養(yǎng)心草體內(nèi)降血糖活性研究

劉冬雪，苗 航，張 瑞，鄭健云，林珠燦，郭素華*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350122；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006）

養(yǎng)心草為景天科景天屬植物景天三七Sedum aizoonL.的全草［1］，又名費菜，亦有養(yǎng)生草、土人參之稱，產(chǎn)于四川、湖北、江西、安徽、貴州、浙江等地［2］。最早見于《救荒本草》［3］，其味酸，性平，無毒，歸心、脾、肝經(jīng)，有活血、止血、寧心等功效，主治跌打損傷、中風(fēng)等。目前已有對養(yǎng)心草成分如總多酚［4］、總黃酮［5］及總酚酸［6］提取工藝的研究及養(yǎng)心草提取物制備［7］的研究?，F(xiàn)代藥理研究表明，養(yǎng)心草具有烏發(fā)、生發(fā)［8］、舒緩皮膚抗刺激［9］、治療心腦血管疾?。?0］、體外抗癌［11］、抗氧化［6］、改善糖脂代謝、器官指數(shù)［12］等作用。本課題組重點研究養(yǎng)心草降血糖活性，而現(xiàn)代中藥提取多為水提取或醇提?。?3］，且降血糖研究也多用水提物或醇提物［14?18］。故本實驗通過養(yǎng)心草水提物及醇提物干預(yù)2 型糖尿病小鼠來探究其降血糖作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2017?0005。

1.2 實驗藥材 養(yǎng)心草全草植物，產(chǎn)地為福建連城，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室車蘇容老師鑒定，品種定為Sedum aizoonL.。

1.3 實驗試劑 鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）［酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司，批號：LT361251］；檸檬酸鈉（廣州市裕興泰貿(mào)易有限公司）；檸檬酸（蘇州市尊斕工貿(mào)有限公司）；鹽酸二甲雙胍片（貴州圣濟堂制藥有限公司，批號：H52020955）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high?density lipoprotein cholesterol，HDL?C）、低密度脂蛋白膽固醇（low?density lipoprotein cholesterol，LDL?C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、肝臟組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malo?ndialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；胰島素、腎上腺素試劑盒（武漢利萊瑞特生物科技有限公司）；高脂飼料（北京峁思倍科生物科技有限公司，批號：HD001）。

1.4 實驗儀器 TSW?12 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海喆圖科學(xué)儀器有限公司）；PHS?3E 精密pH 計（奧淇科化醫(yī)療應(yīng)鏈管理服務(wù)有限公司）；TGL?18C 高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GH?202 精密電子天平（廣州市艾安得儀器有限公司）；多功能酶標儀（奧地利Tecan 公司）；GA?3 三諾血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）。

2 實驗方法

2.1 養(yǎng)心草醇提物和水提物制備 稱取養(yǎng)心草4 kg，適當(dāng)剪碎后，按液料比8∶1 加入95%乙醇，浸泡過夜，次日90 ℃加熱回流提取3 次，2 h/次，合并提取液，抽濾，低溫減壓濃縮至干浸膏，即得養(yǎng)心草醇提物，密封后冷藏備用。將醇提后的藥渣揮發(fā)至無醇味，按液料比15∶1 加蒸餾水，90 ℃加熱回流提取3 次，2 h/次，合并提取液，抽濾，低溫減壓濃縮至干浸膏，即得養(yǎng)心草水提物，密封后冷藏備用。

2.2 造模 70 只C57/BL 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，記錄體質(zhì)量，隨機分為正常組8 只和造模組62 只。采用高脂飲食聯(lián)合注射STZ 溶液建立2 型糖尿病小鼠模型。正常組予普通飼料喂養(yǎng)，造模組予高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)28 d后，禁食12 h，造模組小鼠按60 mg/kg一次性腹腔注射STZ溶液（0.1 mol/L檸檬酸?檸檬酸鈉緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，冰浴操作），正常組予等劑量腹腔注射檸檬酸?檸檬酸鈉緩沖液，連續(xù)注射3 d。剪尾測小鼠空腹血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L為造模成功。

2.3 分組和干預(yù) 造模成功小鼠共51 只（成模率約82%），隨機選取48 只，血糖穩(wěn)定1 周后，將成模小鼠隨機分為模型組、陽性組、養(yǎng)心草水提物低劑量組（簡稱水提低劑量組）、養(yǎng)心草水提物高劑量組（簡稱水提高劑量組）、養(yǎng)心草醇提物低劑量組（簡稱醇提低劑量組）、養(yǎng)心草醇提物高劑量組（簡稱醇提高劑量組），每組8 只。其中模型組及正常組按5 mL/（kg·d）予蒸餾水灌胃，陽性組按150 mg/（kg·d）予二甲雙胍灌胃；水提、醇提高劑量組按600 mg/（kg·d）分別予養(yǎng)心草水提物及醇提物灌胃，水提、醇提低劑量組按200 mg/（kg·d）分別予養(yǎng)心草水提物及醇提物灌胃。每日上午給藥1 次，連續(xù)給藥6 周，注意小鼠飼養(yǎng)環(huán)境整潔衛(wèi)生。

