低氧運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)激活自噬調(diào)控Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路減輕急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌損傷

孔海軍　諶曉安

摘 要：目的：探討低氧運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)激活自噬調(diào)控Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路對(duì)急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌保護(hù)的機(jī)制。方法：50只6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（Con組，n=10）、單純急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（HE組，n=10）、低氧預(yù)適應(yīng)+急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（HP+HE組，n=10）、運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（EP+HE組，n=10）、低氧預(yù)適應(yīng)+運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（EP/HP+HE組，n=10）。預(yù)適應(yīng)周期2 w，EP+HE組及EP/HP+HE組進(jìn)行2次/d常壓常氧跑臺(tái)訓(xùn)練；HP+HE組及EP/HP+HE組進(jìn)行10 h/d間歇性低氧暴露（FiO2 13.5％）。預(yù)適應(yīng)后HE組、HP+HE組、EP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進(jìn)行低氧環(huán)境跑臺(tái)力竭訓(xùn)練（FiO2 ?11.9％～12.0％）。低氧力竭運(yùn)動(dòng)后2 h，尾靜脈取血檢測(cè)血清骨骼肌損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激指標(biāo)，蘇木精-伊紅染色觀察腓腸肌病理特征，并檢測(cè)腓腸肌自噬相關(guān)蛋白、Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路蛋白及mRNA。結(jié)果：（1）與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組大鼠低氧力竭運(yùn)動(dòng)后的腓腸肌結(jié)構(gòu)損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激明顯減輕。（2）HE組Atg5、Beclin1蛋白表達(dá)顯著低于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05），EP/HP+HE組Atg5、Beclin1蛋白表達(dá)顯著高于HP+HE組（P<0.05）；HE組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著高于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05），EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。（3）HE組MST1 mRNA顯著高于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05），EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）；HE組LATS1 mRNA顯著低于預(yù)適應(yīng)組（P<0.05）；HE組YAP mRNA顯著高于預(yù)適應(yīng)組（P<0.05），EP/HP+HE組顯著低于HP+HE組（P<0.05）；HE組及HP+HE TAZ mRNA顯著高于EP+HE組及EP/HP+HE組均顯著降低（P<0.05）。（4）HE組MST1、LATS1及其磷酸化水平顯著低于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05），EP/HP+HE組MST1顯著高于HP+HE組（P<0.05）；HE組YAP蛋白顯著高于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05）；HE組TAZ蛋白顯著高于預(yù)適應(yīng)組均顯著降低（P<0.05），EP/HP+HE組均顯著低于HP+HE組（P<0.05）。結(jié)論：低氧運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可能通過激活骨骼肌自噬抑制Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路減輕急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)大鼠的骨骼肌損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：低氧運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)；自噬；Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路；急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)；骨骼肌損傷

中圖分類號(hào)：G804.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-2076（2023）03-0089-10

Hypoxic Exercise Preconditioning Activates Autophagy to Regulate Hippo/YAP/TAZ Signaling Pathway to Alleviate Skeletal Muscle Injury in Acute Hypoxic Exhaustive Exercise Rats

KONG Haijun1，2，CHEN Xiaoan1

1.College of P.E.， Jishou University， Xiangxi 416000， Hunan， China; 2. College of P.E.， Kashgar University， Kashgar 844000， Xinjiang， China

