麥味養(yǎng)肺湯通過(guò)調(diào)控p53/p21 信號(hào)通路抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞衰老抗肺纖維化的作用機(jī)制研究

王單，徐泳，黃同杏，韓迪，王晶，魏云，周賢梅（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 009；.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院/中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 009）

肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）是一種隱匿且病因不明的破壞性間質(zhì)性肺病，由多種肺部損傷引起，其特征是肺部不同程度的炎癥和纖維化[1]，病理表現(xiàn)為胸膜下和基底部的纖維化及蜂窩樣改變[2-3]。目前的西醫(yī)治療手段盡管能減緩纖維化進(jìn)程，但無(wú)法逆轉(zhuǎn)進(jìn)行性纖維化[4]，對(duì)肺功能的改善有限，且存在較多不良反應(yīng)[5-6]。肺纖維化屬中醫(yī)“肺痹”“肺痿”范疇，結(jié)合中醫(yī)藥獨(dú)特優(yōu)勢(shì)可為肺纖維化的治療提供新的思路[7]。《圣濟(jì)總錄》記載“治肺痹上氣發(fā)咳，五味子湯方”，該方由五味子、黨參、紫苑、紫蘇子、炙麻黃、姜半夏、細(xì)辛、炙黃芩、當(dāng)歸、炙甘草組成。麥味養(yǎng)肺湯是在五味子湯的基礎(chǔ)上加入麥冬、陳皮2 味藥組成，加強(qiáng)養(yǎng)陰潤(rùn)肺、理氣化痰之功效[8]。本課題組前期研究[9]表明，麥味養(yǎng)肺湯能夠顯著改善肺纖維化患者喘息、氣短、咳嗽等臨床癥狀，降低圣喬治呼吸問(wèn)卷評(píng)分，提高患者的肺功能。麥味養(yǎng)肺湯還能夠減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低羥脯氨酸（Hyp）、膠原及吡啶啉的含量，能夠延緩肺纖維化的進(jìn)展，且以高劑量組效果最明顯[10]。因此，本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇高劑量麥味養(yǎng)肺湯進(jìn)一步探討其對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 6～8 周齡雄性C57BL/6 小鼠24 只，SPF級(jí)，體質(zhì)量22～25 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1100112011047984。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批文號(hào)：201903602。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑 麥味養(yǎng)肺湯由麥冬、五味子、黨參、炙麻黃、陳皮、半夏、炒蘇子、紫苑、細(xì)辛、黃芩、當(dāng)歸、炙甘草組成，所有中藥飲片購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)單進(jìn)軍教授鑒定為正品。將中藥飲片加入純水浸泡30 min，煮沸后繼續(xù)煎煮30 min，過(guò)濾回收水煎液；重復(fù)2 次，混合水煎液，減壓濃縮后得到麥味養(yǎng)肺湯提取液（6 g·mL-1）。

硫酸博來(lái)霉素（批號(hào)：TCI-B3972-10MG）、RIPA裂解液（批號(hào)：AC13972），均購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；瑞沃德動(dòng)物用異氟烷（批號(hào)：R510-22），南京艾佰格生物技術(shù)有限公司；Hyp 含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：BC0255），南京騰科生物科技有限公司；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（批號(hào)：KGPAG001）、WB 一抗、二抗稀釋液（批號(hào)：KGP106），均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光底物（批號(hào)：BL523B），南京柏賽生物公司；Fibronectin 抗體（批號(hào)：15613-1-AP）、α-SMA 抗體（批號(hào)：23081-AP），均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Vimentin 抗體（批號(hào)：5741T）、XP Rabbit mAb抗體（批號(hào)：2984T），均購(gòu)自賽信通（上海）生物試劑有限公司；Anti-p53 抗體（批號(hào)：ab179477）、Antip21 抗體（批號(hào)：ab188224）、Anti-p16INK4a 抗體（批號(hào)：ab16123）、SP-C 抗體（批號(hào)：ab90716），均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；預(yù)制膠10%（批號(hào)：1610183）、預(yù)制膠12%（批號(hào)：1610185），均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；蛋白預(yù)染Marker（批號(hào)：89432），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度定量試劑盒（批號(hào)：205984），美國(guó)Thermo 公司；脫脂奶粉（批號(hào)：232100），蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司；4%多聚甲醛固定液（批號(hào)：BL539A），北京白鯊易科技公司。

