全基因組關(guān)聯(lián)分析大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的孟德?tīng)栯S機(jī)化方法探究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的因果關(guān)聯(lián)

許立碩，葛翠翠，劉晨光

（1. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院急診與黏膜病科，長(zhǎng)春 130021；2. 吉林省人民醫(yī)院口腔科，長(zhǎng)春 130021）

牙周炎（periodontal disease，PD）是口腔最常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，是造成牙齒脫落的主要原因[1]。牙周炎主要受齦下菌斑生物膜的影響，誘導(dǎo)宿主促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，從而引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙槽骨的吸收及牙齒的脫落[2]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以慢性、對(duì)稱性、炎癥性和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，其特征是發(fā)病率及致殘率較高、早期癥狀不典型，常可導(dǎo)致漸進(jìn)性殘疾，引發(fā)多種長(zhǎng)期并發(fā)癥[3]。據(jù)報(bào)道，牙周炎可能會(huì)影響全身的健康，大量的研究已經(jīng)證明牙周炎與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4]，動(dòng)脈粥樣硬化[5]，阿爾茲海默癥[6]，慢性阻塞性肺炎[7]等某些全身性疾病關(guān)系密切。

有研究[8]表明，盡管類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎的病因不同，但兩者在發(fā)病機(jī)制方面相似。其表現(xiàn)的慢性炎癥在適應(yīng)性免疫表型、促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間的不平衡方面以及在吸煙和遺傳方面的作用相似，PGE2、IL-1、TNF-α 等這些細(xì)胞因子能使組織發(fā)生破壞，釋放炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致這兩種疾病在骨骼破壞方面具有相似性[9-10]。因此，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎之間可能存在雙向相互關(guān)系。

已經(jīng)有研究[11-12]表明牙周炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)因素，其中的聯(lián)系首先表現(xiàn)在牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）中，P. gingivalis 是牙周炎的致病菌之一，是一種革蘭氏陰性厭氧菌，特征是存在肽酰精氨酸脫氨酶（PAD），這種酶通過(guò)催化瓜氨酸化來(lái)促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)育，瓜氨酸化是一種翻譯后修飾，在生產(chǎn)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（ACPA）方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而ACPA 則被廣泛認(rèn)為是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。此外，大量的回顧性研究證明了牙周炎與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之間存在著密不可分的關(guān)系。Pischon 等發(fā)現(xiàn)，與健康患者相比，牙周炎患者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患病率更高[13]。一項(xiàng)Meta 分析表明，與健康對(duì)照組相比，牙周炎患者患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)更高[14]。

但值得注意的是，在過(guò)去的研究中，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是否影響牙周炎疾病的報(bào)道并不是很多，SHAILESH[15]曾經(jīng)研究得出印度人中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者患牙周炎的幾率更高。在尼泊爾三級(jí)醫(yī)院中，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的牙周炎患病率為86.04%[16]。然而這些結(jié)論主要來(lái)自病例對(duì)照或隊(duì)列研究，隨機(jī)對(duì)照等高質(zhì)量研究卻很少，因此效果估計(jì)容易產(chǎn)生偏差。由于傳統(tǒng)觀察設(shè)計(jì)的內(nèi)在弱點(diǎn)，依舊無(wú)法確定類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎發(fā)病之間是否存在因果關(guān)系。

傳統(tǒng)的回顧性流行病學(xué)調(diào)查方式，往往易引起反向因果關(guān)系和潛在混雜因素的影響，從而降低了其論證病因假說(shuō)的能力。孟德?tīng)栯S機(jī)化（Mendelian randomization，MR）利用遺傳變異的自然隨機(jī)分配，避免了潛在的混雜因素，為判斷暴露因素與結(jié)局之間的因果關(guān)系提供了新的思路[17]。在本研究中，設(shè)計(jì)了一項(xiàng)兩樣本MR 研究來(lái)分析全部遺傳數(shù)據(jù)，以調(diào)查東亞人群中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎疾病之間的潛在因果關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)

