基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接模擬探析山慈菇治療骨肉瘤的潛在藥效機(jī)制

段辛威，勾偉穎，楊燕妮，鄭春松，3，陳友琴，李西海

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；4.美國(guó)凱斯西儲(chǔ)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，美國(guó) 俄亥俄州 44106；5.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種多發(fā)于兒童和青少年的原發(fā)性骨惡性腫瘤，屬于中醫(yī)學(xué)“石癰”“石疽”“石巖”等范疇。OS 的病理機(jī)制尚不完全清楚，目前臨床主要采用新輔助化療聯(lián)合保肢術(shù)進(jìn)行治療，但仍面臨化療藥物耐藥、毒副作用大等問題［1］，而中醫(yī)藥在降低化療藥物毒副作用和提高化療敏感性方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。山慈菇是獨(dú)蒜蘭或杜鵑蘭的干燥假鱗莖，其味甘、微辛、涼，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、化痰散結(jié)的功效，是臨床常用的抗腫瘤中藥之一［2］，也是治療OS 的常用藥。研究顯示，山慈菇提取物對(duì)OS 細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)具有抑制作用［3］，但其發(fā)揮作用的活性成分及其相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚，有待深入研究。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接模擬的方法，探析山慈菇治療OS 的潛在藥效機(jī)制，為揭示中藥的藥效分子、藥效靶點(diǎn)與藥效機(jī)制提供新思路。

1 方 法

1.1 山慈菇活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 選擇TC?MSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//old.tcmsp?e.com/tcmsp.php），以類藥性（oral bioavailability，OB）≥0.18 為條件，篩選山慈菇的活性成分和靶點(diǎn)［4］；從HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/7435）篩選出山慈菇活性成分，同時(shí)在2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索活性成分的靶點(diǎn)，去重后作為山慈菇的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 OS 差異基因篩選及山慈菇治療OS 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出OS 相關(guān)基因測(cè)序芯片GSE36001（OS 細(xì)胞和成骨細(xì)胞全RNA）、GSE28424（OS 細(xì)胞與成骨細(xì)胞miRNA）、GSE19276（OS 活檢組織與正常骨組織全RNA），利用log2 算法對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行整理（logFC＞1，adjP＞0.05），篩選出3 個(gè)芯片中的差異基因，將3 個(gè)芯片中的差異基因取并集，作為OS 疾病基因數(shù)據(jù)集。將山慈菇的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與OS 差異基因數(shù)據(jù)集取交集，這一部分交集基因即山慈菇治療OS 的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.3 山慈菇活性成分?OS 靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將山慈菇?OS 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 進(jìn)行可視化編輯，構(gòu)建山慈菇治療OS 的活性成分?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 導(dǎo)入山慈菇?OS 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string?db.org/），設(shè)置分析條件為默認(rèn)值，構(gòu)建PPI（protein?protein interaction，PPI）互作網(wǎng)絡(luò)后保存。采用Cytoscape 3.8.1 在PPI 網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上進(jìn)行拓?fù)浞治觯催x取介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigen?vector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity?based method centrality，LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）作為篩選條件，以參數(shù)值均不小于中位數(shù)作為篩選條件，即可得到核心網(wǎng)絡(luò)及靶點(diǎn)。

1.5 生物信息學(xué)分析 基于R 語(yǔ)言的Bioconductor軟件合集對(duì)山慈菇?OS 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，GO 選取q值排名前10 的條目繪制柱狀圖，KEGG 選取q值排名前30 的條目繪制柱狀圖，探析山慈菇治療OS 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的生物學(xué)功能和潛在調(diào)控通路。

1.6 分子對(duì)接模擬驗(yàn)證 將PPI 核心網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的活性成分作為分子對(duì)接的模擬驗(yàn)證對(duì)象，Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分的sdf 文件，ChemBio3D Ultra 14.0.0.117 將活性成分轉(zhuǎn)換為mol文件備用，PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核心靶點(diǎn)的pdf 文件，PyMOL 2.4.1 軟件去除核心靶點(diǎn)的水分子和原有配體備用，AutoDockTools?1.5.6 對(duì)靶蛋白加氫，設(shè)置對(duì)接口袋和配體的構(gòu)象、位置及方向，運(yùn)用Vina 獲得分子對(duì)接的結(jié)合評(píng)分和結(jié)合位置，一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的能量越低構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能＜0 kcal/mol 說明配體和受體可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能＜?5.0kcal/mol則表示兩者結(jié)合穩(wěn)定。

2 結(jié) 果

2.1 山慈菇中活性成分及其靶點(diǎn)篩選結(jié)果 從2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出有調(diào)控靶點(diǎn)的山慈菇活性成分20 個(gè)，對(duì)應(yīng)的調(diào)控靶點(diǎn)共96 個(gè)，見表1、圖1。

