瘤背石璜來源真菌Penicillium sclerotiorum GZU-XW03-2 液體發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分研究

盧淇平，趙敏，崔輝，趙鐘祥（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)潛在藥物分子是創(chuàng)新藥物研制的重要方式之一。海洋因其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，孕育著豐富的生物資源。自2008 年以來，新發(fā)現(xiàn)的海洋天然產(chǎn)物數(shù)量每年均超過1 000 個(gè)[1]，這些化合物結(jié)構(gòu)新穎，而且具有廣泛而顯著的生物活性[2]。20 世紀(jì)60 年代頭孢菌素C 被成功開發(fā)上市，作為海洋天然產(chǎn)物重要來源之一的海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，逐漸引起了科學(xué)界的重視。青霉屬真菌（Penicilliumsp.）廣泛分布于自然界[3]，可代謝產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣且具有如抗腫瘤、抗炎、酶抑制作用等[4-6]生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已成為發(fā)掘活性化合物最具潛力的菌屬之一。

本課題組[7-9]從廣東徐聞海域的石磺科（Onchidiidae）石 磺 屬（Onchidium）動(dòng) 物 瘤 背 石 磺（Onchidium struma）的腸道內(nèi)獲得一株青霉屬真菌Penicillium sclerotiorumGZU-XW03-2，在前期的研究中，已經(jīng)從該真菌大米固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到30 余個(gè)35-二甲基苔色酸（DMOA）途徑衍生合成的雜萜類化合物和一些聚酮類化合物，藥理活性篩選中發(fā)現(xiàn)其中一些雜萜化合物表現(xiàn)出強(qiáng)于陽(yáng)性藥吲哚美辛的NO 釋放抑制活性，為先導(dǎo)化合物的篩選提供了科學(xué)依據(jù)。

為了探究不同培養(yǎng)條件對(duì)真菌代謝產(chǎn)物多樣性的影響，我們對(duì)真菌Penicillium sclerotiorumGZUXW03-2 的液體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了研究，從其乙酸乙酯部位分離得到8 個(gè)聚酮類化合物（圖1），通過理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)比分別鑒定為peniazaphilone J（1）、5-chloroisorotiorin（2）、（+）-sclerotiorin（3）、deacetylsclerotiorin（4）、isochromophiloneⅢ（5）、penazaphilone E（6）、2，4-dihyroxy-6-（5，7-dimethyl-2-oxo-trans-3-trans-5-nonadienyl）-3-methylbenzaldehyde（7）、6-（（1E，3E）-35-dimethylhepta-13-dien-1-yl）-2，4-dihydroxy-3-methylbenzaldehyde（8）。其中化合物1 為新的嗜氮酮類化合物，化合物2～8 為首次從該真菌中分離得到。

圖1 聚酮類化合物1～8 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structures of compounds 1-8

1 儀器與材料

Bruker AVANCE400 超導(dǎo)核磁共振儀，瑞士布魯克公司；AB SCIEX Triple TOFTM5600+四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜，美國(guó)AB 質(zhì)譜公司；Bruker Tensor-27紅外分光光度計(jì)，德國(guó)布魯克公司；Chirascan 圓二色譜儀，英國(guó)應(yīng)用光物理公司；POLARTRONIC HH W5 旋光儀，德國(guó)SCHMIDT+HAENSCH 公司；LC-100 半制備液相色譜儀，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；IKA-RU8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，IKA 儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-2F 單人單面超凈臺(tái)，南京貝登電子商務(wù)有限公司；HZP-250 恒溫培養(yǎng)搖床，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SQ5 10C 高壓滅菌鍋，深圳市塞亞泰克儀器設(shè)備公司。

柱層析硅膠（100～200 目、200～300 目），青島海洋化工廠；GF254 硅膠薄層板，德國(guó)默克公司；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠，日本GE 醫(yī)療集團(tuán)；RP-C18硅膠，日本春日井富士硅業(yè)有限公司；色譜甲醇，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；分析純石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇，天津致遠(yuǎn)試劑公司。

菌株采集于廣東徐聞海域的瘤背石璜Onchidium struma的胃腸道中，根據(jù)ITS 序列與BLAST 序列比對(duì)，鑒定該菌種為Penicillium sclerotiorum（GenBank：MT071304），菌種樣品保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院（菌種編號(hào)：2018-GZU-XW03-2）。