本研究是一項(xiàng)兩樣本MR 研究，使用GWAS公開(kāi)匯總統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎是否存在因果關(guān)系。以GWAS 公開(kāi)發(fā)布的人類基因組信息為參照基礎(chǔ)，篩選出了與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)具有重要統(tǒng)計(jì)價(jià)值的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）信息，作為基因工具變量；然后，再借助另一項(xiàng)GWAS 調(diào)查獲得了有關(guān)牙周炎的相關(guān)信息，從而確定了相關(guān)SNP 的存在；最后通過(guò)篩查出的SNP，采用多種MR 方法來(lái)推測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎疾病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系[18-21]。

1.2 相關(guān)數(shù)據(jù)來(lái)源

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎的關(guān)聯(lián)GWAS 數(shù)據(jù)分別來(lái)源于英國(guó)數(shù)據(jù)庫(kù)MRC-IEU（https：//github.com/MRCIEU）和日本數(shù)據(jù)庫(kù)BioBank Japan Project（BBJ）數(shù)據(jù)集（https：//biobankjp.org/english/index.html）。MRC-IEU 數(shù)據(jù)集中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的樣本量為22 515 名東亞人，包括4 873 例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和17 642 例對(duì)照人群。BBJ 數(shù)據(jù)集中牙周炎的樣本量為212 453 名東亞人，包括3 219 例牙周炎患者和209 234 例對(duì)照人群。

1.3 相關(guān)SNP 篩選

在MR 分析中，暴露數(shù)據(jù)集中的（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）被用作工具變量（Instrumental variable，IV）。IV 應(yīng)滿足以下三個(gè)基本假設(shè)：1）IV 與暴露密切相關(guān)；2）IV 與任何潛在的混雜因素?zé)o關(guān)； 3）除了通過(guò)暴露方式外，IV 與結(jié)果無(wú)關(guān)。從GWAS 公開(kāi)匯總數(shù)據(jù)中選擇的SNP 應(yīng)該具有全基因組顯著性（GWAS P value ＜ 5×108）且次要等位基因頻率＞0.01。 為了從GWAS中識(shí)別獨(dú)立變異，去除了這些SNP 中的連鎖不平衡（R2＜ 0.001 and distance ＞ 10 000 kb），聚集剩余的SNP[22]。使用F 統(tǒng)計(jì)值評(píng)估每個(gè)SNP 的強(qiáng)度（F-statistic= R2 ×（N-2）/（1-R2），R2 = 2×（Beta）2× EAF×（1-EAF）/[2 ×（Beta）2× EAF ×（1-EAF）+ 2 ×（SE）2× N × EAF ×（1-EAF）]，N 代表暴露GWAS 研究的樣本數(shù)，R2是IV 解釋暴露的程度（回歸方程的決定系數(shù)），Beta 代表每個(gè)SNP 和表型關(guān)聯(lián)的每個(gè)等位基因效應(yīng)大小，SE 代表Beta的標(biāo)準(zhǔn)差，EAF 代表效應(yīng)等位基因頻率）[23]。F 統(tǒng)計(jì)值＜10 的SNP 將被刪除[24]。本MR 研究中只研究了暴露和結(jié)果GWAS 數(shù)據(jù)集中都存在的SNPs，不包括代理SNPs[25-26]。最終篩選出13 個(gè)SNP：分別為rs10821944、rs10946216、rs11889341、rs17427599、rs2240339、rs2244020、rs2856821、rs3734708、rs3819720、rs449635、rs58667488、rs909267、rs9494892，納入SNP 的具體信息見(jiàn)表1。