Abstract：Objective：To explore the mechanism of hypoxic exercise preconditioning activating autophagy to regulate Hippo/YAP/TAZ signaling pathway to protect skeletal muscle in rats undergoing acute hypoxic exhaustive exercise. Methods： 50 six-week-old SPF male SD rats were randomly divided into blank control group （Con group， n=10）， simple acute hypoxic exhaustive exercise group （HE group， n=10）， hypoxic preconditioning+acute hypoxic exhaustive exercise group （HP+HE group， n=10）， exercise preconditioning+acute hypoxic exhaustive exercise group （EP+HE group， n=10）， hypoxic preconditioning+exercise preconditioning+acute hypoxic exhaustive exercise group （EP/HP+HE group， n=10）. The preconditioning period was 2 weeks， EP+HE group and the EP/HP+HE group were trained twice a day on the normal pressure and oxygen treadmill; HP+HE group and EP/HP+HE group were exposed to intermittent hypoxia with FiO2 13.5％ for 10 hours/day. On the next day after preconditioning， rats in HE group， HP+HE group， EP+HE group and EP/HP+HE group were trained to run on the treadmill in a hypoxic environment （FiO2 11.9％～12.0％）. Two hours after exercise， tail vein blood was taken to detect serum skeletal muscle injury， inflammatory reaction and oxidative stress indicators， gastrocnemius muscle tissue was taken for HE section staining and autophagy related protein， Hippo/YAP/TAZ signal pathway protein and mRNA were detected. Results： （1） Compared with HE group， the structural damage， inflammatory reaction and oxidative stress of gastrocnemius muscle of rats in preconditioning group were significantly reduced after hypoxic exhaustive exercise. （2） The expression of Atg5 and Beclin1 protein in HE group was significantly lower than that in EP+HE group and EP/HP+HE group（P<0.05）， and the expression of Atg5 and Beclin1 protein in EP/HP+HE group was significantly higher than that in HP+HE group （P<0.05）; The expression of LC3-Ⅱ protein in HE group was significantly higher than that in EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）， and that in EP+HE group and EP/HP+HE group was significantly higher than that in HP+HE group （P<0.05）. （3） MST1 mRNA in HE group was significantly higher than that in EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）， and that in EP+HE group and EP/HP+HE group was significantly higher than that in HP+HE group （P<0.05）; LATS1 mRNA in HE group was significantly lower than that in preconditioning group （P<0.05）; YAP mRNA in HE group was significantly higher than that in preconditioning group （P<0.05）， while that in EP/HP+HE group was significantly lower than that in HP+HE group （P<0.05）; The mRNA of HE group and HP+HE TAZ was significantly higher than that of EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）. （4） MST1， LATS1 and their phosphorylation levels in HE group were significantly lower than those in EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）， and MST1 in EP/HP+HE group was significantly higher than those in HP+HE group （P<0.05）; YAP protein in HE group was significantly higher than that in EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）; TAZ protein in HE group was significantly higher than that in preconditioning group （P<0.05）， while that in EP/HP+HE group was significantly lower than that in HP+HE group （P<0.05）. Conclusion：Hypoxic exercise preconditioning may inhibit Hippo/YAP/TAZ signal pathway by activating skeletal muscle autophagy， thereby reducing skeletal muscle injury， inflammatory response and oxidative stress response in rats undergoing hypoxic exhaustive exercise.

Key words：hypoxic exercise preconditioning; autophagy; Hippo/YAP/TAZ signal path; acute hypoxic exhaustive exercise; skeletal muscle injury

急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可能形成機(jī)械、代謝及氧化等多方面、復(fù)合性壓力，短時(shí)間過度載荷可能誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，同時(shí)存在骨骼肌和內(nèi)臟器官組織損傷風(fēng)險(xiǎn)［1］。人體及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明［2］，急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)血清、骨骼肌、心肌等組織炎癥及骨骼肌損傷標(biāo)記物水平激增。此外，低氧條件下的急性運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)通過激活氧化應(yīng)激會(huì)加劇骨骼肌承受的復(fù)合壓力［3］。有研究認(rèn)為，模擬3 000 m海拔低氧環(huán)境75％～80％ HRmax強(qiáng)度力竭跑導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員血清骨骼肌損傷標(biāo)志物激增，且參與對(duì)抗壓力源的蛋白表達(dá)水平急劇增加［4］。近年來的研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)可激活機(jī)體自噬途徑，從而提高組織細(xì)胞自調(diào)控能力及能量穩(wěn)態(tài)［5］。自噬途徑激活可能參與急、慢性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌功能整合過程，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致機(jī)體自噬反應(yīng)激活、骨骼肌自噬小體激增［6］。然而，迄今為止，高強(qiáng)度力竭訓(xùn)練骨骼肌自噬反應(yīng)特征及其機(jī)制并未得到充分驗(yàn)證。有研究認(rèn)為，低氧條件下急性運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致骨骼肌自噬抑制，這可能與骨骼肌組織對(duì)低氧的“遲滯反應(yīng)”或運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激有關(guān)［7］。Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路在人類腫瘤發(fā)展、骨骼肌發(fā)育修復(fù)及肌衛(wèi)星細(xì)胞功能調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，此外有證據(jù)顯示該通路與骨骼肌組織自噬存在交互作用。Hippo通路影響骨骼肌自噬通量，廣泛參與骨骼肌內(nèi)組織穩(wěn)態(tài)、氧化損傷及修復(fù)過程，且靶向Hippo/YAP/TAZ自噬軸參與調(diào)控YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄活性［8］。研究證實(shí)，自噬機(jī)制扮演了YAP/TAZ的下游靶蛋白調(diào)節(jié)器，外源性自噬抑制劑干預(yù)或內(nèi)源性敲除自噬相關(guān)基因（ATG5/7/10）可抑制YAP及TAZ介導(dǎo)的細(xì)胞增殖能力［9］。

