Cg CDA3基因缺失對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)和侵染致病的影響

孟祥春 鄭肖祎 黃澤鵬 王小菁

摘要： 為了明確Cg CDA3基因在膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）生長(zhǎng)及侵染致病過程中的功能，從G.gloeosporioides基因組中克隆Cg CDA3基因，首先進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后利用基因同源重組的方法獲得CgC-DA3基因缺失突變體（△cda3），最后分析了△cda3的孢子萌發(fā)、附著胞形成和侵染致病性變化。結(jié)果表明，CgC-DA3基因ORF全長(zhǎng)1470 bp，編碼含489個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其含有一個(gè)聚多糖去乙?；副Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域。CgCDA3蛋白與已知的西瓜炭疽菌（C.orbiculare）、禾生炭疽菌（C.graminicda）和睡蓮炭疽菌（C.nymphaeae）的CDA蛋白同源性較高，同源性分別為63%、60%和80%。Cg CDA3基因缺失突變體同野生型相比，生長(zhǎng)及產(chǎn)孢正常，但表現(xiàn)為孢子萌發(fā)能力下降，附著胞形成率降低，同時(shí)侵染芒果的致病性也顯著減弱。推測(cè)Cg CDA3基因參與調(diào)控膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)和附著胞形成等形態(tài)生長(zhǎng)和建成過程，從而對(duì)其致病性產(chǎn)生一定的影響。

關(guān)鍵詞：膠胞炭疽菌;幾丁質(zhì)脫乙酰酶;孢子萌發(fā);附著孢;突變體;致病性

中圖分類號(hào)：S436.67

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440f 2018）05-1013-09

芒果（Mangifera indica L）是世界著名的熱帶水果之一，深受消費(fèi)者和果農(nóng)的喜愛，也是中國(guó)主要栽培水果之一。膠孢炭疽菌（Colletoirichum gloeospori-oides）是世界性的、廣譜的、潛伏性侵染芒果的常發(fā)性病原菌之一，主要危害嫩葉、新梢、花及果實(shí)，尤其是引起貯運(yùn)期的果實(shí)腐爛，降低果實(shí)的品質(zhì)和外觀質(zhì)量，造成采后重大損失。由于膠孢炭疽菌的寄主范圍廣泛，侵染策略多樣，目前還沒有安全有效的防治策略。挖掘該菌在侵染致病過程中的功能基因，并了解其在膠孢炭疽菌與寄主互作過程中的機(jī)制，對(duì)于有效防治膠孢炭疽病菌引起的采后病害具有重要的理論和實(shí)踐意義。這也是植物病原真菌研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶（CDA）是一種糖蛋白，可催化植物病原真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)分子脫去乙?；蓺ぞ厶?。目前，已從多種真菌中分離純化獲得CDA蛋白，也已從魯氏毛霉（Mucor rouxii）、菜豆炭疽菌（Colletotrichum lin，demuthianum）、布克須霉（Phycomyces blakesleeanus）、裂褶菌（Schizo-phyllum communeand）、麥類白粉病菌（Blumeriagraminis）及釀酒酵母（Saccharomyces cerevLsLae）等微生物中克隆得到CDA基因。已有研究結(jié)果證明CDA基因在病原真菌生長(zhǎng)發(fā)育及侵染致病過程中有多種功能。例如魯氏毛霉（M.rouxu）和藍(lán)色犁頭霉（A.coemlea）的CDA參與細(xì)胞壁殼聚糖的合成，釀酒酵母（S.cerevisiae）的CDA可維持子囊孢子細(xì)胞壁的硬度，cdaJ基因缺失的裂殖酵母（S.pombe）產(chǎn)孢及孢子形態(tài)異常。菜豆炭疽菌（C.lin，demuthianum）、黃瓜炭疽菌（C.lan，gen，arium）和構(gòu)巢曲霉（A.nidulan，s）的CDA參與其對(duì)植物的侵染致病過程。