2 提取與分離

菌株液體發(fā)酵完成后，以紗布過濾發(fā)酵液，分離得到菌絲和濾液。菌絲體經(jīng)甲醇浸泡超聲提取3 次后，減壓回收溶劑至無醇味得粗提物浸膏，浸膏加水分散，用乙酸乙酯等體積萃取得到中等極性部位浸膏。菌液減壓濃縮后用等體積乙酸乙酯萃取3 次，與菌絲體乙酸乙酯部位合并得總乙酸乙酯浸膏90.0 g。乙酸乙酯浸膏經(jīng)硅膠柱層析初步分離，經(jīng)過石油醚-乙酸乙酯（100∶1→0∶1）體系進(jìn)行梯度洗脫，TLC 分析合并得到3 個(gè)粗組分（Fr.A→C）。Fr. B 中析出黃色粉末，為化合物3（30.3 g）。Fr. A 經(jīng)過ODS柱層析甲醇-水（40∶60→60∶40）梯度洗脫，得化合物1（6.4 mg）、化合物7（7.3 mg）和Fr.A-1。Fr.A-1 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫得化合物5（14.9 mg）和化合物6（24.1 mg）。Fr.C 經(jīng)過正相硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（100∶1→20∶1）體系梯度洗脫以及半制備HPLC（80% 甲醇-水）分離純化得到化合物4（14.6 mg）、化合物2（33.0 mg）和化合物8（3.9 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

1H-NMR 數(shù)據(jù)顯示低場(chǎng)區(qū)存在1 個(gè)活潑氫信號(hào)δH14.46，7 個(gè)芳香質(zhì)子δH7.71，6.99，6.60，6.52，6.32，6.09，5.60，2 個(gè)被氧化的亞甲基質(zhì)子δH5.20，4.91，2 個(gè)甲氧基δH3.94，3.84。13C-NMR 數(shù)據(jù)提示結(jié)構(gòu)中共29 個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合DEPT-135 譜分析可知，包括11 個(gè)季碳信號(hào)（包括2 個(gè)羰基碳信號(hào)，1 個(gè)乙?；驶夹盘?hào)，7 個(gè)芳香碳信號(hào)和1 個(gè)sp3雜化的季碳信號(hào)），9 個(gè)次甲基信號(hào)，2 個(gè)亞甲基，2 個(gè)甲氧基信號(hào)，1 個(gè)乙?；谆? 個(gè)甲基碳信號(hào)。以上數(shù)據(jù)與已知嗜氮酮類化合物peniazaphilone B[10]大體相似。

對(duì)化合物1 核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行全歸屬（見表1），與peniazaphilone B 比較差別較大的核磁數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，化合物1 中缺少1 個(gè)芳香次甲基，而存在1 個(gè)被氧化的亞甲基信號(hào)（δH5.20，4.91；δC64.2），推測(cè)Δ1，2被飽和，且2 號(hào)位為氧原子。在異核多鍵相關(guān)（HMBC）譜信號(hào)中，H-1 與C-3/C-4a/C-8a/C-8 相關(guān)，結(jié)合peniazaphilone B 分子式（C29H33N3O6）和化合物1 分子式（C29H34N2O7），證實(shí)是1 號(hào)位被飽和，且2 號(hào)位為氧原子取代的推測(cè)。其余部分與peniazaphilone B 相同，以上數(shù)據(jù)闡明了化合物1 的平面結(jié)構(gòu)，其1H-1H COSY 同核化學(xué)位移相關(guān)譜（1H-1H COSY）及HMBC 信號(hào)見圖2。

表1 化合物1 的1H-NMR（400 MHz，CDCl3）和13C-NMR（100 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)歸屬Table 11H-NMR（400 MHz，CDCl3）and13C-NMR（100 MHz，CDCl3）data of compound 1

圖2 化合物1 的1H-1H COSY、HMBC 信號(hào)Figure 2 Key 1H-1H COSY，HMBC correlations of compound 1

據(jù)該類化合物的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10]， CH3-17 位均為β 構(gòu)型，考慮到它們生源合成途徑相同，故將化合物1 的CH3-17 暫定為β 構(gòu)型。在NOE 增強(qiáng)譜中，C-7 和C-13 處兩個(gè)手性中心相距較遠(yuǎn)，無法進(jìn)行CH3-18 處相對(duì)構(gòu)型判斷?；衔? 的實(shí)驗(yàn)ECD 光譜（見圖3）與文獻(xiàn)報(bào)道化合物peniazaphilone B 的ECD譜線比較，二者在相同波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有相同的Cotton效應(yīng)，故推斷化合物1 的絕對(duì)構(gòu)型為7R，13S。最終，將化合物1 命名為peniazaphilone J。