大量研究顯示，中短期中、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可能誘發(fā)間歇性相對(duì)/絕對(duì)心肌缺血缺氧，從而增強(qiáng)心肌對(duì)缺血缺氧的耐受能力，定量適應(yīng)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的組織保護(hù)作用稱為運(yùn)動(dòng)預(yù)處理（Exercise preconditioning，EP），EP可有效減輕高強(qiáng)度急性運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致的心肌缺血缺氧損傷［10］。重復(fù)性暴露于低氧可使機(jī)體組織和細(xì)胞獲得對(duì)缺氧的高度耐受性，該現(xiàn)象稱為低氧預(yù)適應(yīng)（Hypoxic preconditioning，HP）［11］。EP和HP對(duì)心肌、肺組織、腦組織的保護(hù)作用及機(jī)制已基本明了，但現(xiàn)階段缺乏對(duì)急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中骨骼肌等高活性組織保護(hù)作用的研究。同時(shí)，EP和HP的作用效應(yīng)存在趨同性，但其具體作用機(jī)制大相徑庭，現(xiàn)階段尚無證據(jù)闡明二者作用差異的分子學(xué)機(jī)制。自噬可能介導(dǎo)EP和HP的激活過程，但其機(jī)制仍存在較大爭(zhēng)議。多項(xiàng)研究證實(shí)，HP復(fù)氧階段通過下調(diào)Beclin1表達(dá)誘導(dǎo)自噬抑制現(xiàn)象，相反，外源性抑制自噬可能減弱EP誘導(dǎo)的組織細(xì)胞保護(hù)作用，表明自噬部分參與了EP和HP的組織細(xì)胞保護(hù)機(jī)制［12］。另有證據(jù)顯示，Hippo及其下行通路可能與低氧暴露骨骼肌損傷修復(fù)及組織保護(hù)密切相關(guān)［13］。基于上述結(jié)論，課題組假設(shè)Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路作為隱匿機(jī)制，通過將EP、HP誘導(dǎo)的間歇性骨骼肌缺血缺氧與自噬調(diào)控聯(lián)系起來，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)低氧力竭運(yùn)動(dòng)中骨骼肌的保護(hù)作用。因此，本研究擬針對(duì)低氧運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)大鼠低氧力竭運(yùn)動(dòng)后腓腸肌損傷、自噬水平及Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路表達(dá)進(jìn)行分析，探究低氧運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)激活自噬調(diào)控Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路減輕急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌損傷的基本機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)員高原訓(xùn)練、移居高原人群體育鍛煉及官兵高原駐訓(xùn)提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和主要儀器、試劑

50只6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重170±10 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（新）2016-0002。

主要儀器設(shè)備：常壓低氧發(fā)生設(shè)備（Hypoxic Tent System），大鼠實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（BHW-PT/5s），全自動(dòng)組織切片機(jī)（KH-Q330），顯微圖像分析系統(tǒng)（NGI-2000U），PCR擴(kuò)增儀（Biometra），酶標(biāo)儀（Bio-Rad），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf），EP凝膠成像系統(tǒng)（Alpha），電泳系統(tǒng)（Bio-Red），紫外分光光度計(jì)（Eppendorf）。

主要試劑：一氧化氮、丙二醛、超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶、白介素-6、白介素1β、腫瘤壞死因子-α試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒、Trizol總RNA抽提試劑、cDNA合成試劑盒、雙鏈cDNA合成試劑盒、dNTP Mixture、Taq PCR MasterMix均購自上海碧云天生物公司，cDNA引物Oligo購自上海生工公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自美國(guó)Proteintech公司，自噬相關(guān)5同源物（Atg5）、自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6同系物（Beclin1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1（MST1）、大腫瘤抑制因子1（LATS1）、Yes相關(guān)蛋白-1（YAP）及轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基（TAZ）單克隆抗體抗體購自美國(guó)Proteintech公司，Anti-β-actin內(nèi)參抗體、Mouse源二抗、Rabbit源二抗、6.6×8.5 cm PVDF膜均購自上海碧云天生物公司。

1.2 動(dòng)物分組及干預(yù)方案

動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)室條件適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為：空白對(duì)照組（Blank control group，Con組）、單純急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（Hypoxic exercise group，HE組）、低氧預(yù)適應(yīng)+急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（Hypoxic preconditioning+Hypoxic exercise group，HP+HE組）、運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（Exercise preconditioning +Hypoxic exercise group，EP+HE組）、低氧預(yù)適應(yīng)+運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)組（Hypoxic preconditioning+Exercise preconditioning+Hypoxic exercise group，EP/HP+HE組）。

預(yù)適應(yīng)干預(yù)前HE組、EP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性訓(xùn)練，3 d，1次/d，15 min/次，10～12 m/min，坡度0°，運(yùn)動(dòng)環(huán)境為常壓常氧；HE組、HP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進(jìn)行低氧環(huán)境適應(yīng)性暴露，3 d，1次/d，60 min，F(xiàn)iO2 14.5％（海拔約3000 m），常壓環(huán)境。