在植物和病原菌的互作過程中，致病力大小由病原菌自身產(chǎn)生的致病因子和寄主植物的抗性兩方面的因素決定。有研究結(jié)果顯示，高乙?；潭鹊膸锥」烟呛凸央耐阴；潭鹊偷膹?fù)合物相比，可有效增加植物對(duì)病原真菌的抗性。Siegrist等和李春娟等研究認(rèn)為，病原菌產(chǎn)生CDA降解自身細(xì)胞壁幾丁質(zhì)產(chǎn)生多糖聚合物，多糖聚合物可逃避植物的幾丁質(zhì)酶對(duì)病原菌細(xì)胞壁的水解，同時(shí)脫乙?；a(chǎn)物殼聚糖可能起抗性反應(yīng)激發(fā)子的功能，抑制植物體致病因子激發(fā)的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)定殖。這一相互作用在黃瓜炭疽菌（C.langenari-um）中首次被證實(shí)。雖然認(rèn)為病原真菌的CDA決定了其對(duì)宿主的致病性，但至今無更多可靠證據(jù)證明幾丁質(zhì)的乙?；潭葘?duì)植物抗性和病原菌致病力的重要性。另外，根瘤菌nodB蛋白和多數(shù)真菌的CDA都具有一個(gè)典型的多糖脫乙酰酶結(jié)構(gòu)域，因此也推測(cè)真菌的CDA基因在功能上與NodB類似，參與幾丁質(zhì)酶激發(fā)的防御反應(yīng)。目前關(guān)于芒果膠孢炭疽菌CDA基因的生物學(xué)功能知之甚少。Alkan等發(fā)現(xiàn)C.gloeosporioides存在3個(gè)CDA相似基因，CDA1基因的缺失對(duì)菌株的致病性沒有顯著影響。本研究對(duì)其中的CgCDA3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過基因敲除策略研究基因缺失對(duì)C.gloeosponoLdes生長(zhǎng)及侵染致病力的影響，為明確CDA基因在炭疽病菌致病過程中的功能提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和果實(shí) 野生型C.gloeosporioides菌株為從芒果果實(shí)上分離的具有強(qiáng)致病性的單孢培養(yǎng)物，CgCDA3基因缺失突變株的構(gòu)建由本實(shí)驗(yàn)室完成。用于膠孢炭疽病菌接種及致病力分析的芒果果實(shí)材料為廣東、海南等地的栽培種象牙芒。

1.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液 ①M(fèi)，S培養(yǎng)基：MgS04·7H20 2.5 g/L、KH2P04 2.7 g/L、胰化蛋白胨1.0 g/L、酵母提取物1.0 g/L、蔗糖10.0g/L、氯霉素250.0mg/L、瓊脂粉20.0 g/L。②誘導(dǎo)培養(yǎng)基：K，HPO4 4.0 g/L、MgS04·7H20 2.0g/L、CaCl2·2H20 0.3 g/L、FeCl3 10.0 mg/L、葡萄糖50.0 mmol/L，pH4.0或者pH7.0。③再生（REG）培養(yǎng)基：甘露醇145.7g/L、酵母提取物4.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L（固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉16.0 g/L）。④豌豆汁培養(yǎng)基：取1L的大燒杯，加入從超市購(gòu)買的冷凍豌豆至400 ml處左右，加蒸餾水至500 ml，高壓滅菌使豆子軟化，待冷卻后將豌豆搗碎，用Microcloth過濾，過濾后約得到250 ml豌豆汁，分裝至50 ml離心管，13000 r/min離心20 min后取上清液，再次滅菌，備用。⑤電擊緩沖液（pH7.5）：甘露醇9. 109 g/L、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）0.238 g/L。

