伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥臨床試驗設(shè)計及評價要點(diǎn)

邱基程，楊宇欣，李格賓，吳聰明，馮華兵，汪 霞，梁先明，蘇富琴*，曹興元*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥安全評價中心，北京 100193；3.北京中農(nóng)大動物醫(yī)院有限公司，北京 100193；4.中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局，北京 100125；5.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

隨著生活水平的不斷提高，伴侶動物走入人們的生活，伴侶動物不再是單純定義的寵物，更是現(xiàn)代家庭的重要成員和都市人群的重要精神支撐。在歐美發(fā)達(dá)國家，腫瘤已經(jīng)超過傳染病成為導(dǎo)致伴侶動物死亡的主要原因[1]。自21世紀(jì)初，我國寵物經(jīng)濟(jì)以30%的發(fā)展速度穩(wěn)定增長，隨之而來，寵物主人對寵物醫(yī)療提出了更高的要求和標(biāo)準(zhǔn)。我國一項對11204例犬臨床診療病例的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患病率占10.9%，并且正以倍速增長，2014年臨床確診腫瘤病例為2009年的5.2倍[2]。同時，與人罹患腫瘤疾病類似，伴侶動物腫瘤常表現(xiàn)出高度復(fù)雜性和異質(zhì)性。乳腺腫瘤、肥大細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤等為常見腫瘤類型；皮膚、乳腺、肛周、口腔等為常見的腫瘤生長部位[3]。

伴隨著寵物醫(yī)療的不斷發(fā)展和臨床的實(shí)際需要，伴侶動物用抗腫瘤藥被越來越多研發(fā)者所關(guān)注。抗腫瘤藥物可分為細(xì)胞毒類和非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，細(xì)胞毒類藥物對腫瘤組織和生長迅速組織的選擇性低，在抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞的同時，可能會引起骨髓抑制等嚴(yán)重不良反應(yīng)，人可以將延長壽命作為動力而忍受嚴(yán)重不適，寵物主人或獸醫(yī)可以因為不良事件決定停止治療或?qū)游飳?shí)施安樂死，除非證明不良反應(yīng)發(fā)生是暫時的。因此，伴侶動物用抗腫瘤藥目的是減輕或推遲腫瘤進(jìn)展和臨床癥狀進(jìn)展，而不損害伴侶動物的生活質(zhì)量。而非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥通常具有靶向性，可降低臨床不良反應(yīng)發(fā)生。截至2022年，歐洲藥品管理局(EMA)和美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)共批準(zhǔn)6個犬貓用抗腫瘤藥物，均為非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥。目前，我國還沒有伴侶動物用抗腫瘤藥物上市[4]。

EMA將非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥定義為有別于傳統(tǒng)細(xì)胞毒類抗腫瘤藥作用機(jī)制，通過短時間暴露來干擾細(xì)胞DNA復(fù)制、有絲分裂等繁殖活動，可引起腫瘤不可逆的致死性損傷，從而抑制腫瘤[5]。非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥通常具有靶向性，主要是通過與膜受體、細(xì)胞質(zhì)信號通路成分、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白以及血管生成中重要的蛋白質(zhì)或因子等靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)而抑制腫瘤生長或防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。根據(jù)其生化性質(zhì)，非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥主要分為核苷酸藥物、抗體及其類似物、靶向小分子抑制劑和其他(如病毒)；目前主要的作用通路和靶點(diǎn)包括：作用受體酪氨酸激酶(RPTKs)信號通路(mTOR[6]、MEK[7])、結(jié)合細(xì)胞表面受體[8]、抑制血管生成[9]、作用于細(xì)胞基質(zhì)成分[10]和DNA甲基化[11]。

本文參考EMA[12-13]和FDA[14]伴侶動物用抗腫瘤藥物指導(dǎo)原則，結(jié)合國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心(CDE)抗腫瘤藥物指南[15-16]和國家獸藥安全評價中心GCP實(shí)驗室對伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥的臨床評價經(jīng)驗，對伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥研發(fā)過程中的臨床試驗設(shè)計關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行分析，為伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥研發(fā)者提供參考。

