基于UHPLC-QE-MS 及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討固本化濕降脂湯調(diào)控肥胖大鼠進(jìn)食機(jī)制

易菲，李淑豪，易玉柳，周麗，蘇丹，王萬(wàn)春，嚴(yán)張仁，邱明亮，曾晶晶，陳浩，（.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 000；.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像中心，江西 南昌 0006；.江西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效（防治精神障礙腦疾?。┰u(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，江西 南昌 0006；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 0006）

肥胖癥是指有機(jī)體內(nèi)脂肪含量過(guò)?；蚓植恐竞吭黾蛹胺植籍惓５穆源x性疾病[1]。近50 年中，全球患有肥胖癥的人數(shù)越來(lái)越多，達(dá)到了大流行水平[2]。單純性肥胖患者體質(zhì)大多屬于脾虛濕阻型[3]。大腦可調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝功能，包括食物攝取、葡萄糖吸收等；腸道可以調(diào)控肝葡萄糖產(chǎn)生和胰島素抵抗，與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)；中樞神經(jīng)和腸道相互作用的傳導(dǎo)系統(tǒng)稱為腸-腦軸，可通過(guò)多種生理活動(dòng)參與動(dòng)物進(jìn)食機(jī)制和體質(zhì)量調(diào)節(jié)[4]。

固本化濕降脂湯是本課題組臨床經(jīng)驗(yàn)方，由宋代《太平惠民和劑局方》中的參苓白術(shù)散化裁而成，具有益氣健脾，祛濕化痰的功效。本課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)本方在臨床上能降低肥胖患者血脂水平，治療肥胖頗有成效。但其如何調(diào)控脾虛濕阻型單純性肥胖患者進(jìn)食神經(jīng)的作用機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-QE-MS 技術(shù)對(duì)固本化濕降脂湯進(jìn)行體內(nèi)外成分分析，得出入血成分；應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)入血成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并分析其生物過(guò)程及信號(hào)通路；結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)深入探究，對(duì)脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠的下丘腦、血清等多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析，以期探索本方對(duì)肥胖大鼠進(jìn)食神經(jīng)紊亂的調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)的研究流程見(jiàn)圖1。

圖1 固本化濕降脂湯調(diào)控肥胖大鼠進(jìn)食機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究流程圖Figure 1 Flow chart of the experimental study of Guben Huashi Jiangzhi Decoction on feeding mechanism of obesity rats

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 雄性大鼠60 只，6 周齡，SPF 級(jí)，體質(zhì)量170～210 g，購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物科技中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0002119，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003。飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（贛）2022-0002。飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為20～24 ℃，相對(duì)濕度為45%～55%。本研究由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，動(dòng)物福利倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：JZLLSC20220797。

1.2 藥物及試劑 固本化濕降脂湯處方為：黨參6 g、荷葉15 g、紅曲9 g、茯苓12 g、炒薏苡仁9 g、北山楂12 g、炒白術(shù)9 g、炒山藥9 g、枳實(shí)9 g、丹參12 g、決明子12 g、淡竹葉12 g、陳皮12 g、綠蘿花2 g、砂仁6 g、鹽澤瀉9 g。處方中的決明子，康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：210700189；紅曲，浙江桐居堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：210429；其余中藥材均來(lái)自江西江中中藥飲片有限公司，批號(hào)分別是：210622、210630、210608、210708、210725、210804、210806、210305、210401、210622、210430、210704、210325、181230。備齊處方中所需的藥材，委托江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院完成水煎劑制備。奧利司他，杭州中美華東制藥有限公司，批號(hào)：H30019728；戊巴比妥鈉，上海源葉生物科技公司，批號(hào)：L24A86142282；rabbit Anti-GAPDH 內(nèi)參抗體，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：KGAA002；Mouse Anti-POMC，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：66358-1-IG；Rabbit Anti-AgRP，美國(guó)Lsbio 公司，批號(hào)：LSC292683。大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素18（IL-18）、大鼠脂肪素（Apelin）、大鼠脂聯(lián)素（ADP）、大鼠瘦素（Leptin，LEP）、大鼠游離脂肪酸（FFA）ELISA 試劑盒，批號(hào)分別為：MM-0180R1、MM-0190R1、 MM-0047R1、 MM-0194R1、 MM-70340R1、MM-0553R1、MM-0096R1、MM-0324R1，均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 主要儀器 MD Spectramac M3 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD 公司；Bio-rad Power Supplies Basic 電泳儀，美國(guó)Bio-rad 公司；SYNGENE G：BOXChemiXR5 凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)Syngene 公司；Thermo Sorvall ST 16R 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；Orbitrap Exploris 120 型高分辨質(zhì)譜，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Trans-Blot Turbo 170-4150 全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad 公司；ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱，美國(guó)Waters 公司；Vanquish 型超高效液相，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.4 固本化濕降脂湯入血成分分析