1. 1.3抗生素及主要試劑潮霉素B（Hyg B）購(gòu)自Roche Diagnostics公司，基因組DNA提取試劑盒、Prime ScriptTM RT reagent Kit（ Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶（NotI）及PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa公司.RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司.DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。引物的合成與測(cè)序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。含有潮霉素（HYG）抗性基因的中間入門載體（Entry clone）由以色列農(nóng)業(yè)研究組織凡卡尼研究中心DOV PROSKY實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基及緩沖液中的常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 C.gloeosporioides的培養(yǎng)及繼代方法 用M3S培養(yǎng)基進(jìn)行各菌株的常規(guī)繼代培養(yǎng)和保存。菌絲的離體初培養(yǎng)：將lxl06 CFU/ml的各菌株孢子接種于40 ml液體M，S培養(yǎng)基中，在26—28 aC條件下150r/min振蕩培養(yǎng)3d。進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，將初培養(yǎng)3d的菌絲體清洗過濾后轉(zhuǎn)移至40 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，然后在同樣條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。以上操作均在超凈臺(tái)中進(jìn)行。收集各菌絲樣品置液氮中速凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 C.gloeosporioides在離體致病過程中CgCDA3的表達(dá)檢測(cè) 將離體培養(yǎng)3d的膠孢炭疽菌的菌絲，誘導(dǎo)培養(yǎng)2d的孢子及玻璃平板孵育8h和12 h的萌發(fā)態(tài)孢子和附著胞4個(gè)時(shí)期的材料，液氮速凍，按照柱式真菌RNAout試劑盒使用說明提取RNA。采用Bio-RadiCycler CFX96Touch Deepwell儀和SYBR Premix Ex Taq試劑盒，按照說明書進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，比較分析C.gtoeosporioides在離體培養(yǎng)的4個(gè)時(shí)期CgCDA3基因的表達(dá)量，以18SrRNA為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.3 C.gloeosporioides的果實(shí)接種及致病力檢測(cè) 挑選果形、果實(shí)大小和成熟度一致的芒果果實(shí)，自來水清洗并進(jìn)行果實(shí)表面浸泡消毒處理，晾干備用。在果實(shí)表面創(chuàng)傷深2—3 mm、直徑10 mm的傷口，將菌株孢子液稀釋至lxl06 CFU/ml，取10μl滴加在創(chuàng)口上。然后置于室溫（22±3）℃、相對(duì)濕度（ RH）90%的環(huán)境下，定期觀察發(fā)病情況，測(cè)量芒果果實(shí)的病斑直徑。每個(gè)處理的果實(shí)數(shù)為8個(gè)，試驗(yàn)重復(fù)3次。在分析CgCDA3基因在C.gloeosporioides活體侵染過程中的表達(dá)量時(shí)，以接種傷口為中心，取直徑40 mm大小的芒果果皮組織，液氮速凍后保存。取樣時(shí)間分別為：接種病原菌后22 h、48 h、3d、Sd、6d。CTAB法提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRPremix Ex Taq試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，以芒果A ctin，為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.4 孢子萌發(fā)及附著胞形成的檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)方法

菌株在M3S液體培養(yǎng)基中150 r/min、28℃培養(yǎng)3d，抽真空過濾后轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2d，4層紗布過濾收集孢子，離心后用滅菌水洗滌定容，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對(duì)孢子計(jì)數(shù)。將孢子濃度稀釋至lxl05 CFU/ml，滴加10μl孢子液于干凈的載玻片上，28℃黑暗高濕條件下誘導(dǎo)其萌發(fā)，培養(yǎng)8h和12 h后顯微鏡下分別觀察統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率和附著胞形成率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 C.gloeosporioides的CgCDA3基因敲除策略

CgCDA3基因的敲除策略見圖l。以膠孢炭疽菌基因組DNA為模板，首先利用引物對(duì)l和2、3和4（表1）分別擴(kuò)增CgCDA3基因的5端和3'端側(cè)翼序列。將獲得的5端和3端側(cè)翼序列分別進(jìn)行凝膠回收純化，分別依次通過BP反應(yīng)連接到載體pDONRrMP4-Plr和pDONRrMP2r-P3，形成5端和3端的Entry clone。通過抗生素篩選、PCR鑒定及序列測(cè)定后挑選陽性的5'端和3'端的Entry clone，提取5端和3端陽性及含HYG抗性基因的Entryclone質(zhì)粒DNA，然后將其與pDESTTM R4-R3載體通過IR反應(yīng)生成用于轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒。采用抗生素、PCR鑒定及序列測(cè)定篩選正確的重組質(zhì)粒。最后獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提和純化后用NotI酶切回收線性重組質(zhì)粒，用于野生型C.gloeosporioides的電擊轉(zhuǎn)化。