1 Ⅰ期臨床試驗設(shè)計及評價要點(diǎn)

Ⅰ期臨床試驗旨在對非細(xì)胞毒類藥在靶動物體內(nèi)的安全性和耐受性進(jìn)行評價，以此來確定該藥物在伴侶動物上的劑量限制性毒性(DLT)和最大耐受劑量(MTD)，次要目標(biāo)可能包括確定給藥間隔、臨床獲益率、生物標(biāo)志物開發(fā)、PK和PD研究以及免疫原性研究，以便為后續(xù)臨床研究最終給藥方案確定提供依據(jù)。

1.1 受試動物 根據(jù)EMA[13]規(guī)定，在Ⅰ期臨床研究階段，健康動物或患病動物均可被用作研究對象，但應(yīng)該充分說明理由，而對于入組動物選擇標(biāo)準(zhǔn)未進(jìn)行規(guī)定。CDE[15]在抗腫瘤藥物臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則中指出：對于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥可以選用健康志愿者進(jìn)行部分研究，同時對入組和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了規(guī)定。

結(jié)合目前報道的伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥臨床研究的入組標(biāo)準(zhǔn)[17-19]和排除標(biāo)準(zhǔn)[20-22]，建議Ⅰ期臨床選擇患病動物進(jìn)行研究。入選動物應(yīng)符合以下基本要求：(1)寵物主人首先需理解并簽署知情同意書，確保主人了解并認(rèn)可試驗中潛在風(fēng)險以及益處；(2)經(jīng)病理組織學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)確診腫瘤發(fā)生類型以及相關(guān)靶點(diǎn)表達(dá)。應(yīng)根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)明確患病動物的臨床分期；(3)受試動物應(yīng)至少年滿一周歲，預(yù)期壽命應(yīng)能達(dá)到試驗預(yù)期設(shè)想；(4)文獻(xiàn)報道采用改良版美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)體力評分標(biāo)準(zhǔn)對患病動物進(jìn)行體力評價，受試患病動物的體力評分應(yīng)在0至1級；(5)入組前一定時間內(nèi)未接受其他方式對腫瘤治療，若在規(guī)定時間之前接受其他治療，應(yīng)對治療方式和周期詳細(xì)記錄；(6)試驗前應(yīng)通過影像學(xué)等手段對腫瘤進(jìn)行實(shí)際測量并記錄，明確入組腫瘤體積大小和腫瘤直徑；(7)主要器官功能經(jīng)臨床評估應(yīng)滿足試驗開展基本要求，且無消化道出血或凝血功能障礙(胃腸道腫瘤或肝臟腫瘤除外)。對于器官功能要求應(yīng)做出細(xì)致規(guī)定和描述，如：絕對中性粒細(xì)胞計數(shù)>2000個細(xì)胞/μL，血細(xì)胞比容>25%，血小板計數(shù)>75000/μL，血清肌酐<2.5 mg /dL，膽紅素≤正常上限，轉(zhuǎn)氨酶≤3倍于正常上限[23]。對于不符合要求的患病動物，在入組過程中應(yīng)該予以排除，排除標(biāo)準(zhǔn)主要包括但不限于如下條件：(1)患病動物存在嚴(yán)重系統(tǒng)性疾??；(2)以生育繁殖為目的的寵物，包括已經(jīng)受孕、哺乳期或短期內(nèi)有繁殖計劃的寵物。試驗過程中應(yīng)詳細(xì)記錄年齡、品種、性別、絕育狀態(tài)和體重等信息。

1.2 試驗設(shè)計原則 對于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥Ⅰ期臨床研究，首次給藥劑量選擇十分關(guān)建。CDE[15]建議非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥非臨床階段起始給藥濃度為該藥物無可見有害作用水平(NOVAEL)的1/5或者更高濃度進(jìn)行給藥。對于伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，Ⅰ期臨床起始劑量可參考臨床前靶位點(diǎn)藥效學(xué)相關(guān)試驗結(jié)果設(shè)置。