圖3 化合物1 的實(shí)驗(yàn)ECD 光譜Figure 3 Experimental ECD spectrum of compound 1

化合物 2：酒紅色固體。HR-ESI-MSm/z：415.130 1[M+H]+（計(jì)算值C23H23O5Cl，415.130 6）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.82（1H，s，H-1），7.11（1H，d，J= 15.6 Hz，H-10），6.60（1H，s，H-4），6.08（1H，d，J= 15.6 Hz，H-9），5.72（1H，d，J= 9.8 Hz，H-12），2.58（1H，s，H-4′），2.46（H，m，H-13），1.83（3H，s，CH3-16），1.70（3H，s，CH3-18），1.42（1H，m，H-14a），1.29（1H，m，H-14b），1.00（3H，d，J= 6.6 Hz，CH3-17），0.86（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：194.3（C-6），183.2（C-3′），168.0（C-1′），163.9（C-8），158.2（C-3），152.2（C-1），149.5（C-12），143.7（C-10），139.8（C-4a），132.1（C-11），123.8（C-2′），115.7（C-9），110.3（C-5），108.6（C-8a），105.7（C-4），87.6（C-7），35.2（C-13），30.1（C-14），30.1（C-4′），26.4（C-18），20.2（C-17），12.4（C-16），12.0（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[11]基本一致，故鑒定化合物2 為5-chloroisorotiorin。

化 合 物 3： 黃 色 粉 末。 HR-ESI-MSm/z：391.099 8[M+H]+（計(jì)算值C21H23O5Cl，391.123 4）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.91（1H，s，H-1），7.04（1H，d，J= 15.7 Hz，H-10），6.62（1H，s，H-4），6.06（1H，d，J= 15.7 Hz，H-9），5.61（1H，d，J= 9.8 Hz，H-12），2.46（1H，m，H-13），2.15（1H，s，H-20），1.82（3H，s，CH3-16），1.55（3H，s，CH3-18），1.42（1H，m，H-14a），1.30（1H，m，H-14b），0.99（3H，d，J=6.6 Hz，CH3-17），0.84（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：191.8（C-6），186.0（C-8），170.1（C-19），158.2（C-3），152.7（C-1），148.9（C-12），142.9（C-10），138.8（C-4a），132.1（C-11），115.8（C-9），114.6（C-5），110.8（C-8a），106.4（C-4），84.7（C-7），35.2（C-13），30.1（C-14），22.6（C-18），20.6（C-20），20.1（C-17），12.4（C-16），12.0（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[12]基本一致，因此，確定化合物3 為（+）-sclerotiorin。

化 合 物 4： 橙 色 粉 末。 HR-ESI-MSm/z：349.449 9[M+H]+（計(jì)算值C19H21O4Cl，349.120 1）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.93（1H，s，H-1），7.09（1H，d，J= 15.7 Hz，H-10），6.62（1H，s，H-4），6.08（1H，d，J= 15.7 Hz，H-9），5.73（1H，d，J= 9.8 Hz，H-12），2.48（H，m，H-13），1.85（3H，s，CH3-16），1.58（3H，s，CH3-18），1.43（1H，m，H-14a），1.33（1H，m，H-14b），1.01（3H，d，J= 6.6 Hz，CH3-17），0.86（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：194.1（C-8），189.8（C-6），158.7（C-3），151.8（C-1），149.5（C-12），143.5（C-4a），140.1（C-10），132.1（C-11），115.7（C-9），115.3（C-8a），109.1（C-5），106.1（C-4），84.0（C-7），35.3（C-13），30.2（C-14），28.9（C-18），20.3（C-17），12.5（C-16），12.1（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]基本一致，故鑒定化合物4 為deacetylsclerotiorin。

化 合 物 5： 橙 色 粉 末。 HR-ESI-MSm/z：353.151 1[M+H]+（計(jì)算值C19H25O4Cl，353.151 4）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.01（1H，d，J= 15.5 Hz，H-10），6.09（1H，s，H-4），5.99（1H，d，J= 15.5 Hz，H-9），5.63（1H，d，J= 9.8 Hz，H-12），4.85（1H，dd，J= 10.9，5.2 Hz，H-1a），3.81（1H，dd，J= 13.6，10.9 Hz，H-1b），3.46（1H，d，J= 9.6 Hz，H-8），3.12（1H，m，H-8a），2.44（1H，m，H-13），1.81（3H，s，CH3-16），1.55（3H，s，CH3-18），1.42（1H，m，H-14a），1.30（1H，m，H-14b），0.99（3H，d，J = 6.6 Hz，CH3-17），0.84（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：189.2（C-6），164.2（C-3），147.4（C-12），146.7（C-4a），142.2（C-10），132.4（C-11），119.2（C-9），108.3（C-5），101.8（C-4），75.1（C-7），73.5（C-8），68.9（C-1），37.8（C-8a），35.1（C-13），30.3（C-14），21.3（C-18），20.4（C-17），12.5（C-16），12.1（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]基本一致，故鑒定化合物5 為isochromophiloneⅢ。