2.4 樣品收集與檢測

2.4.1 血糖測定 取小鼠尾尖血滴于試紙上，10 s后讀數(shù)，給藥后，每3 d 測1 次空腹血糖，每只小鼠測3 次取平均值，每組小鼠血糖平均值視為該組小鼠每周血糖值。

2.4.2 口服糖耐量（OGTT）和曲線下面積（AUC）測定 給藥結(jié)束前1 d，測定各組小鼠空腹血糖，并灌胃40%葡萄糖液（2 g/kg），于0、30、120 min 檢測血糖值，計算曲線下面積（AUC）值。

AUC＝（Glu0min＋Glu30min）×0.25＋（Glu30min＋Glu120min）×0.75

2.4.3 血脂指標、胰島素、腎上腺素含量測定 末次給藥結(jié)束后，禁食12 h，測定小鼠體質(zhì)量及血糖值后，取眼球血，于4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，取上清液于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂孟鄳?yīng)試劑盒測定小鼠血清中TC、TG、LDL?C、HDL?C、胰島素、腎上腺素含量。

2.4.4 肝臟組織SOD、MDA 活力測定 取眼球血后，處死小鼠，取小鼠肝臟，生理鹽水處理后保存于?80 ℃冰箱中，并用相應(yīng)試劑盒測定大鼠肝臟中SOD、MDA 活力。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則用LSD?t法，不齊則用Games?Howell 法。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié) 果

3.1 7 組小鼠空腹血糖比較 與正常組比較，模型組小鼠血糖顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥6 周時，陽性組、醇提高劑量組、醇提低劑量組及水提高劑量組小鼠血糖顯著降低（P＜0.01）。見表1。

表1 7 組小鼠空腹血糖比較（±s）mmol/L

表1 7 組小鼠空腹血糖比較（±s）mmol/L

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組陽性組醇提低劑量組醇提高劑量組水提低劑量組水提高劑量組n8888888第1周6.61±1.50 29.81±2.151）29.73±3.25 29.34±4.42 26.64±4.40 26.39±4.99 26.55±5.53第2周6.28±1.14 30.25±1.721）21.26±1.502）27.34±4.77 20.34±4.832）27.01±4.58 25.46±2.182）第3周6.02±1.05 27.48±2.931）24.09±1.99 24.58±2.76 23.76±3.67 25.43±3.93 25.46±2.18第4周6.22±1.56 27.42±2.751）20.74±2.782）23.89±3.66 22.69±2.39 23.00±3.65 21.86±4.71第5周6.23±0.93 26.88±2.161）18.16±3.592）23.43±4.42 20.29±3.63 23.21±3.85 21.61±3.27第6周6.28±1.09 27.20±1.921）15.25±2.472）19.41±1.142）16.26±4.392）21.98±2.57 21.27±2.282）

3.2 7 組小鼠OGTT 和AUC 比較 與正常組比較，模型組小鼠OGTT 各時間點血糖值和AUC 值均顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組、醇提高劑量組、醇提低劑量組和水提高劑量組血糖值和AUC 值均顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 7 組小鼠OGTT 和AUC 比較（±s）

表2 7 組小鼠OGTT 和AUC 比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組陽性組醇提低劑量組醇提高劑量組水提低劑量組水提高劑量組n8888888血糖/（mmol/L）0 min 6.30±0.70 26.15±1.911）14.40±0.882）20.80±1.792）17.30±2.112）21.74±2.222）20.26±1.452）30 min 8.84±0.49 28.40±2.311）25.89±2.21 27.06±0.74 26.70±0.62 27.36±0.50 27.03±0.54 120 min 7.60±0.81 29.24±1.281）21.58±1.792）24.86±1.242）22.97±1.932）26.06±1.622）24.67±1.432）AUC/（mmol·min）16.12±0.89 56.74±2.331）45.68±2.772）50.91±0.902）48.25±1.492）52.34±1.87 50.60±1.562）

3.3 7組小鼠TG、TC、HDL?C、LDL?C 含量比較 與正常組比較，模型組小鼠的TC、TG、LDL?C 含量均顯著提高（P＜0.01），HDL?C 含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TG、TC、LDL?C 含量均顯著降低（P＜0.01），陽性組、醇提低劑量組、醇提高劑量組HDL?C 含量均顯著提高（P＜0.01）。見表3。

表3 7 組小鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C 含量比較（±s）mmol/L

表3 7 組小鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C 含量比較（±s）mmol/L

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組陽性組醇提低劑量組醇提高劑量組水提低劑量組水提高劑量組n8888888 TG 0.50±0.10 2.38±0.361）0.77±0.102）0.98±0.202）0.94±0.222）1.23±0.332）0.94±0.162）TC 3.67±0.52 10.71±0.351）5.30±0.562）7.15±1.222）5.98±1.172）7.30±0.522）7.05±0.752）HDL?C 2.73±0.49 1.74±0.191）3.45±0.272）2.93±0.602）3.11±0.342）1.96±0.15 2.35±0.37 LDL?C 0.45±0.03 1.55±0.111）0.63±0.112）0.84±0.132）0.76±0.202）1.03±0.232）0.95±0.122）