與人抗腫瘤藥物臨床研究不同，寵物種屬間差異較大，F(xiàn)DA對伴侶動物抗腫瘤藥計量單位做出規(guī)定：大型犬(體重>10 kg)應(yīng)采用mg/m2體表面積為劑量單位給藥，而小型犬(體重≤10 kg)采用mg·kg-1BW為劑量單位進(jìn)行給藥[14]。

與人抗腫瘤藥物臨床研究一致，伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥Ⅰ期臨床試驗給藥方案也主要采用劑量爬坡的方式進(jìn)行，臨床常采用(3+3)遞增設(shè)計進(jìn)行劑量爬坡試驗[18]。對每級動物數(shù)和遞增幅度均應(yīng)詳細(xì)描述，如：每組3只動物，當(dāng)未出現(xiàn)DLT，則進(jìn)行更高一級劑量水平研究；當(dāng)出現(xiàn)1例DLT，則在該劑量水平上增加3例受試患病寵物；當(dāng)未再出現(xiàn)新的DLT，則繼續(xù)下一劑量水平試驗；當(dāng)出現(xiàn)≥2例DLT，該劑量水平的前一個劑量水平定義為MTD(MTD定義為當(dāng)前劑量水平下，6例受試寵物出現(xiàn)<2例DLT)[24]。非細(xì)胞毒類藥可能在較高劑量下仍觀察不到DLT，建議將靶點(diǎn)占位或抑制以及臨床實(shí)際使用相結(jié)合，盡可能研究更高水平的劑量。給藥間隔應(yīng)結(jié)合前期靶點(diǎn)占位或抑制相關(guān)研究來確定。值得注意的是，由于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥毒性較小，有研究報道使用“加速滴定”劑量遞增策略來進(jìn)行劑量遞增[25]。

1.3 不良反應(yīng)觀察和評價 與人用抗腫瘤藥臨床研究中的不良反應(yīng)評估一樣，伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥的不良反應(yīng)也需從多個角度進(jìn)行綜合評價。人醫(yī)通常采用美國國立癌癥研究所給出的常見毒性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(NCI-CTC)進(jìn)行治療過程中不良反應(yīng)的評估[15]，而這一標(biāo)準(zhǔn)并不適用于伴侶動物臨床研究。獸醫(yī)腫瘤合作組-不良事件通用術(shù)語表(VCOG-CTCAE)更適用于伴侶動物非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥的不良反應(yīng)分級評估[4]。僅少數(shù)伴侶動物非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥臨床研究時采用改良NCI-CTC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行不良反應(yīng)評估[22]。伴侶動物在非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥治療過程中的不良反應(yīng)主要包括皮膚癥狀、食欲不振、腹瀉、嘔吐、中性粒細(xì)胞減少和后肢無力等，大多數(shù)不良反應(yīng)都是短期存在的，停止治療后短期內(nèi)即可消失[17-18,21]。

基于上述描述和分析，伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥Ⅰ期臨床研究不良反應(yīng)評價應(yīng)從多個方面綜合分析，包括但不限于：(1)實(shí)驗室檢測指標(biāo)：生理、生化、尿液等；(2)患病寵物評分：改良ECOG體力評分等；(3)不良事件統(tǒng)計：患病寵物不良事件統(tǒng)計應(yīng)根據(jù)VCOG-CTCAE進(jìn)行分級記錄評估，并判斷不良反應(yīng)與研究藥物的相關(guān)性、可逆性和可預(yù)防措施，所有不良事件應(yīng)詳細(xì)記錄。對于劑量限制性毒性(DIL)應(yīng)進(jìn)行明確定義，如任何3級或4級非血液學(xué)毒性，任何無并發(fā)癥(如無發(fā)熱，出血等)4級血液學(xué)毒性，或任何復(fù)雜的3級或4級血液學(xué)毒性。此外，若不良反應(yīng)低于3級，但臨床試驗過程中發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)嚴(yán)重的皮膚病變也應(yīng)被視為DLT[26]。(4)生物標(biāo)志物水平和靶位點(diǎn)抑制情況可同時作為療效評價指標(biāo)進(jìn)行檢測。