1.2.6 C.gloeosporioides感受態(tài)的制備及電擊轉(zhuǎn)化參考Robinson等的方法制備電擊感受態(tài)C.gloeosporioides。首先收集在M3S固體平板上生長(zhǎng)14 d的野生型孢子，然后加入到碗豆汁培養(yǎng)基中.28℃下200 r/min預(yù)培養(yǎng)2.5～3.0 h。預(yù)培養(yǎng)后的孢子用預(yù)冷的電擊緩沖液洗滌3次，再用電擊緩沖液濃縮至100μl。電擊時(shí)將電擊緩沖液中的100μl孢子轉(zhuǎn)入電擊杯中，立即加入lμg經(jīng)NotI酶切后的線性重組質(zhì)粒，然后在電擊儀（Gene Pulser Xcell）上立即進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電擊條件為電壓1.4 kV，電容25μF，電阻800 Q，時(shí)間常數(shù)（Time constant）16—18 ms。電擊后立即加入1/20體積的預(yù)冷碗豆汁培養(yǎng)基，混勻后涂布至含100μg/ml潮霉素B的REG固體篩選平板上，室溫培養(yǎng)3～4 d后進(jìn)行抗性突變體的篩選、純化和鑒定。

1.2.7 抗性突變體的篩選鑒定 將在篩選平板上生長(zhǎng)出的單菌落（候選陽性基因缺失突變株）分別轉(zhuǎn)至含100μg/ml潮霉素B的M3S固體培養(yǎng)基上，待菌圈擴(kuò)展至足夠大時(shí)，分別提取各候選株的菌絲基因組DNA。以各候選株的基因組DNA為模板，采用表l中的引物對(duì)l和2、5和7分別擴(kuò)增5端側(cè)翼序列及其兩端各約100 bp的片段，采用引物對(duì)3和4、6和8分別擴(kuò)增3端側(cè)翼序列及其兩端各約100 bp的片段。能同時(shí)擴(kuò)增出與5和3端目的片段大小一致的條帶，且經(jīng)序列測(cè)定后與目的片段序列一致的菌株即為CgCDA3基因缺失突變株。一次電擊轉(zhuǎn)化可獲得多個(gè)正確的相應(yīng)基因缺失突變株，本研究隨機(jī)選取其中2個(gè)（△CgCDA3-2和△CgCDA3-3）進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)用SPSS 13.O和Ex-cel進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CgCDA3基因的序列分析及同源比對(duì)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的CgCDA3基因片段序列，利用同源檢索、聚類、序列延伸等方法從C.gloeosporioides基因組中獲得CgCDA3基因全長(zhǎng)（結(jié)果未顯示）。進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，CgCDA3基因含有完整的開放閱讀框（ORF），ORF全長(zhǎng)1470 bp，預(yù)測(cè)編碼含489個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，位于基因組Contig 00117。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)N端含有CE4_SF/CICDA結(jié)構(gòu)域，存在于第289～ 440位氨基酸處（圖2），占整個(gè)蛋白質(zhì)序列的30%以上。這是菜豆炭疽菌（Colletotrichum lindemuthLanum）幾丁質(zhì)脫乙酰酶具有的典型結(jié)構(gòu)，具有催化活性，與苜蓿根瘤菌（S.meliloti）的NodB結(jié)構(gòu)域同源，屬于Carbohydrateesterase 4（CE4）超級(jí)家族成員。

將該基因編碼的氨基酸序列提交NCBI進(jìn)行BLASTP同源比對(duì)，結(jié)果表明該CgCDA3蛋白質(zhì)與已發(fā)表的西瓜炭疽菌C.orbiculare（ENH86782）、禾生炭疽菌C.gramin，icda（XP-008096791.1）和睡蓮炭疽菌C.n，ymphaeae（KXH27886.1）的乙酰幾丁質(zhì)蛋白質(zhì)同源性較高，同源性分別為63%、60%和80%（圖3）。

2.2 Cg CDA3基因在C.gloeosporioides離體生長(zhǎng)及活體侵染過程中的表達(dá)

對(duì)C.gloeosporioides孢子（Spore）、萌發(fā)期孢子（G-spore）、附著胞（Appressorium）、菌絲（Smyceli-um）各時(shí)期離體條件下CgCDA3基因的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR定量分析，結(jié)果（圖4）顯示，CgCDA3基因在膠孢炭疽菌離體生長(zhǎng)的不同時(shí)期都有不同水平的表達(dá)，在萌發(fā)期的孢子及附著胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為4.67和4.85，表達(dá)量最高，而在孢子和菌絲中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00和0.78，顯著降低。在C.gloeosporioides侵染芒果的致病過程中，僅在侵染致病期已感病的果皮和病斑的混合組織中檢測(cè)到CgCDA3基因的高水平表達(dá)，而在接種后至感病前的各個(gè)階段CgCDA3基因的表達(dá)水平幾乎為0（圖4）。說明CgCDA3基因表達(dá)與后期的致病力密切相關(guān)。