1.4.1 提取物樣本的制備 委托江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部制備固本化濕降脂湯，作為實(shí)驗(yàn)提取物；將提取物離心后，取上清300 μL 于EP 管中，加入1 000 μL 提取液（甲醇∶水=4∶1）；再超聲，離心，過(guò)濾；每個(gè)樣本各取200 μL，形成固本化濕降脂湯提取物樣本。

1.4.2 血清樣本的采集與制備 取6 只SD 雄性大鼠，隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組，每組3 只。實(shí)驗(yàn)前12 h，禁食不禁水。含藥血清組大鼠灌胃生藥量為34.4 g·kg-1的固本化濕降脂湯?？瞻籽褰M給予等體積的生理鹽水。在給藥2 h 后用2% 戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射，深度麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采集全血，靜置，離心，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

取400 μL 含藥血清組血清樣本，加入40 μL 鹽酸；渦旋1 min，4 ℃靜置15 min（重復(fù)4 次）；加入1.6 mL 乙腈，離心，取1 800 μL 上清液，氮吹干燥；加入150 μL 的80% 甲醇復(fù)溶，離心，取120 μL 上清液倒進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)?？瞻籽褰M血清重復(fù)上述操作。

1.4.3 UHPLC-QE-MS 分析條件 色譜采用Waters UPLC BEHC18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）。流動(dòng)相：0.1% 甲酸水（A）和0.1% 甲酸水乙腈（B）。線性洗脫梯度程序分別為：0～11 min，85%～25% A；11～12 min，25%～2% A；12～14 min，2%～2% A；14～14.1 min，2%～85% A；14.1～16 min，85%～85%A。利用質(zhì)譜儀，選取飛行時(shí)間質(zhì)譜的范圍為100～1 500。使用Xcalibur 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.5.1 固本化濕降脂湯入血成分靶點(diǎn)與肥胖疾病相關(guān)靶點(diǎn)收集 通過(guò)Similarity ensemble approach（https://sea.bkslab.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索固本化濕降脂湯入血成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。此外，在drugbank（https://go.drugbank.com/）、Genecards（https://www.genecards.org/）、Online Mendelian Inheritance in Man（https://omim. org/）、Therapeutic Target Database（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“obesity”為關(guān)鍵詞查找單純性肥胖的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.5.2 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index. html）在線制作韋恩（Venn）圖，得到固本化濕降脂湯入血成分和肥胖疾病的共同潛在靶點(diǎn)，并通過(guò)String（https://www.stringdb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。將上述結(jié)果導(dǎo)入cytoscope 3.5.1 軟件進(jìn)行可視化，使用centiscape插件，以度值（degree）、介數(shù)值（betweenness）和最短路徑值（closeness）為指標(biāo)，篩選出固本化濕降脂湯治療肥胖的核心靶點(diǎn)。

1.5.3 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 將共同潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入 metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 功能分析及KEGG 通路富集分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究

1.6.1 動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥 從54 只SD 大鼠中隨機(jī)選取8 只SD 大鼠，定為正常組。剩余46 只SD 大鼠采用課題組前期脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠模型復(fù)制法[6]進(jìn)行為期10 周的模型復(fù)制。模型復(fù)制結(jié)束后，選取40 只體質(zhì)量≥500 g 的模型復(fù)制成功大鼠，隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組、模型組及固本化濕降脂湯低、中、高劑量組，每組8 只，并繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。固本化濕降脂湯的低、中、高劑量組分別灌胃給予8.6、17.2、34.4 g·kg-1的生藥量；模型組和正常組分別灌胃等量生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組灌胃0.037 5 g·kg-1的奧利司他膠囊水溶劑。每只大鼠灌胃2 mL，每日1 次，連續(xù)4 周。