2 Ⅱ期臨床設(shè)計及評價要點(diǎn)

Ⅱ期臨床研究是為了確定在Ⅰ期建議給藥方案下的抗腫瘤效果，評價藥物的安全性和有效性，進(jìn)一步研究藥物不良反應(yīng)特征、最佳給藥途徑以及識別與效應(yīng)相關(guān)的生物標(biāo)記物，進(jìn)而為Ⅲ期臨床研究提供依據(jù)[4]。值得注意的是，EMA發(fā)布的指南中注明若Ⅰ期臨床研究中已對患病動物進(jìn)行單藥對擬定適應(yīng)癥腫瘤類型的抗腫瘤活性評價，同時考慮劑量選擇及臨床終點(diǎn)明確，即劑量特征信息已經(jīng)足夠，則可考慮豁免II期研究，直接進(jìn)行Ⅲ期臨床研究[13]。

2.1 試驗動物 若開展II期臨床研究，動物入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)與Ⅰ期入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)基本一致。試驗前，需準(zhǔn)確記錄患病寵物基本信息，腫瘤適應(yīng)癥的準(zhǔn)確定義，腫瘤分級和臨床分期，既往治療和靶點(diǎn)表達(dá)量(如適用)。每只入選病例至少有一種客觀可測量指標(biāo)或可評價的指標(biāo)，動物入組應(yīng)建立跟蹤檔案詳細(xì)記錄入組信息。

2.2 試驗設(shè)計原則 Ⅱ期臨床研究在Ⅰ期臨床研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化給藥方案，研究可根據(jù)實(shí)際需要選擇性設(shè)立對照組，對照組應(yīng)給予安慰劑或支持治療。現(xiàn)有伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥Ⅱ期臨床研究過程大多采用單臂、開放性研究[21]，可選擇性采用多個劑量組給藥，入組病例的數(shù)量可根據(jù)具體試驗要求調(diào)整，取決于最小有效反應(yīng)率和自發(fā)消退率(通常<5%)[27]。試驗設(shè)計時，可針對Ⅰ期臨床實(shí)驗結(jié)果對給藥方案(劑量、間隔、滴注速度、療程)進(jìn)行細(xì)化和調(diào)整。若為獲得預(yù)期效果或避免毒性反應(yīng)需要采用的輔助治療(如利尿、止吐)應(yīng)在給藥方案中給予規(guī)定和說明。使用任何化療藥物增效劑、化療藥物保護(hù)劑、耐藥性調(diào)節(jié)劑作為伴隨治療時應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的說明和記錄，同時，在研究過程中應(yīng)盡量避免使用類固醇藥、非甾體類抗炎藥、靶向免疫系統(tǒng)藥。

人臨床上，一些新型的Ⅱ期研究設(shè)計已經(jīng)開始應(yīng)用于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，如隨機(jī)停藥設(shè)計(RDT)。在隨機(jī)停藥設(shè)計方案中，所有入組患者首先接受2～4個月的藥物治療。在期間有進(jìn)行性疾病、毒性或不依從性的動物則從研究中剔除。其余受試動物被隨機(jī)分為兩組，分別繼續(xù)接受藥物治療和使用安慰劑治療。臨床終點(diǎn)是動物在試驗期間接受藥物治療維持疾病穩(wěn)定的比例[28]。