低氧運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)周期為2 w。Con組及HE組大鼠保持正常飲食及活動(dòng)，不參與預(yù)適應(yīng)干預(yù)方案；EP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，2次/d，早晚各1次，30 min/次，15～20 m/min，勻速漸增坡度0°～5°，運(yùn)動(dòng)環(huán)境為常壓常氧；HP+HE組及EP/HP+HE組大鼠晚間22：00～次日晨8：00于低氧帳篷休息，F(xiàn)iO2 13.5％（約3 500 m海拔），常壓環(huán)境。低氧運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)結(jié)束次日，HE組、HP+HE組、EP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進(jìn)行低氧環(huán)境跑臺(tái)力竭訓(xùn)練，F(xiàn)iO2 11.9％～12.0％（約4 500 m海拔），10～20 m/min遞增跑速至力竭，運(yùn)動(dòng)過程中采用聲、頻閃光及電流刺激。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為：①大鼠呼吸短促，無力維持既定跑速；②后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30 s，經(jīng)聲、頻閃光及電流刺激均無反應(yīng)。

1.3 動(dòng)物處置、取樣

低氧力竭訓(xùn)練2 h后，麻醉、空腹?fàn)顟B(tài)尾靜脈取血；迅速固定，取大鼠后肢腓腸肌，剔除筋膜及脂肪組織，生理鹽水反復(fù)漂洗，吸水紙擦干水分，經(jīng)液氮急速低溫后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 血清和腓腸肌組織勻漿制備

大鼠全血室溫自凝45 min，4℃、2 000 rpm離心10 min取上清即為血清；取500 mg腓腸肌組織，剪碎，加入PBS勻漿介質(zhì)，2 000 r/min勻漿2 min，勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管，4℃、6 000 r/min，離心10 min，取上清-80℃保存。

1.4.2 生化檢測(cè)

取預(yù)先制備血清，采用試劑盒檢測(cè)血清一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）及肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）水平。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

取預(yù)先制備血清，按照試劑盒說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至10 μg/mL、加樣并設(shè)空白孔和待測(cè)樣品孔，37℃孵育20 min，甩干液體，PBST重復(fù)洗滌3次，待測(cè)樣品孔加入酶標(biāo)試劑液，37℃孵育20 min，PBST重復(fù)洗滌3次，TMB底物顯色，加入終止液，450 nm處測(cè)OD值，濃度轉(zhuǎn)換，以此檢測(cè)白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）。

1.4.4 腓腸肌組織病理染色

取大鼠腓腸肌組織，PBS沖洗，4％多聚甲醛固定24 h；梯度酒精（75％、85％、95％×2、100％×2）各脫水1 h，二甲苯透明，重復(fù)2次，各30 min；50℃～52℃浸蠟2次，各1 h；組織包埋，凝固后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱保存。沿樣品橫截面切片，厚度8 μm，40℃水浴展片，60℃烤片過夜。二甲苯脫蠟3次，各10 min；梯度酒精（100％×2、95％×2、85％、75％）及蒸餾水各復(fù)水5 min。Harris蘇木素液浸染5 min，漂洗；1％鹽酸酒精脫色5 s，飽和磷酸氫二鈉溶液反藍(lán)10 min，70％、80％酒精各固定10 min；伊紅液染色30 s，烤干、封片；鏡下觀察，切片中心視野采集圖像。

1.4.5 RT-PCR

取200 μL腓腸肌勻漿液，采用Trizol法提取組織液總RNA，電泳檢測(cè)完整性，分光光度儀檢測(cè)RNA純度及濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL、ddH2O 7 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、2×Taq PCR master mix10 μL，條件為95℃初始變性55 s；然后在95℃變性10 s，57℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)熔解曲線剔除異常數(shù)據(jù)，導(dǎo)入相對(duì)定量公式（2-ΔΔCt）逐個(gè)計(jì)算樣品基因的相對(duì)表達(dá)量，目標(biāo)基因及其引物序列見表1。

1.4.6 蛋白印跡檢測(cè)

取200 μL腓腸肌勻漿液，采用RIPA法提取組織總蛋白，4℃，15 000 g離心20 min；取上清液使用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，95℃變性15 min。配置SDS-PAGE凝膠，濃縮膠恒壓80 V電泳30 min，分離膠恒壓110 V電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，20 μg上樣，用電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5％脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗（1[DK]∶1 000稀釋），4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜10 min×3次，加二抗（1[DK]∶3 000稀釋），37℃孵育40 min；TBST洗膜10 min×5次。ECL法顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像后使用Quantity One3.0軟件分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（MEAN±SD）表示，兩樣本平均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)分析，多樣本平均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）和兩因素方差分析（one way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清骨骼肌損傷標(biāo)志物變化

本研究對(duì)各組大鼠血清骨骼肌損傷指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明（見表2），與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)各組LDH和CK水平均顯著上升（P<0.05）?？梢?，HE組及預(yù)適應(yīng)組大鼠均出現(xiàn)不同程度骨骼肌損傷。與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組血清LDH及CK水平均顯著下降（P<0.05）；預(yù)適應(yīng)組間比較可知，EP/HP+HE組血清LDH顯著低于HP+HE組及EP+HE組（P<0.05）；EP+HE組血清LDH及CK低于HP+HE組，但比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果說明，急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠骨骼肌損傷標(biāo)志物水平激增，2 w低氧和/或運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)降低了低氧力竭后運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌損傷。