圖1 山慈菇活性成分調(diào)控靶點(diǎn)圖

表1 山慈菇活性成分

2.2 山慈菇治療OS 的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出OS 差異基因3 178 個(gè)。將96 個(gè)山慈菇調(diào)控靶點(diǎn)和3 178 個(gè)OS 差異基因取交集得到山慈菇?OS 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)43 個(gè)，即認(rèn)為這43 個(gè)靶點(diǎn)為山慈菇治療OS 的調(diào)控靶點(diǎn)，共對(duì)應(yīng)12 個(gè)活性成分，見圖2。

圖2 山慈菇-OS 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

采用Cytoscape 3.8.1 對(duì)12 個(gè)活性成分和43 個(gè)山慈菇?OS 靶點(diǎn)構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖2。作用于1 個(gè)靶點(diǎn)的化合物為loroglossin，作用于2 個(gè)及以上靶點(diǎn)的有11 個(gè)（原兒茶酸、琥珀酸、酪醇、西多糖苷、羥基酪醇、flavanthrinin、2?methoxy?9，10?dihydrophen?anthrene?4，5?diol、loroglossin、β?谷甾醇、豆甾醇、Curcumadiol），顯示出山慈菇多成分、多靶點(diǎn)地發(fā)揮抗OS 作用的特點(diǎn)。

2.3 共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選 應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)43 個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)行PPI拓?fù)浞治?，設(shè)置物種分析條件為默認(rèn)值，去除游離節(jié)點(diǎn)，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由43 個(gè)節(jié)點(diǎn)、331 條邊構(gòu)成。核心網(wǎng)絡(luò)篩選出前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin?endoperoxide synthase 2，PTGS2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、胱天蛋白酶3（caspase?3，CASP3）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（proto?oncogene tyrosine?protein kinase Src，SRC），共4 個(gè)節(jié)點(diǎn)，6 條邊，見圖3。

圖3 PPI 及其核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 生物信息學(xué)分析 對(duì)43個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG 富集分析，GO 富集結(jié)果1 518 條，其中生物進(jìn)程（biological process，BP）結(jié)果1 419 條，細(xì)胞組分（cellular component，CC）結(jié)果13 條，分子功能（molecular function，MF）結(jié)果85 條，見圖4。KEGG富集分析得到山慈菇治療OS 的相關(guān)通路共133 條，包括細(xì)胞凋亡、腫瘤壞死因子、P53 等信號(hào)通路，見圖5。

圖4 GO 富集分析圖

圖5 KEGG 富集分析圖

2.5 分子對(duì)接模擬驗(yàn)證 選取PPI 核心網(wǎng)絡(luò)上的4 個(gè)靶點(diǎn)（PTGS2、SRC、ESR1、CASP3）和對(duì)應(yīng)的9 個(gè)山慈菇活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，虛擬驗(yàn)證山慈菇活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力，通過結(jié)合自由能判斷靶蛋白與活性成分的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，結(jié)合能＜?5 kcal/mol 的共11 組，結(jié)合活性較好，結(jié)合能排名前6 的均為PTGS2 及其對(duì)應(yīng)化合物，見表2、圖6。

圖6 分子對(duì)接結(jié)果示意圖

表2 分子對(duì)接結(jié)果

3 討 論

OS 的中醫(yī)病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，正氣虧虛為本，痰濁瘀濕為標(biāo)，先天腎氣虧虛，骨失所養(yǎng)使邪毒趁虛內(nèi)侵于骨，痰瘀內(nèi)生致邪毒閉郁在骨，外感邪毒內(nèi)傷于骨，導(dǎo)致OS 發(fā)?。?］。中醫(yī)藥在OS 治療方面具有控制病灶大小、防治遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和對(duì)化療增效減毒等優(yōu)勢(shì)［6］。因此，從中醫(yī)藥篩選具有增效減毒的抗OS 活性成分是亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。山慈菇可改善腫瘤化療患者中醫(yī)癥狀和生活質(zhì)量，提高臨床療效［7］，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法研究山慈菇對(duì)OS 的藥效機(jī)制，揭示了山慈菇治療OS具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的調(diào)控特征。