2.3 療效評價及臨床終點(diǎn) Ⅱ期試驗的主要目標(biāo)是評估藥物活性/療效，因此用于評估反應(yīng)的終點(diǎn)對設(shè)計至關(guān)重要。在人用抗腫瘤藥臨床，CDE[15]認(rèn)為客觀緩解率(ORR)為Ⅱ期臨床的療效觀察指標(biāo)，同時應(yīng)該觀察受試者其他臨床獲益指標(biāo)。在獸醫(yī)臨床，EMA[12]指南中認(rèn)為對于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，其作用機(jī)制并非是通過對腫瘤細(xì)胞殺傷來直接發(fā)揮作用，而是通過對相關(guān)靶點(diǎn)和通路進(jìn)行調(diào)節(jié)從而抑制腫瘤生長，其藥效終點(diǎn)應(yīng)選擇至疾病進(jìn)展時間(TTP)作為主要藥效學(xué)評價指標(biāo)。在不能以TTP作為終點(diǎn)時，也可以選擇ORR作為藥效終點(diǎn)，但應(yīng)該注意藥物治療引起的腫瘤腫脹對于結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。值得關(guān)注的是，EMA指南中明確指出對于伴侶動物而言，維持伴侶動物生活質(zhì)量比治療使腫瘤縮小更加重要[13]。

目前對于伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥的臨床研究，主要采用犬實(shí)體瘤的反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)(cRECIST)進(jìn)行藥效評價[4,17-18]，同時，在一些研究中也采用主人對犬的健康相關(guān)生活質(zhì)量的評價(HRQoL)作為次要藥效指標(biāo)進(jìn)行分析[17]。同時在某些病毒類寵物抗腫瘤用藥研究中，也使用細(xì)胞因子濃度水平作為藥效評價指標(biāo)[29]。

因此，鑒于非細(xì)胞毒性藥物的特殊作用機(jī)制，若由于試驗設(shè)計本身而無法使用TTP作為主要評價指標(biāo)，可以選擇ORR進(jìn)行評價，應(yīng)對治療反應(yīng)進(jìn)行明確定義，如腫瘤的完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)或疾病進(jìn)展(PD)[18]。同時，應(yīng)將健康相關(guān)的生活質(zhì)量評價(HRQoL)和體力評分作為藥效指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，任何為了增加臨床療效而使不良反應(yīng)增加的給藥方案是不可接受的。鼓勵在藥效評估的過程中進(jìn)行生物標(biāo)志物探索性研究，對于某些特殊的非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，可以使用生物標(biāo)志物水平進(jìn)行藥效評價。

3 Ⅲ期臨床設(shè)計及評價要點(diǎn)

Ⅲ期臨床即在Ⅰ期臨床和/或Ⅱ期臨床的基礎(chǔ)上進(jìn)一步確證研究，通過對臨床大樣本、隨機(jī)、對照研究明確藥物在特定患病動物上的有效性和安全性，對給藥方案進(jìn)行進(jìn)一步確證[4]。

3.1 試驗動物 試驗入組病例應(yīng)遵從與Ⅱ期入選病例相應(yīng)的基本要求標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇在前期臨床研究中有療效的腫瘤類型進(jìn)行研究，入組規(guī)則可以根據(jù)前期臨床研究結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

3.2 試驗設(shè)計原則 經(jīng)典的細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物Ⅲ期臨床研究通常采用隨機(jī)、盲法、對照試驗設(shè)計，以死亡時間為主要終點(diǎn)，旨在比較新開發(fā)藥物和標(biāo)準(zhǔn)治療或安慰劑之間的療效。對于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，Ⅲ期臨床思路與經(jīng)典的細(xì)胞毒類抗腫瘤藥Ⅲ期設(shè)計思路一致，應(yīng)采用隨機(jī)、盲法、對照試驗進(jìn)行研究，EMA強(qiáng)調(diào)伴侶動物用抗腫瘤藥物Ⅲ期臨床研究不接受單臂研究[13]。入組的患病動物以一定比例隨機(jī)分配(如1∶1或2∶1)接受藥物治療或給予安慰劑/支持治療[22]。如果藥物作用的機(jī)制是針對某一靶點(diǎn)發(fā)揮作用，那么最好應(yīng)針對靶點(diǎn)進(jìn)行試驗設(shè)計，即首先對患病寵物進(jìn)行靶點(diǎn)檢測，并且只有在陽性的情況下，才可參加試驗并隨機(jī)分配到兩個治療組。根據(jù)Ⅱ期臨床研究結(jié)果確定的預(yù)期臨床給藥方案給藥，對于伴隨治療或其他輔助手段應(yīng)明確記錄，試驗過程中可進(jìn)行劑量調(diào)整，但是應(yīng)提前在方案中制定具體的劑量調(diào)整原則。