表1 與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎相關(guān)的SNP 的基本特征

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Wald 比率來(lái)估計(jì)每個(gè)IV 的因果效應(yīng)，然后采用逆方差加權(quán)（inverse variance weighted，IVW）方法整合每個(gè)IV 的效應(yīng)大小來(lái)估計(jì)暴露對(duì)結(jié)果的總體因果效應(yīng)（P＜0.05）[24]。采用敏感性分析作為IVW方法的補(bǔ)充，包括多效性檢驗(yàn)、異質(zhì)性檢驗(yàn)、逐個(gè)剔除檢驗(yàn)。多效性檢驗(yàn)主要檢驗(yàn)多個(gè)IV 是否存在水平多效性，常用MR-Egger 法的截距項(xiàng)表示，如果該截距項(xiàng)與0 差異很大，說(shuō)明存在水平多效性（P＜0.05）[23，27]。異質(zhì)性檢驗(yàn)主要是檢驗(yàn)各個(gè)IV 之間的差異，IVW 方法中的Cochran's Q 值用于評(píng)估異質(zhì)性（P＜0.05），如果不同IV 之間的差異很大，則異質(zhì)性就越大，低異質(zhì)性為因果效應(yīng)提供了更高的可靠性[28-29]。逐個(gè)剔除檢驗(yàn)主要是計(jì)算逐個(gè)剔除某一個(gè)IV 后剩下IV 的MR 結(jié)果，若剔除某個(gè)IV 后其它IV 估計(jì)出來(lái)的MR 結(jié)果和總結(jié)果差異很大，那么說(shuō)明MR 結(jié)果對(duì)該IV 是敏感的[30]。若不存在水平多效性和異質(zhì)性則采用IVW 方法的效應(yīng)估計(jì)作為主要效應(yīng)量；若存在異質(zhì)性，則采用加權(quán)中值方法的效應(yīng)估計(jì)作為主要效應(yīng)量，加權(quán)中值法是利用大部分SNP來(lái)判斷因果關(guān)系的有無(wú)[31]；若存在水平多效性，則采用MR-Egger 方法的效應(yīng)估計(jì)作為主要效應(yīng)量[24]。

所有統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)可視化均在R 軟件（version 4.0.0）中進(jìn)行。使用“Two Sample MR” package 進(jìn)行單變量MR 分析（version 0.5.6）。

2 結(jié)果

2.1 效應(yīng)分析

森林圖（圖1）顯示，IVW 分析結(jié)果顯示兩種疾病存在因果關(guān)系，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是牙周炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素（OR = 0.931，95%CI 0.886 - 0.978，P= 0.005）；為排除混在因素的影響，使用MRegger 回歸方法評(píng)估水平多效性，發(fā)現(xiàn)不存在水平多 效 性（egger-intercept= -0.005，P= 0.821）。 然后進(jìn)行了異質(zhì)性分析，結(jié)果顯示不存在異質(zhì)性（P=0.168），由此說(shuō)明遺傳多效性不會(huì)對(duì)本研究結(jié)果造成偏倚，結(jié)果可靠穩(wěn)定。

圖1 MR-Egger 回歸法以及IVW 法估計(jì)SNP 相關(guān)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎森林圖

加權(quán)中值法和MR-Egger 回歸法的結(jié)果見(jiàn)表2。為觀察每種評(píng)估方法結(jié)果的一致性，通過(guò)散點(diǎn)圖（圖2）來(lái)表示，根據(jù)直線斜率判斷，IVW 法、MREgger 法和加權(quán)中值法的因果關(guān)聯(lián)估計(jì)相近，說(shuō)明MR 結(jié)果是準(zhǔn)確的。

表2 IVW、MR-Egger、WME 回歸的OR 估計(jì)值及其95%CI

圖2 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎的遺傳相關(guān)性的散點(diǎn)圖

2.2 敏感性分析

在本次研究中，通過(guò)留一法來(lái)進(jìn)行敏感性分析。在每次去除1 個(gè)SNP 后，將剩余的12 個(gè)SNP 作為基因工具變量再進(jìn)行IVW 效應(yīng)分析，進(jìn)而判斷單獨(dú)的SNP 是否會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生影響。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)OR 值均＞1，即本次研究中沒(méi)有對(duì)因果估計(jì)結(jié)果產(chǎn)生較大影響的SNP。見(jiàn)圖3。