3.4 7 組小鼠血清胰島素和腎上腺素含量比較 與正常組比較，模型組小鼠胰島素和腎上腺素含量均顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組胰島素和腎上腺素含量均顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 7 組小鼠血清胰島素和腎上腺素含量比較（±s）pg/mL

表4 7 組小鼠血清胰島素和腎上腺素含量比較（±s）pg/mL

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組陽性組醇提低劑量組醇提高劑量組水提低劑量組水提高劑量組n8888888腎上腺素6.07±0.85 58.14±6.131）10.46±1.462）23.06±2.152）14.44±0.882）22.02±2.942）18.39±1.212）胰島素40.52±3.47 78.76±6.201）47.42±4.002）56.54±3.932）49.36±4.362）66.09±5.112）60.87±4.022）

3.5 7 組小鼠肝組織SOD、MDA 活力比較 與正常組比較，模型組小鼠SOD 活力明顯降低（P＜0.01），MDA 活力顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組和醇提高劑量組SOD 活力顯著提高（P＜0.01），各給藥組MDA活力均顯著降低（P＜0.01）。見表5。

表5 7 組小鼠肝組織SOD、MDA 活力比較（±s）

表5 7 組小鼠肝組織SOD、MDA 活力比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組陽性組醇提低劑量組醇提高劑量組水提低劑量組水提高劑量組n8888888 SOD/（U/mg）815.31±79.06 540.48±85.751）783.34±132.232）581.00±49.41 717.76±79.802）566.20±69.38 607.64±116.27 MDA/（nmol/mg）3.29±0.64 6.90±0.561）2.36±0.782）3.30±0.452）2.52±0.482）2.61±0.582）2.65±0.752）

4 討 論

STZ 為常用糖尿病動物模型造模藥物，其可破壞胰島β 細胞，本實驗前期采用高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗，并配合一次性腹腔注射STZ 建立2 型糖尿病模型，去除偽成模及死亡小鼠，成模率約為82%。

糖耐量測試是評價機體血糖調(diào)節(jié)功能的一種方法［19］，糖尿病小鼠葡萄糖灌胃120 min 時，模型組的血糖仍較高，但陽性組、醇提高劑量組、醇提低劑量組及水提高劑量組小鼠血糖降低，提示養(yǎng)心草醇提物及水提物可改善糖尿病小鼠的糖耐量損傷。與正常組比較，模型組小鼠TC、TG、LDL?C 增加，HDL?C 降低；與模型組比較，各給藥組TG、TC、LDL?C 含量降低，陽性組、醇提低劑量組、醇提高劑量組HDL?C 含量增加，提示養(yǎng)心草醇提物及水提物可改善脂代謝。

胰島素抵抗是指病理狀態(tài)下，機體對胰島素的感應(yīng)能力減弱，即胰島素此時不能發(fā)揮其降血糖作用，一般出現(xiàn)胰島素抵抗，即表明機體血糖的吸收代謝出現(xiàn)異常，對胰島素的反應(yīng)降低［20］。腎上腺素能夠促進體內(nèi)糖原分解成葡萄糖，有升高血糖的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)養(yǎng)心草醇提物及水提物可降低糖尿病小鼠的胰島素及腎上腺素水平，提示養(yǎng)心草醇提物及水提物可改善糖尿病小鼠胰島素抵抗情況，并通過減少腎上腺素對體內(nèi)糖原的分解，而發(fā)揮降糖作用。

生物機體內(nèi)的MDA 可以在一定程度上表明組織的脂質(zhì)過氧化情況，進而從細胞層面反應(yīng)組織的損傷程度［21］，而機體內(nèi)的SOD 存在于有氧代謝的細胞中，可以幫助帶有陰離子的超氧化物轉(zhuǎn)化為氧分子和H2O2，這種清除氧自由基的能力可以在一定程度上保護細胞［22］，細胞氧化損傷會加速機體糖尿病等疾病進展。因此，MDA 活力增大或SOD 活力降低都可以表明機體的氧自由基清除效果不好。實驗結(jié)果表明，醇提高劑量組SOD 活力增加，各給藥組MDA活力均降低，提示養(yǎng)心草可通過降低MDA活力或提高SOD 活力改善糖尿病小鼠體內(nèi)自由基清除率，從而延緩糖尿病進展。

綜上，養(yǎng)心草水提物及醇提物均可不同程度改善糖尿病病理情況，而其醇提物及水提物的降糖機制仍不明確，后續(xù)可著重研究其降糖、降脂機制，為養(yǎng)心草的臨床用藥提供治療依據(jù)。