1.3 主要儀器 KZ-III-F 型高速低溫組織研磨儀，武漢塞維爾公司；RM2016 型冰凍切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；Infinite200pro 型酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；DMi8 型倒置生物顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；Centrifuge 5427R 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Flexivent 型小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀，德國(guó)EMKA公司；Quantum GX 型動(dòng)物活體成像mico-CT 掃描儀，美國(guó)PerkinElmer 公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥 將24 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、麥味養(yǎng)肺湯組（60 g·kg-1·d-1）和陽(yáng)性對(duì)照組（吡非尼酮，0.3 g·kg-1·d-1），每組6 只。對(duì)除了空白組外的其他各組小鼠進(jìn)行氣管滴注博來(lái)霉素造模：將小鼠放入氣體麻醉機(jī)中吸入異氟烷麻醉，麻醉后的小鼠平躺至動(dòng)物操作臺(tái)上；用氣管霧化滴注針緩慢插入氣管中，每只小鼠緩慢滴入5 mg·kg-1博來(lái)霉素，空白組用生理鹽水代替博來(lái)霉素；滴注之后將小鼠立起，固定并上下左右搖晃，使博來(lái)霉素均勻散布到肺中。造模后次日開(kāi)始灌胃給藥，根據(jù)Meeh-Rubner 體表面積計(jì)算公式換算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量，麥味養(yǎng)肺湯組按照課題組前期研究[10]的有效劑量60 g·kg-1·d-1進(jìn)行灌胃給藥；陽(yáng)性對(duì)照組給予吡非尼酮0.3 g·kg-1·d-1灌胃給藥，空白組及模型組分別給予生理鹽水灌胃；每日1 次，連續(xù)給藥21 d，并記錄小鼠體質(zhì)量。

1.5 小鼠肺功能測(cè)定 末次給藥后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，麻醉后固定；剪開(kāi)頸部皮膚，于頸部正中切開(kāi)，分離頸部肌肉并鈍性分離氣管；持手術(shù)剪在氣管上作一1 ～2 mm 切口，將肺功能檢測(cè)針插入小鼠氣管并用手術(shù)線固定連接部位。將針管另一頭與呼吸機(jī)連接，并將小鼠放入全身體積描記檢測(cè)系統(tǒng)中；打開(kāi)肺功能儀，進(jìn)行機(jī)械通氣，設(shè)置參數(shù)：呼吸速率為90·min-1，潮氣量為5 mL·kg-1，呼氣末端壓力約等于8 cm H2O；使用乙酰膽堿作為霧化給藥的激動(dòng)劑，檢測(cè)并記錄小鼠肺順應(yīng)性與肺阻力的變化。

1.6 活體micro-CT 成像法檢測(cè)小鼠肺組織纖維化程度 末次給藥6 h 后，每組隨機(jī)抽取3 只小鼠進(jìn)行胸部micro-CT 成像。提前15 min 啟動(dòng)micro-CT 掃描儀，小鼠麻醉后進(jìn)行micro-CT 成像操作，掃描參數(shù)：電壓70 kV，電流80 μA；每幀圖像時(shí)長(zhǎng)400 ms，每只小鼠掃描約4 min。

1.7 肺組織取材及處理 末次給藥后次日處死小鼠，取新鮮肺組織，用4%多聚甲醛溶液固定左肺下葉；其余肺組織置于2 mL 凍存管并放入液氮中，-80 ℃冰箱保存。4%多聚甲醛固定液浸泡肺組織24 h 后，乙醇脫水脫色，石蠟包埋，切成3 μm 厚度切片；分別進(jìn)行HE、Masson 染色后，置于顯微鏡下觀察并采集圖像；按照Szapiel 和Ashcroft 評(píng)分評(píng)估肺泡炎癥及纖維化程度[11-12]。

1.8 免疫組織化學(xué)法測(cè)定肺組織中I/Ⅲ型膠原的表達(dá) 將小鼠肺組織病理切片脫水、脫蠟后，用H2O2封閉；PBS 清洗后，用檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)；山羊血清封閉液封閉后，滴加膠原Ⅰ/Ⅲ抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜；次日滴加二抗，37 ℃下孵育20 min；自來(lái)水沖洗后，蘇木素復(fù)染，脫水、透明后封片；顯微鏡下觀察并采集圖像，細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色；使用ImageJ 圖像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果的染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性范圍進(jìn)行分析。