1.6.3 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、LEP、Apelin、ADP、FFA 的含量 藥物干預(yù)4 周后取材。處理前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射2 %戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）深度麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采集血樣，離心，獲得上層血清，于-20 ℃保存，待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明，采用ELISA技 術(shù) 檢 測(cè) 血 清 中IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、LEP、Apelin、ADP 和FFA 表達(dá)。

1.6.4 Western Blot 法檢測(cè)大鼠下丘腦POMC、AgRP蛋白的表達(dá) 采用“1.6.3”項(xiàng)下方法將大鼠深度麻醉，頸椎脫臼處死，手術(shù)鉗打開(kāi)大鼠腦子，剝離出下丘腦，-80 ℃保存。提取下丘腦總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定POMC、AgRP 這兩個(gè)蛋白的表達(dá)。

1.6.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 以GraphPad Prism 8 軟件作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）進(jìn)行多組間比較，若方差不齊則采用Dunnett’s T3 法進(jìn)行組間比較，若方差齊性則采用LSD-t法進(jìn)行組間比較。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 固本化濕降脂湯入血成分分析 通過(guò)對(duì)固本化濕降脂湯提取物、含藥血清以及空白對(duì)照血清進(jìn)行比較，得到由正、負(fù)離子掃描下的中藥提取物檢測(cè)正負(fù)離子圖、含藥血清檢測(cè)正負(fù)離子圖，見(jiàn)圖2。對(duì)大鼠血清中的藥物成分進(jìn)行篩選，鑒定出31 種入血成分，見(jiàn)表1，而這些成分可能是在體內(nèi)發(fā)揮主要作用的潛在活性成分。

圖2 UHPLC-QE-MS 對(duì)固本化濕降脂湯入血成分分析Figure 2 Analysis of components absorbed in the blood of Guben Huashi Jiangzhi Decoction by UHPLC-QE-MS

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 入血成分靶點(diǎn)、肥胖疾病靶點(diǎn)、PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)得到591 個(gè)固本化濕降脂湯入血成分靶點(diǎn)、2 712 個(gè)肥胖相關(guān)的靶點(diǎn)。將固本化濕降脂湯與疾病的靶標(biāo)相互交叉，獲得231 個(gè)共同潛在靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，見(jiàn)圖3-A。將入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖3-B。將共同潛在靶點(diǎn)，導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到一個(gè)有231 個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)和2 130 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)，再以Cytocape 3.5.1 收集，見(jiàn)圖3-C。然后，篩選出度值、介數(shù)值和最短路徑值的前3 個(gè)靶點(diǎn)，得到核心靶點(diǎn)IL6、EGFR、ESR1。

圖3 固本化濕降脂湯調(diào)控肥胖大鼠進(jìn)食機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析圖Figure 3 Network pharmacology chart of Guben Huashi Jiangzhi Decoction in regulating feeding mechanism of obesity rats

2.2.2 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 GO 富集分析得到GO 條目2 165 個(gè)，其中生物過(guò)程（BP）條目1 828 個(gè)，包括對(duì)荷爾蒙的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)含氮化合物的反應(yīng)、對(duì)多肽激素的反應(yīng)、對(duì)胰島素的反應(yīng)等；細(xì)胞成分（CC）條目158 個(gè)，包括膜筏、膜微域、突觸后膜、樹(shù)突、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體的整體成分等；分子功能（MF）條目179 個(gè)，包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、鐵離子結(jié)合、氧化還原酶活性、碳酸鹽脫水酶活性等。選P值較大的前10 條通路進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖3-D。

KEGG enrichment 分析結(jié)果表明共獲得193 條顯著富集的信號(hào)通路（P＜0.05）。在這些豐富的通路中，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在固本化濕降脂湯治療過(guò)程中起著重要的作用。其中AGE-RAGE、HIF-1、乙型肝炎、細(xì)胞凋亡、癌癥、麻疹等信號(hào)通路均參與抗炎作用。這表明固本化濕降脂湯通過(guò)一條或多條通路來(lái)發(fā)揮治療肥胖的作用。選P值較大的前20 條通路可視化，見(jiàn)圖3-E。