2.2 各組大鼠血清炎癥因子變化

本研究檢測(cè)了各組大鼠血清炎癥標(biāo)志物水平，結(jié)果表明（見表3），與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)各組血清IL-6、IL-1β及TNF-α均顯著上升（P<0.05）。就IL-6而言，與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著降低（P<0.05），預(yù)適應(yīng)組內(nèi)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；就IL-1β而言，與HE組比較，EP/HP+HE組顯著降低（P<0.05），HP+HE組及EP+HE組呈下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；就TNF-α而言，與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著降低（P<0.05），EP+HE組及EP/HP+HE組顯著低于HP+HE組（P<0.05）。上述結(jié)果表明，急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠血清炎癥標(biāo)志物水平激增，2 w低氧和/或運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)降低了低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠炎癥水平。

2.3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物變化

本研究檢測(cè)了各組大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平，結(jié)果表明（見表4），與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)各組血清NO、MDA均顯著上升（P<0.05），血清SOD顯著下降（P<0.05）。就NO而言，與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著降低（P<0.05），EP/HP+HE顯著低于HP+HE組及EP+HE組（P<0.05），可見低氧+運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)血清NO的影響顯著效果高于單一預(yù)適應(yīng)；就MDA而言，與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著降低（P<0.05），EP/HP+HE組顯著低于HP+HE組及EP+HE組（P<0.05），EP+HE組顯著低于HP+HE組（P<0.05）；就SOD而言，與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著上升（P<0.05），EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。上述結(jié)果表明，急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平明顯波動(dòng)，2 w低氧和/或運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)降低了低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠氧化應(yīng)激水平，低氧+運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響可能好于單一預(yù)適應(yīng)。

2.4 各組大鼠腓腸肌組織微細(xì)結(jié)構(gòu)病理變化

Con組大鼠腓腸肌肌纖維結(jié)構(gòu)正常，呈多邊形，排列有序，細(xì)胞核分布于肌細(xì)胞邊緣，顏色、邊界及形態(tài)均正常；HE組肌纖維腫脹、碎解，炎癥組織浸潤(rùn)明顯，組織間隙散布不均，細(xì)胞排列混亂。預(yù)適應(yīng)組較HE組肌纖維腫脹及炎癥組織浸潤(rùn)減輕，細(xì)胞形態(tài)及邊界組織趨于正常。此外，預(yù)適應(yīng)各組鏡下比較可知，EP+HE組、EP/HP+HE組肌纖維腫脹及炎癥組織浸潤(rùn)癥狀減輕，肌細(xì)胞及組織邊界清晰（見圖1）。

2.5 各組大鼠腓腸肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

本研究對(duì)各組大鼠骨骼肌自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin1及LC3-Ⅱ進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見圖2），與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠腓腸肌Atg5及Beclin1蛋白呈下降趨勢(shì)，LC3-Ⅱ蛋白呈上升趨勢(shì)。就Atg5蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)各組均顯著下降（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就Beclin1蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，HE組及HP+HE組顯著降低（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，HE組及HP+HE組顯著上升（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著降低（P<0.05）；EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。上述結(jié)果表明，急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠腓腸肌組織自噬水平被抑制，2 w低氧和/或運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)提高了低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌自噬水平，低氧+運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌自噬的影響可能好于單一預(yù)適應(yīng)。

2.6 各組大鼠腓腸肌Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)的變化

本研究檢測(cè)了各組大鼠腓腸肌MST1、LAST1、YAP及TAZ mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見圖3），與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)組MST1、LATS1 mRNA顯著降低（P<0.05），YAP及TAZ mRNA顯著上升（P<0.05）。就MST1 mRNA表達(dá)而言，與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就LATS1蛋白表達(dá)而言，與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著上升（P<0.05）。就YAP蛋白表達(dá)而言，與HE組比較預(yù)適應(yīng)組均顯著降低（P<0.05）；EP/HP+HE組顯著低于HP+HE組（P<0.05）。就TAZ蛋白表達(dá)而言，與HE組及HP+HE比較，EP+HE組及EP/HP+HE組均顯著降低（P<0.05）。上述結(jié)果表明，急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)抑制大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1 mRNA表達(dá)，同時(shí)上調(diào)YAP及TAZ mRNA表達(dá)；2 w低氧和/或運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)提高了低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1 水平并下調(diào)YAP、TAZ mRNA表達(dá)。