2.3 膠孢炭疽菌Cg CDA3基因敲除缺失突變體

要證明CgCDA3基因在C.gloeosporioides離體生長(zhǎng)及侵染果實(shí)致病過程中的作用，獲得其基因缺失突變體是最直接的證據(jù)。因此，我們通過基因敲除策略，用潮霉素B抗性基因替換CgCDA3基因ORF獲得2個(gè)基因缺失突變菌株，分別為△cda3-2和△cda3-3。以各菌株的基因組DNA為模板，用引物對(duì)6、8和引物對(duì)5、7分別從潮霉素B抗性基因序列兩端擴(kuò)增3端和5端側(cè)翼序列，結(jié)果（圖5）顯示，在野生型菌株及純水對(duì)照中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，而在CgCDA3基因缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3中，3端和5端分別擴(kuò)增出大于500 bp和1 000 bp的片段：同時(shí)用引物對(duì)3、4和引物對(duì)l、2也分別從△cda3-2和△cda3-3中擴(kuò)增出了3端和5端的相應(yīng)插入基因片段，而野生型菌株中沒有相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)擴(kuò)增的3 端和5端片段產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示，其與設(shè)計(jì)敲除CgCDA3基因時(shí)采用的同源重組片段序列完全一致。另外，與野生型相比較，缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3中CgCDA3基因的表達(dá)量幾乎為0（圖5）。PCR擴(kuò)增測(cè)序及基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果證明△cda3-2和△cda3-3兩個(gè)菌株中的CgCDA3基因被潮霉素B抗性基因取代，為CgCDA3基因缺失突變菌株。

2.4 CgCDA3基因缺失突變體在培養(yǎng)基上的菌圈生長(zhǎng)變化

圖6顯示CgCDA3基因缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3在添加150μg/ml潮霉素B的M3S培養(yǎng)基上，菌圈可正常生長(zhǎng)擴(kuò)展，一定時(shí)間后產(chǎn)生分生孢子，而野生型C.gloeosporioides菌圈擴(kuò)展至直徑3 cm左右時(shí)即停止生長(zhǎng)，產(chǎn)孢過程也被抑制，表明突變株具有潮霉素B的抗性。在不含潮霉素的M3S培養(yǎng)基上，CgCDA3基因缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3的生長(zhǎng)速率與野生型無差異，菌圈可正常生長(zhǎng)擴(kuò)展。說明潮霉素B抗性基因取代CgCDA3基因造成的缺失對(duì)C.gloeosporioides的離體生長(zhǎng)、菌圈擴(kuò)展和產(chǎn)孢過程沒有明顯影響。

2.5 CgCDA3基因缺失突變體的孢子萌發(fā)與附著胞形成變化

離體條件下培養(yǎng)C.gloeosporioides獲得的孢子在28 cC孵育8h和12 h分別觀察孢子萌發(fā)和附著胞形成情況。結(jié)果（圖7）顯示，野生型的孢子萌發(fā)率為85.9%，CgCDA3基因缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3的孢子萌發(fā)率分別為59.6%和63.4%，與野生型相比較分別下降了26.3個(gè)百分點(diǎn)和22.5個(gè)百分點(diǎn)：野生型C.gloeosporioides萌發(fā)的孢子分化形成附著胞的比率為73.38%，而CgCDA3基因缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3的附著胞形成率明顯下降，分別下降至50.51%和51.53%。與野生型相比，CgCDA3基因缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率均明顯降低，說明CgCDA3基因參與C.gloeosporioides孢子萌發(fā)和附著胞形成。

2.6 CgCDA3基因缺失突變體對(duì)芒果果實(shí)的致病力變化

對(duì)芒果進(jìn)行創(chuàng)傷接種膠孢炭疽菌，在果實(shí)的左側(cè)創(chuàng)傷接種野生型菌株作對(duì)照，右側(cè)接種缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3，在接種后的不同時(shí)間觀察統(tǒng)計(jì)病斑直徑變化。結(jié)果（圖8）顯示，接種后第6d野生型菌株侵染誘導(dǎo)的病斑直徑平均擴(kuò)大至6.93cm，而△cda3-2侵染誘導(dǎo)的病斑直徑平均值為2.42cm，與野生型比較降低達(dá)65.1%，差異顯著，缺失突變菌株△cda3-3的病斑直徑也呈現(xiàn)同樣的變化趨勢(shì)。在另一個(gè)重復(fù)的基因缺失單細(xì)胞株系中，CgCDA3基因的缺失導(dǎo)致C.gloeos-porioides致病性降低46%。CgCDA3基因缺失突變菌株△cda3-2和△cda3-3的致病力降低，說明CgCDA3基因的功能與C.gloeosporioides的侵染致病力密切相關(guān)。