3.3 療效評價及臨床終點(diǎn) 與Ⅱ期研究不同，Ⅲ期側(cè)重于對藥物是否能達(dá)到臨床獲益進(jìn)行評價，因此在臨床研究的過程中應(yīng)該側(cè)重選擇能顯示臨床獲益的藥效指標(biāo)，主要包括：(1)與腫瘤發(fā)展相關(guān)的指標(biāo)：TTP、ORR和不同生物標(biāo)志物；(2)與生存相關(guān)的療效指標(biāo)：總生存期(OS)、無病生存期(DFS)、無進(jìn)展生存期(PFS)；(3)HRQoL評估[13]。臨床終點(diǎn)的選擇應(yīng)該將疾病進(jìn)展推遲到有臨床意義的程度，選擇與生存相關(guān)的療效指標(biāo)和與腫瘤發(fā)展相關(guān)的指標(biāo)作為主要的藥效指標(biāo)，HRQoL評估作為重要次要藥效指標(biāo)來進(jìn)行綜合分析。

4 靶動物安全性試驗

該試驗旨在分析不同給藥劑量下對靶動物的安全性和毒性進(jìn)行全面系統(tǒng)性的評價，是伴侶動物用抗腫瘤藥開發(fā)過程中的重要環(huán)節(jié)。通過對靶動物臨床觀測、生理、生化和尿液等分析指標(biāo)和組織病理學(xué)觀察，進(jìn)而明確受試藥物對機(jī)體可能造成的危害以及臨床使用過程中可采用的預(yù)防措施。EMA規(guī)定，對于非細(xì)胞毒類寵物抗腫瘤藥，靶動物安全性試驗應(yīng)按照獸藥注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)委員會(VICH) GL43中相關(guān)要求進(jìn)行[13]。

4.1 試驗動物 根據(jù)VICH[30]、我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部[31]對于伴侶動物用藥物靶動物安全性相關(guān)要求和已上市的伴侶動物用抗腫瘤藥物靶動物安全性研究內(nèi)容[32-34]，試驗應(yīng)選擇健康動物進(jìn)行研究，動物的年齡應(yīng)根據(jù)臨床使用對象保持一致。在試驗開始前，應(yīng)由專業(yè)的寵物醫(yī)師對入組動物進(jìn)行檢查，同時對計劃入組動物應(yīng)進(jìn)行生理、生化等健康指標(biāo)檢查，確保入組動物為健康動物。

4.2 試驗設(shè)計原則 根據(jù)VICH[30]和我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部[31]關(guān)于靶動物安全相關(guān)要求，寵物安全試驗設(shè)計通常采用隨機(jī)試驗設(shè)計進(jìn)行，每個處理組應(yīng)不少于6只動物，雌雄各半，如受試藥物存在性別差異，則每組應(yīng)不少于8只動物，雌雄各半。給藥劑量設(shè)置應(yīng)依照臨床推薦劑量和給藥時間的倍數(shù)遞增進(jìn)行研究，通常遞增倍數(shù)為推薦使用的最高劑量、以及在一段時間內(nèi)超出推薦使用最高劑量的三倍(中劑量)和五倍(高劑量)使用劑量進(jìn)行研究。同時，應(yīng)設(shè)立空白對照組。治療療程設(shè)置應(yīng)至少進(jìn)行3次推薦的給藥方案處理，若需要短期內(nèi)間歇性進(jìn)行治療，則應(yīng)該至少按照推薦給藥方案間隔進(jìn)行3次給藥治療。若治療周期超過3個月，適當(dāng)情況下，可根據(jù)藥動學(xué)和毒理學(xué)進(jìn)行6個月或更長時間的安全性研究(例如：藥物在使用過程中會出現(xiàn)明顯的蓄積作用，藥物在單次使用后兩個月后仍具有藥效或需長期使用)。