1.9 β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法測(cè)定肺組織細(xì)胞衰老情況 將小鼠肺組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化處理后，嚴(yán)格按照SA-β-gal 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。首先，加入30 μL 的SA-β-gal染色固定液，充分蓋住肺組織；室溫下固定15 min后，PBS 洗3 次，每次不少于5 min；滴加30 μL 染色工作液（配制：SA-β-gal 染色A 液10 μL、B 液10 μL、C 液930 μL、X-Gal 溶液50 μL）于切片上，保鮮膜封閉后置于37 ℃下孵育過(guò)夜；次日棄去工作液，封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，陽(yáng)性表達(dá)為深藍(lán)色。

1.10 ELISA 法測(cè)定肺組織中Hyp 的含量 取小鼠肺組織30 mg，勻漿后以4 ℃、13 000 r·min-1（離心半徑7 cm）離心10 min，取上清；采用BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度后，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，測(cè)定肺組織Hyp 含量。

1.11 Western Blot 法測(cè)定肺組織中Fibronectin、Vimentin、α-SMA、p53、p21、p16、SP-C 蛋白表達(dá) 稱(chēng)取小鼠肺組織20 mg，加入含有PMSF 的RIPA 裂解液（1%磷酸酶抑制劑∶1% PMSF），用球磨儀進(jìn)行勻漿；以4 ℃、13 000 r·min-1（離心半徑7 cm）離心30 min，得上清液；使用BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣，行SDS-PAGE 凝膠電泳，再轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入一抗［Fibronectin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p21（1∶1 000）、p16（1∶1 000）、SP-C（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）］兔單克隆抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜；次日回收一抗，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入二抗［辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（1∶2 000）］，室溫下孵育1 h；回收二抗，洗膜，用ECL 顯色液進(jìn)行顯色并掃描。采用Image Lab 軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.12 免疫熒光法檢測(cè)小鼠肺組織中p21、p16 及SP-C 的表達(dá) 將小鼠肺組織切片浸入1% Triton-X-100 溶液中30 min，進(jìn)行破膜；再用PBS 清洗3 次，滴加10%山羊血清后在37 ℃下封閉30 min；按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，滴加一抗（p16、p21 及SP-C），置于4 ℃下過(guò)夜；次日在室溫下放置45 min 后，PBS 洗滌3 次，每次不少于5 min；向待染區(qū)滴加二抗進(jìn)行熒光標(biāo)記后，孵育1 h，PBS 清洗3 次；滴加DAPI 染液后覆蓋切片，5 min 后用PBS 清洗3 次；用封片液封片后，在熒光顯微鏡下拍照采集圖像。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠體質(zhì)量的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1。與空白組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，麥味養(yǎng)肺湯組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05）。

圖1 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=6）Figure 1 Effect of MaiWei YangFei Decoction on the body mass of pulmonary fibrosis mice（±s，n=6）

2.2 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織病理變化的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2。與空白組比較，模型組小鼠肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)大面積被破壞，炎癥程度較重，肺組織中見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；小鼠肺組織有明顯的纖維組織增生，大量膠原（藍(lán)染區(qū)域）沉積，肺組織紋理紊亂，肺泡壁增厚，纖維化評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；肺組織呈密度較高的大片灰白色陰影，肺部輪廓較模糊。與模型組比較，麥味養(yǎng)肺湯組小鼠肺組織炎癥得到一定程度緩解，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡間隔結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，炎癥評(píng)分明顯降低（P＜0.05）；小鼠肺組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，肺泡壁增厚現(xiàn)象有所緩解，僅有少量膠原沉積，纖維化評(píng)分明顯下降（P＜0.01）；小鼠肺組織白色陰影減少，提示纖維化得到緩解。結(jié)果表明，麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織的炎癥和膠原沉積具有明顯改善作用。

圖2 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織病理變化的影響（HE、Masson 染色，×200）Figure 2 Effects of MaiWei YangFei Decoction on lung tissue histopathology of mice with pulmonary fibrosis（HE and Masson staining，×200）

2.3 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺功能的影響 結(jié)果見(jiàn)圖3。與空白組比較，模型組小鼠的肺順應(yīng)性顯著下降（P＜0.01），肺阻力顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，麥味養(yǎng)肺組小鼠的肺順應(yīng)性明顯上升（P＜0.05），肺阻力顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果表明，麥味養(yǎng)肺湯能夠明顯改善肺纖維化小鼠的肺功能。

圖3 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺功能的影響（±s，n=6）Figure 3 Effect of MaiWei YangFei Decoction on lung function in mice with pulmonary fibrosis（±s，n=6）