2.3 動(dòng)物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.3.1 大鼠體質(zhì)量、Lee’s 指數(shù)結(jié)果 大鼠在肥胖模型復(fù)制階段的精神狀態(tài)有所欠缺，出現(xiàn)嗜睡，懶動(dòng)，反應(yīng)力慢等表征，給藥一段時(shí)間后能明顯看到大鼠的精神狀態(tài)變好，活動(dòng)量更高。如圖4 所示，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和Lee’s 指數(shù)明顯增加（P＜0.01，P＜0.05），表明模型組脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠模型復(fù)制成功；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及固本化濕降脂湯中劑量組體質(zhì)量及Lee’s 指數(shù)都明顯性降低（P＜0.05）。在固本化濕降脂湯給藥的前3 周內(nèi)，藥物可抑制模型大鼠體質(zhì)量的增加，從第4 周起體質(zhì)量減輕得更為明顯，表明本方對(duì)脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠有很好的減輕體質(zhì)量的作用。

圖4 各組大鼠體質(zhì)量、Lee’s 指數(shù)圖（±s，n=8）Figure 4 Charts of body mass and Lee’s index of rats（±s，n=8）

2.3.2 大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α 各指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 如圖5 所示，與正常組比較，模型組大鼠IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α 水平明顯增加（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及固本化濕降脂湯各劑量組IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α 水平都明顯降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，本方對(duì)脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠有抗炎效果。

圖5 固本化濕降脂湯對(duì)脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠血清IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α 水平的影響（±s，n=8）Figure 5 Effects of Guben Huashi Jiangzhi Decoction on serum IL-6，IL-18，IL-1β，TNF-α in simple obesity rats with spleen deficiency and dampness obstruction syndrome（±s，n=8）

2.3.3 大鼠下丘腦中POMC、AgRP 蛋白表達(dá)結(jié)果 如圖6 所示，與正常組比較，模型組大鼠POMC 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001），AgRP 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及固本化濕降脂湯高、中、低劑量組POMC 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.001），陽(yáng)性對(duì)照組及固本化濕降脂湯中、高劑量組AgRP 蛋白表達(dá)水平都明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，固本化濕降脂湯各劑量對(duì)脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠下丘腦中POMC、AgRP 蛋白表達(dá)都有不同程度的影響，以高劑量及中劑量的表達(dá)效果更好。

圖6 固本化濕降脂湯對(duì)脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠下丘腦中POMC、AgRP 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 6 Effects of Guben Huashi Jiangzhi Decoction on the protein expressions of POMC and AgRP in hypothalamus of simple obesity rats of spleen deficiency and dampness obstruction syndrome（±s，n=3）

2.3.4 大鼠血清中LEP、Apelin、ADP、FFA 各指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖7，與正常組比較，模型組血清中LEP、Apelin、FFA 含量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），ADP 含量明顯減低（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、固本化濕湯中劑量組血清LEP 含量明顯降低（P＜0.001，P＜0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組及固本化濕湯高、中劑量組血清Apelin 含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組及固本化濕湯中、低劑量組血清FFA 含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組及固本化濕湯中劑量組血清ADP 含量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，本方可有效調(diào)節(jié)脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠血清中LEP、Apelin、ADP、FFA 等各項(xiàng)指標(biāo)水平。

3 討論

中醫(yī)注重脾胃相輔相成，肥胖患者多為人體氣機(jī)、津液運(yùn)化失常、胃強(qiáng)脾弱而致膏脂堆積，進(jìn)而造成單純性肥胖的發(fā)生。課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，固本化濕降脂湯可以調(diào)節(jié)脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠的代謝異常，但對(duì)其是否可以通過(guò)腸-腦軸來(lái)緩解肥胖的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)旨在從整體上闡明藥物的作用機(jī)制，應(yīng)用整體思維于微觀的生物層次，進(jìn)而全面計(jì)算出中醫(yī)藥與生物分子的關(guān)聯(lián)，從而能高效地預(yù)測(cè)中藥的活性成分和分子機(jī)制。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)根據(jù)藥物代謝參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測(cè)的化合物及靶點(diǎn)信息也會(huì)出現(xiàn)漏篩或者是假陽(yáng)性結(jié)果[7]。為避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，本研究采用UHPLC-QEMS 進(jìn)行系統(tǒng)的定性研究。