由于伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥毒性作用較低，因此在靶動物安全性試驗過程中可進(jìn)行更高劑量遞增倍數(shù)、更短給藥間隔或更長治療時間的安全性研究，如Masitinib[32]在靶動物安全性研究階段分別進(jìn)行1倍、3倍和10倍劑量和以4周、13周、39周為治療療程的靶動物安全性研究；Palladia[34]在安全性研究階段進(jìn)行一項為期13周的長期安全性研究，按照推薦給藥方式每兩天給藥一次，給藥劑量為推薦給藥劑量的3倍；同時將每天多次給藥作為支撐性研究同時納入分析；Stelfonta[33]在靶動物安全評價階段在以4周單次的推薦給藥方案下進(jìn)行4周內(nèi)重復(fù)靜脈注射給藥的安全性評價，同時將安全給藥劑量下單次長時間給藥作為支撐性研究同時納入分析。所有已上市的藥物均將臨床過程中的不良反應(yīng)觀測作為支撐性研究納入靶動物安全性分析[32-34]。

4.3 安全性評價指標(biāo) 根據(jù)VICH[30]和我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部[31]關(guān)于靶動物安全的相關(guān)要求，伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥靶動物安全性評價應(yīng)主要從如下四個方面進(jìn)行：(1)臨床觀測。在適應(yīng)期和整個實(shí)驗過程應(yīng)進(jìn)行多次體況檢查，主要包括但不限于體重、體溫、呼吸、行為、精神狀況、體重、采食量、飲水量等。(2)血液學(xué)檢查。如血液學(xué)、血生化、尿分析。(3)大體剖檢及組織病理學(xué)檢查。VICH[30]規(guī)定對創(chuàng)新獸藥，所有劑量組的動物均需進(jìn)行大體剖檢和組織病理學(xué)檢查。對于仿制藥，應(yīng)至少對陰性對照和最高劑量組的所有動物進(jìn)行大體剖檢和組織病理學(xué)檢查；若高劑量組發(fā)現(xiàn)藥物造成的組織病變，則繼續(xù)對中劑量(3×)進(jìn)行大體剖檢和組織病理學(xué)檢查，直至病理學(xué)檢查無任何病變。

同樣地，伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥在靶動物安全研究過程中，也主要從臨床觀測、血液學(xué)檢查和大體剖檢及組織病理學(xué)檢查三個層次開展安全性評價[32-34]。此外，對于某些局部使用的非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥(如瘤內(nèi)注射給藥)，應(yīng)對注射部位的安全性進(jìn)行評價[33]。伴侶動物用非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥的不良反應(yīng)主要表現(xiàn)[32-34]為臨床觀測上：飼料消耗量下降、跛行、嘔吐、體重減輕、心動過速、躁動和口腔黏膜發(fā)白；血液學(xué)檢查上：中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞減少、貧血、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和肌酸激酶升高；組織病理學(xué)上：十二指腸和空腸腸道紊亂，膽管上皮空泡化，以及骨髓、胰腺、肝臟和腎臟也存在病變。對于非細(xì)胞毒類的大分子抗腫瘤藥物，關(guān)于其免疫原性的研究在人醫(yī)上已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的開展，但獸藥臨床剛剛開始關(guān)注，尚未有相關(guān)指南發(fā)布，后續(xù)研究中應(yīng)密切關(guān)注該類制劑的免疫原性問題。