3 討論

C.gloeosporioides基因組中存在3個(gè)CDA相似基因，它們?cè)谌静∶⒐は聣乃澜M織中有不同程度的表達(dá)，敲除CDA1基因?qū)甑闹虏⌒詻]有顯著影響，說明不同CDA基因的功能存在差異，CDA2和CDA3基因可能對(duì)其致病性起關(guān)鍵功能作用。本研究對(duì)其中的CgCDA3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示編碼的氨基酸序列N端含有催化真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)脫乙?；癁闅ぞ厶堑腃ICDA結(jié)構(gòu)域，這也是魯氏毛霉（M. rouxii）、釀酒酵母（S.cer-evLSLae）和菜豆炭疽菌（C.lin，demuthianum）等病原菌CDA具有的典型結(jié)構(gòu)。在這些病原真菌中，幾丁質(zhì)的脫乙?；瘜?duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和侵染致病性均有不同的作用。目前關(guān)于芒果膠孢炭疽菌CDA基因的生物學(xué)功能知之甚少。本研究通過基因敲除策略直接證明CgCDA3的缺失導(dǎo)致C.gloeosporioides孢子萌發(fā)和附著胞形成率降低，同時(shí)侵染芒果的致病性也顯著減弱，說明CgCDA3基因在侵染致病過程中起著重要的作用。這與菜豆炭疽菌（C.lin，demuthia-n，um）、黃瓜炭疽菌（C.lan，gen，arium）和構(gòu)巢曲霉（A.nidulans）中CDA參與致病過程的研究結(jié)果一致，這為了解CDA基因在采后病原真菌中的功能提供了新的證據(jù)。

在植物與微生物互作的研究中發(fā)現(xiàn)，植物體中幾丁質(zhì)酶是一種重要的水解酶，在植物抵抗病原菌的防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。它通過降解病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)致使病原體死亡，降解產(chǎn)生的細(xì)胞壁碎片和寡糖產(chǎn)物還具有誘導(dǎo)作用，刺激寄主植物誘發(fā)一系列抗病反應(yīng)。同時(shí)，病原菌可通過分泌產(chǎn)生CDA水解自身的幾丁質(zhì)脫去乙?；瑥亩黾蛹闹髯R(shí)別幾丁質(zhì)底物的困難，并降低寄主幾丁質(zhì)寡糖的激發(fā)子活性，繼而拮抗寄主中的幾丁質(zhì)酶。在病原菌侵染部位乙?；膸锥≠|(zhì)由于病原菌CDA的產(chǎn)生快速脫乙酰化，病原真菌的幾丁質(zhì)乙酰化程度影響植物細(xì)胞的抗性功能。為了了解C.gloeosporioides侵染致病過程中宿主幾丁質(zhì)酶活性變化，我們預(yù)試驗(yàn)中檢測(cè)了芒果果實(shí)幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)的變化，但結(jié)果并無規(guī)律可循。說明病原菌CDA水解自身幾丁質(zhì)以抵抗宿主的防御反應(yīng)及與宿主幾丁質(zhì)酶的水解產(chǎn)生抗性之間存在非常復(fù)雜的相互作用關(guān)系，可進(jìn)一步采用生理生化手段直接觀察病原菌幾丁質(zhì)的脫乙?；潭扰c植物的抗性和病原菌致病力的關(guān)系，以明確CgCDA3是否通過脫乙?；陨韼锥≠|(zhì)以抵抗寄主的防御反應(yīng)而參與致病力的形成。本研究CgCDA3基因缺失突變體與野生型相比，生長(zhǎng)及產(chǎn)孢正常，但孢子萌發(fā)和附著胞形成能力下降，因此至少可以推測(cè)CgCDA3基因參與調(diào)控膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)和附著胞形成等生長(zhǎng)和形態(tài)建成過程，從而促進(jìn)其致病性產(chǎn)生。