2.4 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中I/Ⅲ型膠原表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖4。與空白組比較，模型組小鼠肺組織呈現(xiàn)大面積藍(lán)染，且肺泡結(jié)構(gòu)遭到較嚴(yán)重破壞，Ⅰ/Ⅲ型膠原沉積量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，麥味養(yǎng)肺湯組小鼠肺組織膠原沉積情況得到明顯改善，Ⅰ/Ⅲ型膠原沉積量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，麥味養(yǎng)肺湯能夠明顯減少肺纖維化小鼠肺組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原表達(dá)。

圖4 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原及羥脯氨酸（Hyp）含量的影響（免疫組化，×200；±s，n=6）Figure 4 Effects of MaiWei YangFei Decoction on type Ⅰ/Ⅲcollagen and Hyp content in mice with pulmonary fibrosis（IHC，×200；±s，n=6）

2.5 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中Hyp 含量的影響 結(jié)果見(jiàn)圖4。與空白組比較，模型組小鼠肺組織中Hyp 含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，麥味養(yǎng)肺湯組小鼠肺組織中的Hyp 含量顯著減少（P＜0.01）。結(jié)果表明，麥味養(yǎng)肺湯能夠明顯降低肺纖維化小鼠肺組織中的Hyp 水平。

2.6 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中α-SMA、Fibronectin、Vimentin 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖5。與空白組比較，模型組小鼠肺組織中Fibronectin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，麥味養(yǎng)肺湯組小鼠肺組織中Fibronectin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果表明，麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中Fibronectin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)具有明顯抑制作用。

圖5 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中Fibronectin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=3）Figure 5 Effects of MaiWei YangFei Decoction on protein expression levels of Fibronectin，Vimentin and α-SMA in lung tissue of mice with pulmonary fibrosis（±s，n=3）

2.7 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織細(xì)胞衰老情況的影響 結(jié)果見(jiàn)圖6。與空白組比較，模型組小鼠肺組織呈大面積SA-β-gal 藍(lán)染，說(shuō)明細(xì)胞衰老程度明顯。與模型組比較，麥味養(yǎng)肺湯組小鼠肺組織的SA-β-gal 藍(lán)染明顯減輕，提示細(xì)胞衰老程度得到明顯改善。

圖6 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織細(xì)胞衰老及p53、p21、p16 蛋白表達(dá)水平的影響（SA-β-gal 染色，×200；±s，n=3）Figure 6 Effects of MaiWei YangFei Decoction on lung tissue cell senescence and protein expression levels of p53，p21 and p16 in mice with pulmonary fibrosis（SA-β-gal staining，×200；±s，n=3）

2.8 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中p53、p21、p16 蛋白表達(dá)水平的影響 結(jié)果見(jiàn)圖6。與空白組比較，模型組小鼠肺組織中p53、p21、p16 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，麥味養(yǎng)肺湯組小鼠肺組織中p53、p21、p16 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，麥味養(yǎng)肺湯能夠明顯抑制肺纖維化小鼠肺組織中p53、p21、p16等衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2.9 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中p21、p16、SP-C 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖7。與空白組比較，模型組小鼠肺組織中p21、p16 的紅色熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)，Merge 圖像顯示p21、p16 與SP-C 共染的橙色熒光明顯增多，SP-C 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，麥味養(yǎng)肺湯組小鼠肺組織中p21、p16 的紅色熒光表達(dá)明顯減弱，Merge 圖像顯示p21、p16 與SP-C 共染的橙色熒光明顯減少，SP-C 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果表明，麥味養(yǎng)肺湯能夠明顯抑制肺纖維化小鼠肺組織中p21、p16 蛋白在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）中的表達(dá)。

圖7 麥味養(yǎng)肺湯對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中p21、p16 及SP-C 蛋白表達(dá)的影響（免疫熒光，×200；±s，n=3）Figure 7 Effects of MaiWei YangFei Decoction on protein expression levels of p21，p16 and SP-C in lung tissue of mice with pulmonary fibrosis（IF，×200；±s，n=3）