對(duì)山慈菇?OS 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，山慈菇治療OS 具有多成分特點(diǎn)，羥基酪醇、柯里拉京、西多糖苷、原兒茶酸和β?谷甾醇可能是治療OS 的主要成分?？吕锢┦且环N天然單寧，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和自噬，對(duì)包括OS 細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用［8?9］。羥基酪醇可通過抑制增殖和NF?κB 介導(dǎo)的凋亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用［10?11］。仙茅苷可抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡［12］。鞣花酸通過抑制S180、H22 荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及微血管形成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［13］。原兒茶酸通過下調(diào)血紅素氧合酶1（heme oxygenase?1，HO?1）和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A/P21）促進(jìn)氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［14］。西托糖苷可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 增殖并促進(jìn)其凋亡［15］。β?谷甾醇可阻滯人肺腺癌A549細(xì)胞G2/M細(xì)胞期，并誘導(dǎo)凋亡對(duì)肝癌和肺癌發(fā)揮抗腫瘤作用［16］。因此，山慈菇可能是通過羥基酪醇、柯里拉京、仙茅苷、鞣花酸等多種成分對(duì)OS發(fā)揮治療作用。

ESR1 和Caspase?3 調(diào)節(jié)OS 細(xì)胞程序性死亡。由ESR1 編碼的雌激素受體ERα 和ERβ 位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，可調(diào)節(jié)OS 細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗腫瘤作用［17?18］。ERβ 可調(diào)節(jié)凋亡抑制蛋白（in?hibitor of apoptosis proteins，IAP）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病?2相關(guān)X蛋白（Bcl?2 assaciated X protein，Bax）、Caspase?3 和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP?ribose polymerase，PARP），并影響NF?κB/Bcl?2信號(hào)誘導(dǎo)OS細(xì)胞凋亡［19］；也可通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路和激活A(yù)MPK 通路參與自噬的誘導(dǎo)［20?21］。

PTGS2 的高表達(dá)促進(jìn)OS 細(xì)胞增殖和侵襲。PTGS2，又名COX?2，是非甾體類藥物的作用靶點(diǎn)之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)，OS 患者腫瘤組織和血液樣本中的COX?2 表達(dá)隨著惡性程度的升高而顯著增加，而抑制COX?2可顯著抑制OS的增殖和侵襲［22?24］。由SRC 編碼的非受體酪氨酸激酶Src，通過介導(dǎo)其下游的受體在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在OS 凋亡抵抗的細(xì)胞中持續(xù)活化，而抑制其活性后，可促進(jìn)OS 細(xì)胞凋亡［25?27］。故山慈菇可能通過Cas?pase?3、PTGS2、SRC、ESR1 調(diào)控OS，而分子對(duì)接模擬驗(yàn)證結(jié)果也表明，除琥珀酸外，這4 個(gè)核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的活性成分結(jié)合性良好。

GO 富集前10 的結(jié)果中，BP 富集顯示DNA?模板轉(zhuǎn)錄這一結(jié)果與核心靶點(diǎn)中JUN 同源/異源二聚體形成的AP?1 復(fù)合體這一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子功能一致，而AP?1 復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)需要CC 富集中的配體?激活轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ?特異性DNA?結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA?結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能參與；雌二醇是一種類固醇激素，BP 結(jié)果中，細(xì)胞對(duì)類固醇激素刺激的反應(yīng)以及對(duì)雌二醇的反應(yīng)表明，山慈菇可能通過這2 個(gè)進(jìn)程發(fā)揮治療作用，而核心靶點(diǎn)中雌激素受體ESR1 是這一進(jìn)程的主要信號(hào)傳遞承擔(dān)者。

KEGG 富集前30 的結(jié)果中，TNF 信號(hào)通路可以誘導(dǎo)OS 細(xì)胞凋亡。TNF 相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL 與其受體結(jié)合激活后，受體的死亡域與接頭分子Fas 相關(guān)死亡域蛋白（fas?associated with death domain，F(xiàn)ADD）相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體并激活Caspase?8 前體，Caspase?8 前體激活Cas?pase?8 隨后裂解效應(yīng)半胱氨酸酶以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［28］；P53 信號(hào)通路對(duì)OS 的調(diào)控，表現(xiàn)為p53 基因通過其蛋白過度表達(dá)抑制OS 細(xì)胞線粒體凋亡途徑［29］。這提示山慈菇通過多個(gè)細(xì)胞功能和多條信號(hào)通路發(fā)揮增效減毒的治療作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)山慈菇治療OS 的活性成分、作用靶點(diǎn)和通路進(jìn)行系統(tǒng)的探析，結(jié)合分子對(duì)接模擬驗(yàn)證核心靶點(diǎn)與活性成分的結(jié)合活性，揭示了山慈菇治療OS 多成分、多靶標(biāo)、多途徑的作用機(jī)制，提示山慈菇治療OS 的潛在活性成分可能是羥基酪醇、柯里拉京、仙茅苷、鞣花酸等；調(diào)控靶點(diǎn)可能是Caspase?3、PTGS2、SRC、ESR1；作用方式與OS 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲密切相關(guān)。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的局限性，山慈菇治療OS 的確切作用機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。