根據(jù)本研究的入血成分-靶點(diǎn)圖、PPI 網(wǎng)絡(luò)圖可知，苯甲酸、煙酸、龍血素A 等是固本化濕降脂湯治療單純性肥胖的重要成分，核心靶點(diǎn)是IL6、EGFR、ESR1。已有研究[8]證實(shí)煙酸具有減肥的作用，適度地?cái)z入煙酸，可降低血清中FFA 濃度，減少外周脂質(zhì)積聚，從而改善肥胖大鼠脂質(zhì)和葡萄糖代謝。IL-6 是一種多效性細(xì)胞因子，可增加全身胰島素，減少脂肪肝變性和減少肝葡萄糖產(chǎn)生，糾正食物攝入的異常調(diào)節(jié)[9]。Mondanelli 等[10]證明，IL-6 受體阻斷可能是肥胖治療的有效選擇。本文KEGG 富集分析結(jié)果顯示，固本化濕降脂湯治療肥胖的主要通路有HIF-1 信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路等。AGE-RAGE 信號(hào)通路下調(diào)，可以抑制肥胖誘導(dǎo)的細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)[11-12]；抑制HIF-1 信號(hào)通路則會(huì)影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞應(yīng)激、炎癥和凋亡等重要調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄，減少脂肪組織誘導(dǎo)慢性炎癥的發(fā)生[13-14]。炎癥在肥胖的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要，肥胖會(huì)導(dǎo)致脂肪組織產(chǎn)生炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18）[15]；其中IL-18 是由Nlrp1b1 炎癥小體介導(dǎo)的，對(duì)能量過(guò)剩反應(yīng)具有保護(hù)功能，可防止血脂異常和2型糖尿病的發(fā)展，并且高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖會(huì)促進(jìn)IL-18 水平上調(diào)[16]。本實(shí)驗(yàn)研究證明固本化濕降脂湯可降低炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18）的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)肥胖大鼠的治療作用。此結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究所預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)IL-6 及炎癥相關(guān)通路相吻合。

此外，炎癥信號(hào)可以通過(guò)腸-腦軸來(lái)感知分子與細(xì)胞的作用機(jī)制[17]。而腸-腦軸主要依賴迷走神經(jīng)的傳入和傳出等通路，進(jìn)而促進(jìn)腦軸生物標(biāo)志物與腸軸生物標(biāo)志物的相互調(diào)節(jié)，形成完整的負(fù)反饋回路，從而調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的食欲。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的下丘腦是調(diào)節(jié)食欲的中樞，可分泌影響能量平衡的神經(jīng)元——促食欲神經(jīng)元AgRP 和抑食欲神經(jīng)元POMC。Apelin、LEP 是具有降糖作用的腸道激素，不僅如此，LEP 還可以通過(guò)控制脂肪分解和脂肪生成來(lái)調(diào)節(jié)脂肪儲(chǔ)存[18]；Apelin 能改善正常和肥胖小鼠肌肉的胰島素敏感性，以刺激葡萄糖的吸收[19]。而ADP 可通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活性抑制FFA 引發(fā)的下丘腦炎癥，維持機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)[20]。FFA 作為脂毒性的重要標(biāo)志，在所有主要的胰島素靶器官中會(huì)引起胰島素抵抗[21]。本研究顯示，固本化濕降脂湯各劑量組均能不同程度地促進(jìn)POMC 蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可抑制AgRP 蛋白的表達(dá)。多項(xiàng)研究[22-23]表明，高脂飲食會(huì)導(dǎo)致Apelin 增肥反應(yīng)和LEP 抵抗作用，導(dǎo)致LEP、Apelin 實(shí)際水平增高，與本研究結(jié)果一致，模型組LEP、Apelin 的水平升高；給藥后LEP、Apelin 的水平出現(xiàn)不同程度的降低，ADP 激素水平增加，以此維持能量穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而降低了FFA 水平，抑制了下丘腦炎癥和胰島素抵抗，改善了代謝，詳見(jiàn)圖8。

圖8 下丘腦神經(jīng)元和腸道激素相互作用圖Figure 8 Interactions diagram of hypothalamic neurons and gastrointestinal hormone

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)固本化濕降脂湯入血成分進(jìn)行分析，構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，揭示出固本化濕降脂湯的核心靶點(diǎn)、信號(hào)通路大部分都與炎癥相關(guān)。通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)固本化濕降脂湯可降低炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18）的水平，影響下丘腦中POMC、AgRP 蛋白的表達(dá)及血清中LEP、Apelin 等多項(xiàng)指標(biāo)水平。綜上，固本化濕降脂湯可能是通過(guò)降低炎癥反應(yīng)，調(diào)控腸-腦軸來(lái)抑制食欲，達(dá)到治療脾虛濕阻型單純性肥胖的作用。