3 討論

目前認(rèn)為，肺纖維化（PF）的發(fā)病機(jī)制是由于各種原因?qū)е路闻萆掀ぜ?xì)胞（AECs）損傷，釋放出大量炎癥因子，肺組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和異常修復(fù)，激活肺成纖維細(xì)胞，正常的肺實(shí)質(zhì)被大量分泌的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）所取代[13]；肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，成纖維細(xì)胞活化成肌成纖維細(xì)胞，膠原過(guò)度沉積，Vimentin 和Fibronectin、α-SMA 表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致肺重塑和瘢痕肺[14]。小鼠氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素是目前常用的肺纖維化動(dòng)物模型復(fù)制方法。micro-CT 影像與臨床診斷肺纖維化手段相似，通過(guò)CT 影像學(xué)特征可進(jìn)一步評(píng)價(jià)藥物在體內(nèi)的療效。肺功能是臨床試驗(yàn)中反映療效的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，也可用于判斷治療藥物對(duì)小鼠肺纖維化的影響[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠的肺組織炎癥和膠原沉積嚴(yán)重，模型復(fù)制成功；而經(jīng)麥味養(yǎng)肺湯干預(yù)后，肺纖維化小鼠肺組織的炎癥浸潤(rùn)和膠原沉積得到明顯改善，同時(shí)麥味養(yǎng)肺湯還能夠提高肺順應(yīng)性和降低肺部阻力，改善肺纖維化小鼠的肺功能。Hyp 作為診斷和預(yù)測(cè)膠原含量的一種常用生物標(biāo)志物，是膠原的主要成分之一，其定量分析是評(píng)價(jià)肺組織中膠原沉積的最常用方法[17]。因此，通過(guò)檢測(cè)肺組織中Hyp 含量，可初步判斷肺組織中膠原沉積的情況。α-SMA、Fibronectin 和Ⅰ型膠原是ECM 的主要成分，也是肌成纖維細(xì)胞的激活標(biāo)志物[16]。本研究結(jié)果顯示，麥味養(yǎng)肺湯能有效抑制肌成纖維細(xì)胞激活，降低纖維化蛋白表達(dá)，減少膠原沉積，延緩肺纖維化進(jìn)展。

細(xì)胞衰老是與復(fù)制和應(yīng)激相關(guān)的衰老因素，其由復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，p53/p21 是其中最關(guān)鍵的一條通路，p53 是中心環(huán)節(jié)[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞依然能夠存活并且代謝，主要表現(xiàn)為溶酶體酶衰老相關(guān)的SA-β-gal 活性增強(qiáng)，以及分別激活p53 和p16 等衰老相關(guān)蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致p21 激活和細(xì)胞周期停滯。當(dāng)細(xì)胞衰老時(shí)，p53 的DNA 結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性增加，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和衰老[20]，主要通過(guò)調(diào)節(jié)p21 等細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子而使細(xì)胞停滯于G1/S 和G2/M 兩個(gè)細(xì)胞周期關(guān)鍵檢查點(diǎn)[21]。因此，p53 在細(xì)胞衰老中扮演了重要角色，同時(shí)細(xì)胞衰老過(guò)程及生物學(xué)改變能夠影響組織修復(fù)和重塑的能力[22]，抑制細(xì)胞衰老在一定程度上對(duì)減緩肺纖維化的進(jìn)程具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中β-半乳糖苷酶活性增加，細(xì)胞衰老比較嚴(yán)重，肺組織中p53 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，其所調(diào)控的p21、p16 蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)；經(jīng)麥味養(yǎng)肺湯干預(yù)后，小鼠肺組織細(xì)胞衰老情況得到改善，β-半乳糖苷酶活性明顯降低，p53、p21 和p16 衰老相關(guān)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)果提示，麥味養(yǎng)肺湯可能是通過(guò)調(diào)控p53/p21 信號(hào)通路抑制細(xì)胞衰老，從而延緩肺纖維化進(jìn)展。

研究表明，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）的衰老與肺纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，氧化應(yīng)激、DNA 損傷、端?？s短以及線粒體自噬等諸多因素可以誘導(dǎo)AECⅡ衰老[23]，進(jìn)而引起功能障礙，導(dǎo)致瘢痕組織或纖維化的積聚，從而發(fā)生肺纖維化[24]。SP-C 是AECⅡ的標(biāo)記物，p21、p16 與SP-C 的免疫熒光共染提示衰老相關(guān)蛋白的變化主要發(fā)生在AECⅡ中。通過(guò)Merge 圖像發(fā)現(xiàn)，橙色熒光在模型組中高表達(dá)且免疫印跡顯示SP-C 蛋白顯著上調(diào)，而麥味養(yǎng)肺湯組橙色熒光表達(dá)較少且SP-C 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)一步說(shuō)明其可能通過(guò)下調(diào)p21、p16 等衰老相關(guān)蛋白表達(dá)來(lái)抑制AECⅡ衰老，從而發(fā)揮抗肺纖維的作用。

綜上所述，麥味養(yǎng)肺湯能夠減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的肺組織炎癥反應(yīng)，改善膠原沉積，促進(jìn)肺功能，可能與其調(diào)控p53/p21 信號(hào)通路抑制AECⅡ衰老有關(guān)。