2.7 各組大鼠腓腸肌Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化

本研究對(duì)各組大鼠骨骼肌Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路蛋白MST1、LATS1、YAP及TAZ進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見圖4），與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)組MST1、LATS1蛋白及其磷酸化呈下降趨勢(shì)，YAP及TAZ蛋白呈上升趨勢(shì)。就MST1蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，HE組、HP+PE組及EP+HP組均顯著下降（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就p-MST1蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)組顯著降低（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就LATS1蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，HE組及HP+HE組顯著降低（P<0.05）；與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著上升（P<0.05）；EP+HE組及[CM（23]EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就p-LATS1蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，HE組及HP+HE組顯著降低（P<0.05）；與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著上升（P<0.05）；EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就YAP蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，低氧力竭運(yùn)動(dòng)組均顯著上升（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組均顯著降低（P<0.05）。就TAZ蛋白表達(dá)而言，與Con組比較，HE組、HP+HE組及EP+HE組均顯著上升（P<0.05）；與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組均顯著降低（P<0.05），EP/HP+HE組均顯著低于HP+HE組（P<0.05）。上述結(jié)果表明，急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)抑制大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1蛋白及磷酸化水平，同時(shí)導(dǎo)致 Hippo/YAP/TAZ通路下游蛋白YAP、TAZ表達(dá)上升；2 w低氧和/或運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)提高了低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1蛋白及磷酸化水平并下調(diào)YAP、TAZ蛋白表達(dá)。

3 討 論

3.1 EP+HP對(duì)骨骼肌損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響

研究證實(shí)，急性劇烈運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致機(jī)體廣泛炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和骨骼肌損傷，低氧環(huán)境可能進(jìn)一步強(qiáng)化機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)［14］。IL-6是免疫級(jí)聯(lián)中重要的基礎(chǔ)免疫因子，大強(qiáng)度急性運(yùn)動(dòng)后，肌肉細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β可能通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解參與肌肉適應(yīng)調(diào)控，IL-6刺激中性粒細(xì)胞脫顆粒及皮質(zhì)醇生成。TNF-α可由嗜中性粒細(xì)胞、活化的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和部分轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生，TNF-α以分泌的可溶形式和膜錨定形式存在，短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可刺激IL-6、TNF-α及IL-1β大量分泌［15］。王成美等認(rèn)為［16］，單次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致機(jī)體血清TNF-α、IL-6激增。Dufaux等［17］亦證實(shí)，2～5 h跑測(cè)驗(yàn)和5 km賽跑后均可見血清TNF-α、IL-1β升高。血清CK、LDH是骨骼肌損傷的早期標(biāo)志物，廣泛存在于體內(nèi)組織器官及血清，對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)敏感度較高，在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后參與誘導(dǎo)骨骼肌損傷。此外，為進(jìn)一步探究低氧高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響，本研究設(shè)置了氧濃度11.9％～12.0％（約4 500 m海拔）環(huán)境的力竭跑臺(tái)訓(xùn)練，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌結(jié)構(gòu)損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)與單純力竭訓(xùn)練相似，且低氧環(huán)境加劇了大鼠腓腸肌結(jié)構(gòu)損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激現(xiàn)象。此外本研究亦發(fā)現(xiàn)，2 w EP或HP明顯減輕了大鼠低氧力竭運(yùn)動(dòng)后的腓腸肌結(jié)構(gòu)損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激現(xiàn)象，且EP+HP對(duì)骨骼肌損傷的預(yù)防作用可能優(yōu)于單純HP或EP。以往的研究認(rèn)為，在組織細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)上，EP與HP都可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)效應(yīng)，且EP誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的內(nèi)源性保護(hù)效應(yīng)與HP相似，HP和EP干預(yù)可能分別改善機(jī)體低氧耐受及骨骼肌性能［18］。但上述機(jī)制并非互相獨(dú)立，機(jī)體對(duì)低氧條件的短期適應(yīng)可能形成通氣能力上升、骨骼肌微血管增生、骨骼肌代謝底物增加、低氧緩沖能力改善等優(yōu)勢(shì)，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)也可能獲得類似適應(yīng)現(xiàn)象。因此，EP+HP可能形成骨骼肌缺氧、機(jī)械負(fù)荷的累積效應(yīng)，在早期的低氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中，EP+HP功能性適應(yīng)的保護(hù)效應(yīng)增強(qiáng)，機(jī)體產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性適應(yīng)并改善骨骼肌耐低氧、耐負(fù)荷能力，從而減輕急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激癥狀。對(duì)于EP和HP的保護(hù)目標(biāo)而言，現(xiàn)有的研究集中于心肌、肺、腦、腎、腸粘膜等器官組織，極少有研究涉及骨骼肌保護(hù)效應(yīng)，本研究表明，單純或復(fù)合形式的2 w EP和HP可以作為避免急性低氧高強(qiáng)度訓(xùn)練骨骼肌損傷及炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)的措施，但EP和HP配合干預(yù)的周期、強(qiáng)度、頻率、形式等因素仍不明確，有賴于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

