法中采用提取溶液直接進樣法對供試品溶液中的己醛進行鑒別。

2.4.2 進樣量的考察 由于己醛的響應(yīng)因子較低，峰面積較小，為了便于觀察實驗結(jié)果，準(zhǔn)確判斷己醛色譜峰，本研究根據(jù)1.3中方法的溶劑類型、進樣口溫度、色譜柱規(guī)格等，計算出供試品溶液的最大進樣量為3 μL；如果超過該進樣量，有可能造成進樣溶液氣化后溢出襯管、污染進樣口的問題。所以，在應(yīng)用該方法時，要按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求去操作，尤其注意色譜柱型號和規(guī)格的選擇，否則容易造成進樣不準(zhǔn)確。

另外，本研究又通過多次反復(fù)進樣，考察3 μL的進樣量是否會對色譜系統(tǒng)造成殘留污染。結(jié)果顯示，在3 μL的進樣量下，重復(fù)進供試品溶液約30次，未觀察到色譜系統(tǒng)中出現(xiàn)殘留物峰。

2.5 己醛對照品溶液濃度的確定 為了確定新建方法中己醛對照品溶液的濃度，本研究以《中國獸藥典》二部柴胡注射液【特征圖譜】項下的對照品溶液濃度為參考，比較了“柴胡注射液”和“柴辛注射液”二者處方和制法之間的差異，并對差異進行了轉(zhuǎn)換計算，最終確定新建方法中己醛對照品溶液的濃度為“6 μg/mL”。

2.6 專屬性考察 按照柴辛注射液的制法，制備不含有柴胡的陰性樣品，按照1.3中的方法對陰性樣品進行測定，記錄色譜圖(圖2)。結(jié)果，陰性樣品在己醛對照品色譜峰位置處無吸收峰，表明制劑中的其他成分對己醛的測定無干擾，方法專屬性良好。

圖2 己醛對照圖譜和陰性樣品圖譜Fig 2 the chromatogram of the standard solution and the negative sample solution

2.7 耐用性考察 本研究對1.3中的色譜條件進行了耐用性考察，結(jié)果表明，當(dāng)初始柱溫在70 ℃±20 ℃、進樣口溫度在210 ℃±20 ℃、檢測器溫度在250 ℃±20 ℃范圍內(nèi)變化時，己醛峰的峰面積和對稱性、己醛峰與相鄰雜峰的分離度均未見明顯變化，方法的適用性良好。

另外，本研究以1號樣品為研究對象，比較了不同升溫速率條件下，供試品溶液中己醛峰與相鄰雜峰的分離度，結(jié)果見表5。

表5 升溫速率的比較Tab 5 Comparison of heating rates

上述結(jié)果表明，升溫速率越快，己醛峰與相鄰峰的分離度越差。為了兼顧時間效率和分離效果，本研究最終選擇5 ℃/min作為升溫速率。

2.8 樣品測定 按照1.3中的方法對1.2中的8批樣品進行己醛鑒別檢查，結(jié)果8批樣品中均呈現(xiàn)與己醛對照品保留時間相同的色譜峰，代表性色譜圖見圖3。

圖3 1號樣品的氣相色譜圖Fig 3 Gas chromatogram of sample 1

3 討論與結(jié)論

研究新建了柴辛注射液中柴胡的鑒別方法[4-5]。通過采用己醛作為柴胡的標(biāo)記物，解決了原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中以己酸作為標(biāo)記物而導(dǎo)致的響應(yīng)因子低、提取困難等問題；通過篩選提取溶劑、優(yōu)化溶劑使用量和提取時間，解決了原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中直接進樣水溶液供試品以至于色譜柱被損傷、靈敏度快速下降等問題；通過比較不同進樣方式并優(yōu)化進樣量，保證了己醛峰面積較大、便于結(jié)果觀察和結(jié)果判斷。

另外，本研究還對新建方法的專屬性和耐用性進行了考察，保證方法準(zhǔn)確可靠、適用性良好。應(yīng)用新建方法對6個廠家生產(chǎn)的8批柴辛注射液進行測定，結(jié)果表明，該方法操作簡便、專屬性強、耐用性好，適用于該類制劑的質(zhì)量控制[6]，為柴辛注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提升提供了實驗依據(jù)。