圖3 留一法敏感性分析結(jié)果

3 討論

本研究利用大規(guī)模的GWAS 匯總數(shù)據(jù)及IEU 和BBJ 匯總數(shù)據(jù)，通過(guò)兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化的方法探究了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的因果關(guān)聯(lián)，是首次且最大量的研究來(lái)評(píng)估東亞人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)系的研究。使用三種不同的估計(jì)方法（IVW、Weighted median 法、MREgger 回歸法）進(jìn)行MR 分析。研究顯示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是牙周炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素。

在2012 年之前，有學(xué)者已經(jīng)發(fā)表了一些隊(duì)列研究來(lái)調(diào)查類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎之間的關(guān)系。在2000－2012 年間發(fā)表的8 篇橫斷面研究中，只有一項(xiàng)研究[32]顯示兩者是負(fù)面關(guān)系，其余7 項(xiàng)報(bào)告均顯示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者患牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)和流行率較高，反之亦然。另一項(xiàng)研究評(píng)估了美國(guó)退伍軍人中，與骨關(guān)節(jié)炎患者相比，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的牙周炎更常見(jiàn)且更嚴(yán)重[33]。但有一項(xiàng)孟德?tīng)栯S機(jī)化研究的結(jié)果與本研究的結(jié)果存在矛盾，其研究發(fā)現(xiàn)歐洲人群中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎無(wú)明顯因果關(guān)系，反向亦之，分析這可能是由于研究人群種族的不同而導(dǎo)致的差異[34]。本研究結(jié)果可能不適于其他種族，因此未來(lái)的研究需要更大規(guī)模的GWAS 匯總數(shù)據(jù)和更多不同種族的分析。

大量研究也從不同方面對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎之間的聯(lián)系進(jìn)行分析。在遺傳生物標(biāo)志物方面，高多態(tài)性HLA-DRB1 位點(diǎn)（所謂的共享表位-SE）是參與兩種疾病發(fā)展的最強(qiáng)遺傳因素[4]，攜帶rs2237892T 等位基因的人可能同時(shí)患有這兩種疾病[35]。在炎癥生物標(biāo)志物方面，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎患者都表現(xiàn)出高水平的IL1β，IL6，MMPs和TNF-α。這種促炎細(xì)胞因子表達(dá)的增加可以刺激STAT3 激活，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎的病理生理學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]。在自身抗體方面，有證據(jù)表明，牙周病原菌P. gingivalis 和伴放線放線桿菌（A.actinomycetemcomitans）是目前參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周炎發(fā)病機(jī)制的兩種最重要的微生物，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物-抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（ACPA）增加有關(guān)[8，11-12]。

本研究通過(guò)兩樣本法孟德?tīng)栯S機(jī)化分析，探究了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的因果關(guān)聯(lián)，本研究成果具備以下一些優(yōu)勢(shì)：1）本研究成果所納入的數(shù)據(jù)集總共包含超過(guò)23 萬(wàn)樣本例數(shù)，大樣本數(shù)據(jù)使得統(tǒng)計(jì)學(xué)的效果更強(qiáng)；2）本研究成果采用了多種MR 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以及其他敏感性分析方法，其準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)結(jié)果提高了數(shù)據(jù)的可靠性；3）與傳統(tǒng)的回顧性研究成果比較，本研究成果更有效地消除了反向因果關(guān)系及混雜因子的影響。不過(guò)，本研究結(jié)果還具有一定的特殊性：1）使用來(lái)自IEU 及BBJ 數(shù)據(jù)庫(kù)研究的大量公共數(shù)據(jù)，所納入的群體大多為東亞國(guó)家，實(shí)驗(yàn)結(jié)果能否應(yīng)用到其他種族上，待進(jìn)一步證實(shí)；2）兩樣本MR 分析結(jié)果未能對(duì)性別進(jìn)行分組，也未能了解不同性別之間致病力是否有區(qū)別；3）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與牙周炎可能的生物學(xué)機(jī)理目前仍未充分清楚，通過(guò)本分析僅能對(duì)兩者的因果關(guān)系做出初步判斷。