3.2 EP+HP對(duì)骨骼肌自噬蛋白的影響

低氧是誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)刺激劑，同時(shí)也是激活骨骼肌自噬的重要外源性因素。骨骼肌自噬可清除受損線粒體，同時(shí)抑制線粒體產(chǎn)生ROS，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，有研究證實(shí)自噬可能參與EP或HP組織器官的適應(yīng)過程［19］。Atg5、Beclin-1和LC3-Ⅱ是機(jī)體自噬與凋亡過程的重要信號(hào)分子，Atg5參與介導(dǎo)自噬體的形成，而Beclin-1通過組成PtdIns3KC3復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，Atg5可能介導(dǎo)了LC3-Ⅱ和Beclin-1激活所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡過程［20］。因此，本研究以骨骼肌自噬為切入點(diǎn)，探討EP+HP大鼠腓腸肌自噬的變化規(guī)律。自噬是一種溶酶體依賴性降解過程，在細(xì)胞能量平衡和細(xì)胞器更新中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，自噬可能通過禁食、缺血/再灌注（I/R）、低氧暴露或運(yùn)動(dòng)等方式激活［21］。LIU等發(fā)現(xiàn)，晚期EP可通過激活自噬減輕力竭性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌損傷［22］，HUANG等亦證實(shí)EP上調(diào)Beclin1表達(dá)并誘導(dǎo)自噬形成早期心肌保護(hù)效應(yīng)［23］。有研究顯示，長(zhǎng)期低氧運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致自噬效應(yīng)增強(qiáng)進(jìn)而發(fā)揮組織保護(hù)效應(yīng)。本研究結(jié)果表明，低氧力竭運(yùn)動(dòng)組導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌Atg5、Beclin1表達(dá)降低并上調(diào)了LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)。研究認(rèn)為，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后12 h內(nèi)骨骼肌自噬體可能存在抑制期，可能與骨骼肌微管丟失有關(guān)［24］，該結(jié)果基本佐證了本研究結(jié)論。前期研究顯示，急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和ATP耗竭可能導(dǎo)致骨骼肌組織Beclin1表達(dá)上調(diào)，Beclin1-Bcl-2復(fù)合體裂解是誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵機(jī)制［25］。低氧條件下力竭訓(xùn)練骨骼肌總負(fù)載量過高，可能抑制Beclin1-Bcl-2復(fù)合體裂解并降低Beclin1表達(dá)。此外，本研究結(jié)果顯示，與HE組比較，預(yù)適應(yīng)組大鼠低氧力竭運(yùn)動(dòng)后腓腸肌Atg5、Beclin1表達(dá)上升，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)下降，因此，EP、HP或其累積結(jié)果導(dǎo)致自噬活動(dòng)增強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，Beclin1及其激活物Atg5的上調(diào)與AMPK、PI3K、ULK1和mTOR的上游介導(dǎo)有關(guān)，這些標(biāo)志物先前已被證明參與EP和HP誘導(dǎo)的組織保護(hù)作用［26］。EP、HP誘導(dǎo)的自噬效應(yīng)促進(jìn)Beclin1-Bcl-2復(fù)合物裂解，Beclin1蛋白表達(dá)上升，I/R或單純低氧暴露也表現(xiàn)出類似結(jié)果［27］。本研究中大鼠腓腸肌自噬蛋白Atg5、LC3-Ⅱ和Baclin1的變化情況表明，EP、HP可代償性上調(diào)自噬通量水平，進(jìn)而發(fā)揮其降解氧化損傷蛋白、ROS和衰老細(xì)胞器等亞細(xì)胞組件的功效，進(jìn)而減輕低氧力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌損傷、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3.3 EP+HP對(duì)骨骼肌Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路的影響