5 討 論

5.1 療效終點(diǎn)的選擇 由于II期臨床試驗的主要目標(biāo)是評估藥物活性/療效，因此用于評估的反應(yīng)終點(diǎn)對設(shè)計至關(guān)重要?？偵嫫?OS)是確定藥物是否獲益最直觀的終點(diǎn)[4]，然而，該終點(diǎn)可能需要耗費(fèi)較長時間，并且可能受到寵物安樂死或?qū)で筇娲煼ǖ挠绊?。因此，大多?shù)Ⅱ期試驗使用臨時或次要終點(diǎn)，通常稱為替代終點(diǎn)，終點(diǎn)包括ORR，基于成像技術(shù)的終點(diǎn)、生物標(biāo)志物或靶標(biāo)抑制水平[35]，這些終點(diǎn)可以合理地預(yù)測臨床療效。對于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，其主要作用是防止腫瘤的進(jìn)一步生長，而可能不具有明顯縮小腫瘤的作用，因此，ORR可能不是評估藥物效果適合的終點(diǎn),無進(jìn)展生存期(PFS)、疾病進(jìn)展時間(TTP)、預(yù)定的時間點(diǎn)無進(jìn)展率(PFR)可能是更合適的終點(diǎn)。與人腫瘤治療不同，EMA強(qiáng)調(diào)伴侶動物腫瘤治療的目的是減少寵物的病痛和不適，延緩腫瘤進(jìn)展，提高生活質(zhì)量[13]。在研究過程中，任何為了增加療效而嚴(yán)重影響寵物生活質(zhì)量的給藥方案都是不可接受的，同時，伴侶動物的治療往往受寵物主人的主觀意識決定，因此II期試驗的次要終點(diǎn)可能包括生活質(zhì)量評估、治療比較成本、住院天數(shù)等。在涉及時間相關(guān)的療效終點(diǎn)判定時，應(yīng)考慮安樂死對試驗結(jié)果的影響。

5.2 給藥方案確定的選擇 在細(xì)胞毒類抗腫瘤藥的Ⅰ期臨床試驗中，DLT是主要的毒性終點(diǎn)。通過劑量遞增的方式，依次在每個順序劑量水平下接受治療，通過不良反應(yīng)發(fā)生率確定在隨后的II期和III期臨床試驗中采用劑量MTD。對于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，由于其作用機(jī)制通常為抑制腫瘤生長，可能缺乏臨床上顯著的器官毒性，因此，毒性和療效可能不是劑量依賴性的，通常在無毒性劑量下就具有最大抑制活性作用[19-20]，這使得以MTD為終點(diǎn)的研究可能不適于非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥劑量確定?；谶@一特點(diǎn)，最佳生物劑量(OBD)[36]可作為MTD的替代終點(diǎn)。理想情況下，OBD是基于增加劑量以達(dá)到最佳藥效學(xué)的抗腫瘤活性參數(shù)，即靶位被藥物飽和或靶標(biāo)介導(dǎo)的最佳信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的給藥劑量。不過，使用OBD作為替代指標(biāo)，應(yīng)明確藥物作用靶點(diǎn)，同時應(yīng)結(jié)合群體藥動學(xué)(PPK)進(jìn)行分析，通過群體PK/PD模型建立暴露與靶點(diǎn)藥效之間的關(guān)系進(jìn)而確定最佳給藥劑量和給藥間隔[37]，也可采用群體PK/TD對OBD劑量下的不良反應(yīng)進(jìn)行評估。在人臨床，CDE最新頒布的《臨床價值為導(dǎo)向的抗腫瘤藥物臨床研發(fā)指導(dǎo)原則》中指出：給藥劑量的確定可以根據(jù)劑量-暴露量-效應(yīng)進(jìn)行確定，鼓勵在早期采用模型引導(dǎo)的藥物開發(fā)(MIDD)進(jìn)行研究[16]。

不同的非細(xì)胞毒類抗腫瘤藥作用機(jī)制往往存在較大差異，因此在臨床研究評價過程中，應(yīng)結(jié)合藥物作用機(jī)制綜合分析后選擇合適的藥效學(xué)指標(biāo)來進(jìn)行評價。對于藥效指標(biāo)的適用性，應(yīng)積極向新獸藥審評機(jī)構(gòu)進(jìn)行咨詢溝通，同時和行業(yè)內(nèi)相關(guān)的專家開展論證和交流，進(jìn)而制定最終的試驗方案。鼓勵研發(fā)企業(yè)積極開展研究，選擇與療效相關(guān)的生物標(biāo)志物用于藥效評價。