化合物 6：酒紅色粉末。HR-ESI-MSm/z：390.146 7[M+H]+（計(jì)算值C21H24NO4Cl，390.146 6）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.08（1H，s，H-1），7.20（1H，d，J= 16.1 Hz，H-10），6.99（1H，s，H-4），6.25（1H，d，J= 16.1 Hz，H-9），5.74（1H，d，J= 9.7 Hz，H-12），2.46（1H，m，H-13），2.14（1H，s，H-20），1.85（3H，s，CH3-16），1.59（3H，s，CH3-18），1.41（1H，m，H-14a），1.29（1H，m，H-14b），1.00（3H，d，J = 6.6 Hz，CH3-17），0.85（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：193.4（C-6），183.8（C-6），170.5（C-19），148.9（C-12），148.3（C-4a），147.2（C-3），143.5（C-10），139.0（C-1），132.2（C-11），116.7（C-9），114.8（C-8a），110.9（C-4），101.0（C-5），85.1（C-7），35.2（C-13），30.2（C-14），23.8（C-18），20.6（C-20），20.3（C-17），12.5（C-16），12.1（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]基本一致，故鑒定化合物6 為penazaphilone E。

化合物 7：黑褐色固體。HR-ESI-MSm/z：315.160 4 [M+H]+（計(jì)算值C19H24O4，315.159 0）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：12.58（1H，s，H-2），9.81（1H，s，1-CHO），7.35（1H，d，J= 15.6 Hz，H-4′），6.19（1H，d，J= 15.6 Hz，H-3′），6.12（1H，s，H-5），5.82（1H，d，J= 9.8 Hz，H-6′），4.06（2H，s，H-1′），2.47（1H，m，H-7′），2.00（3H，s，CH3-3），1.79（3H，s，CH3-10′），1.37（2H，m，H-8′），0.99（3H，d，J= 6.6 Hz，CH3-11′），0.84（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-9′）；13C-NMR（100 MHz， CDCl3）δ： 198.3（C-2′）， 192.5（1-CHO），164.5（C-2），162.3（C-4），152.4（C-4′），151.0（C-6′），137.2（C-6），132.0（C-5′），122.4（C-3′），111.5（C-5），112.7（C-3），111.1（C-1），43.8（C-1′），35.4（C-7′），30.0（C-8′），20.1（C-10′），12.5（C-11′），12.0（C-9′），7.1（CH3-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]基本一致，故鑒定化合物7 為2，4-dihyroxy-6-（5，7-dimethyl-2-oxo-trans-3-trans-5-nonadienyl）-3-methylbenzaldehyde。

化合物 8：淺黃色粉末。HR-ESI-MSm/z：275.163 9 [M+H]+（計(jì)算值C17H22O3，275.164 1）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：12.66（1H，s，H-2），10.15（1H，s，1-CHO），6.81（1H，d，J=15.7 Hz，H-1′），6.62（1H，d，J = 15.7 Hz，H-2′），6.46（1H，s，H-5），5.56（1H，s，H-4），5.46（1H，d，J= 9.6 Hz，H-4′），2.46（1H，m，H-5′），2.11（3H，s，CH3-3），1.87（3H，s，CH3-8′），1.41（1H，m，H-6′a），1.33（1H，m，H-6′b），1.00（3H，d，J= 6.7 Hz，CH3-9′），0.87（3H，t，J=7.4 Hz，CH3-7′）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：193.2（1-CHO），163.6（C-2），163.6（C-6），160.8（C-4），143.3（C-4′），140.6（C-2′），132.2（C-3′），119.3（C-1′），112.1（C-1），109.7（C-3），105.9（C-5），34.7（C-5′），30.3（C-6′），20.5（C-9′），12.7（C-8′），12.0（C-7′），7.1（CH3-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[17]基本一致，故鑒定化合物8 為6-（（1E，3E）-3，5-dimethylhepta-1，3-dien-1-yl）-2，4-dihydroxy-3-methylbenzaldehyde。

4 討論

本研究對(duì)采自中國(guó)南海湛江徐聞海域的瘤背石璜胃腸道中提取得到的一株真菌Penicillium sclerotiorumGZU-XW03-2 進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵物甲醇提取物的乙酸乙酯部位進(jìn)行分離純化，從中分離并鑒定了8 個(gè)聚酮類化合物，其中新化合物1為罕見的具有氮-氮鍵的聚酮類化合物。本研究發(fā)現(xiàn)，該真菌液體發(fā)酵后代謝產(chǎn)物類型主要為聚酮類化合物，與大米固體發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的眾多雜萜類化合物相比，產(chǎn)物類型存在較大差異。以上研究成果豐富了青霉屬真菌的化學(xué)成分，為該屬真菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考。