現(xiàn)有研究證據(jù)表明，Hippo/YAP/TAZ通路是一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，與廣泛的生理事件有關(guān)，包括細(xì)胞增殖、遷移及自噬的調(diào)節(jié)［28］。在哺乳動(dòng)物中，Hippo信號(hào)通路的主要功能是抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子YAP和TAZ的活性，其核心組成元件為MST1和LATS1［29］。運(yùn)動(dòng)可以通過改變靶向基因的表達(dá)激活Hippo/YAP/TAZ通路，同時(shí)該通路的激活程度受運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量的影響，如，有研究顯示，EP可導(dǎo)致小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、JG12和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，Bax、Caspase 3、IL-6和衰老細(xì)胞的表達(dá)降低，導(dǎo)致MST1及其下游信號(hào)分子LAST1上調(diào)，進(jìn)而下調(diào)YAP及TAZ表達(dá)［30］。另有研究證實(shí)，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練尤其是高強(qiáng)度急性運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致Hippo/YAP/TAZ通路抑制現(xiàn)象［31］。研究表明，YAP和TAZ活性通過上游調(diào)節(jié)器MST1、LATS1負(fù)反饋轉(zhuǎn)錄機(jī)制控制［32］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，急性力竭運(yùn)動(dòng)和短期低氧暴露（12.5％，48 h）可誘導(dǎo)骨骼肌YAP、TAZ表達(dá)上調(diào)，這表明骨骼肌在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)負(fù)荷作用下出現(xiàn)降解效應(yīng)［33］。此外，Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良mdx模型小鼠腓腸肌總YAP、TAZ及其磷酸化水平也呈上升趨勢(shì)，因此運(yùn)動(dòng)、低氧或異常骨骼肌肥大均導(dǎo)致骨骼肌MST1、LAST1蛋白及其下游標(biāo)志物YAP、TAZ表達(dá)異常［34］。該結(jié)果佐證了本研究中低氧力竭訓(xùn)練大鼠腓腸肌Hippo/YAP/TAZ通路標(biāo)志物變化特征。上述結(jié)論與本研究結(jié)果基本一致，急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)抑制大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1蛋白及磷酸化水平，同時(shí)導(dǎo)致下游蛋白YAP、TAZ表達(dá)上升。

本研究發(fā)現(xiàn)，EP、HP提高了低氧力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1蛋白及磷酸化水平并下調(diào)YAP、TAZ蛋白表達(dá)?，F(xiàn)階段研究證實(shí)，Hippo信號(hào)通路可能參與介導(dǎo)AKT/AMPK/mTOR級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Hippo激酶MST1可結(jié)合并抑制Akt1表達(dá)活性，Akt也可反向激活MST1磷酸化，表明Akt1和MST1存在雙向調(diào)節(jié)機(jī)制［35］。此外，Hippo通路效應(yīng)器YAP通過Pten靶向抑制磷酸酶Pten及mTOR表達(dá)［36］?？傊?，上述研究表明Hippo和mTOR介導(dǎo)的骨骼肌功能調(diào)節(jié)信號(hào)通過多種機(jī)制緊密耦合。AMPK在機(jī)體內(nèi)扮演細(xì)胞能量代謝“調(diào)節(jié)器”角色，在氧化應(yīng)激或極端條件下對(duì)細(xì)胞能量代謝的適應(yīng)性調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，mTOR信號(hào)通路是蛋白合成的主要通路，有學(xué)者猜測(cè)mTOR可能是調(diào)控骨骼肌內(nèi)組織代謝的核心靶點(diǎn)［37］。EP+HP累積效應(yīng)可能導(dǎo)致肌內(nèi)AMP/ATP比值及LKB1活性紊亂，AMPK-TSC2信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，同時(shí)誘導(dǎo)mTOR活性上升，進(jìn)而下調(diào)肌內(nèi)YAP及TAZ表達(dá)。但目前的研究證據(jù)尚無法充分解釋Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路是否在規(guī)律性運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮骨骼肌功能調(diào)控作用，但EP及HP可能通過AKT/AMPK/mTOR-Hippo/YAP/TAZ逆向調(diào)節(jié)發(fā)揮低氧力竭運(yùn)動(dòng)中骨骼肌整合作用。此外，多項(xiàng)研究證實(shí)，自噬激活現(xiàn)象抑制了YAP及TAZ表達(dá)［38］，本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。mTORC1信號(hào)是自噬途徑主要的上游抑制通路，而在TSC1缺失的細(xì)胞中，mTORC1通路則維持組成型激活狀態(tài)［39］。LIANG等研究表明，在敲除TSC1后，細(xì)胞自噬及Hippo通路下游物均顯著抑制［40］。有文獻(xiàn)報(bào)道，YAP及TAZ蛋白可以與自噬途徑的受體蛋白Beclin1交互影響，進(jìn)而被Beclin1呈遞至自噬體內(nèi)經(jīng)由溶酶體降解［41］。因此，EP+HP可能通過激活骨骼肌自噬下調(diào)低氧力竭運(yùn)動(dòng)大鼠YAP、TAZ表達(dá)，并可能參與AKT/AMPK/mTOR級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控骨骼肌損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

4 結(jié) 論

低氧和/或運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可有效減輕急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及骨骼肌損傷；低氧和/或運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可通過激活自噬反應(yīng)調(diào)控骨骼肌Hippo/YAP/TAZ信號(hào)通路并發(fā)揮急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)中的骨骼肌保護(hù)機(jī)制。

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收稿日期：2022-11-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：31660736）；新疆維吾爾自治區(qū)高?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：XJEDU2021SY040）。

作者簡(jiǎn)介：孔海軍（1992- ），男，山東濟(jì)寧人，博士研究生，講師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生物化學(xué)。

通訊作者：諶曉安（1974- ），女，湖南張家界人，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)人體科學(xué)。