HPLC法同時測定宮血停顆粒中六種成分的含量

胡生俊，朱昱，陳娟

宿遷市食品藥品檢驗所，宿遷223800

宮血停顆粒是由黃芪、益母草、女貞子、升麻、枳殼、當歸等11 味藥材經(jīng)水提醇沉工藝加工而成的中藥復方制劑，具補益脾腎，活瘀止血的功效，用于脾腎兩虛，氣虛血瘀而致的月經(jīng)過多及崩漏。崩漏是婦人在更年期及青春期均常見的疾病，臨床治療存在復發(fā)率高和副作用明顯等特點，宮血停顆粒既有中藥靈活多變的特點，而又服用方便，治療婦人脾腎虧虛型崩漏療效滿意[1]。宮血停顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標準為《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十七冊，檢驗項目僅有兩項化學反應[2]，無法有效控制藥品質(zhì)量，且僅見HPLC-ELSD 法測定該藥中黃芪甲苷含量的文獻報道[3，4]。本文采用HPLC 法同時測定宮血停顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、異阿魏酸、特女貞苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量，分別作為指標成分以反映處方中黃芪、當歸、升麻、女貞子、枳殼5 味藥材的質(zhì)量及投料情況，結(jié)果表明該方法簡便、準確、快速，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，為宮血停顆粒質(zhì)量標準的提高提供了實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo UltiMate3000 液相色譜儀（DAD 檢測器）、Chromeleon7 色譜工作系統(tǒng)購自美國賽默飛公司、XPE205DR 電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團）、Milli-Q 超純水機（美國密理博公司）等。

1.2 試藥

宮血停顆粒3 批（陜西步長高新制藥有限公司，批號20220521、20220708、20221115）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號111920-201907，純度96.8%）、阿魏酸對照品（批號110773-201915，純度99.4%）、異阿魏酸對照品（批號111698-201904，純度99.3%）、特女貞苷對照品（批號111926-201906，純度95.0%）、柚皮苷對照品（批號110722-202116，純度93.5%）和新橙皮苷對照品（批號111857-201804，純度99.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純（德國默克公司）；水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測波長225 nm；以乙腈為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～15 min，15% A；15～20 min，15%→20% A；20～25 min，20% A）；柱溫35℃；流速1 mL·min-1；進樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品約14 mg、阿魏酸對照品約14 mg、異阿魏酸對照品約14 mg、特女貞苷對照品約46 mg、柚皮苷對照品約86 mg、新橙皮苷對照品約75 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2 mL，置20 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細，取約2 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加甲醇約40 mL，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）30 min，放冷，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 依照處方，分別制備不含黃芪、當歸、升麻、女貞子、枳殼的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學驗證[5]

2.3.1 系統(tǒng)適用性及專屬性考察 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，6 種成分峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于8000。供試品色譜圖種出現(xiàn)與對照品溶液中6 種成分保留時間一致的色譜峰，且相應的二極管陣列檢測器（DAD）光譜也一致。阿魏酸作為當歸和升麻共有成分[6]，在缺當歸的陰性樣品圖1D 和缺升麻的陰性樣品圖1E 中均檢出阿魏酸成分，其他陰性樣品中在相應指標成分位置均未檢出色譜峰，表明本法專屬性良好。

圖1 宮血停顆粒對照品溶液（A）、供試品溶液（B）、黃芪（C）、當歸（D）、升麻（E）、女貞子（F）、枳殼（G）陰性樣品溶液HPLC 色譜圖

2.3.2 線性關系考察 分別精密量取“2.2.1”項下的對照品貯備液2 mL，分別置5、10、20、50、100、200 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。將上述6份系列濃度對照溶液按“2.1”項下的色譜條件進樣，記錄峰面積，以峰面積（Y，mAU*s）為縱坐標，濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，進行線性回歸，得到6 種成分的回歸方程及線性范圍（n=6），結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關系

2.3.3 儀器精密度考察 取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，重復進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，6 種成分的峰面積RSD 值分別為0.86%、1.05%、0.93%、0.57%、0.65%、0.37%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性考察 取同一批宮血停顆粒6份，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，采用外標法計算6 種成分的含量結(jié)果，結(jié)果顯示，6 種成分的含量結(jié)果RSD 值分別為0.53%、0.47%、0.29%、0.66%、0.37%、0.41%（n=6）。三名實驗人員分別對同一批宮血停顆粒進行含量測定，結(jié)果顯示6 種成分的含量結(jié)果RSD值分別為1.24%、0.95%、0.83%、1.02%、0.29%、0.53%（n=3）。表明方法的重復性和中間精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取“2.2”項下的對照品溶液和供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項下的色譜條件進樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，6 種成分的峰面積RSD 值均小于2.0%（n=6），表明各成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率考察 取已知含量的宮血停顆粒（批號20220521）6份，研細，精密稱取1 g，置50 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項下對照品貯備液2.5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，用實測值與供試品含有量之差，除以對照品加入量計算各成分加樣回收率和RSD（n=6），結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率

2.3.7 耐用性考察 使用兩種不同液相色譜儀（Thermo UltiMate3000、Agilent 1260II），三種不同品牌相同長度及填料的液相色譜柱（Agilent TCC18、Diamonsil C18、Supfex JX-C18），采用外標法對同一份樣品中6 種成分進行含量測定，結(jié)果6 種成分的含量結(jié)果RSD 值均小于2.0%（n=6），各成分分離度均大于1.5。調(diào)節(jié)流動相初始比例（乙腈占比14%、15%、16%），磷酸溶液的濃度（0.05%、0.1%、0.5%、1.0%），各成分分離情況無明顯變化，分離度均大于1.5，表明方法的耐用性良好。

2.4 樣品測定

取三批宮血停顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄各成分的峰面積，采用外標法，計算各成分含量，結(jié)果見表3。

表3 宮血停顆粒中各成分的含量（mg·g-1）

3 討論

3.1 流動相的選擇

實驗過程中，分別考察了甲醇、乙腈作為有機相的流動相體系，結(jié)果顯示，乙腈-0.5%磷酸溶液流動相體系使各成分分離效果最佳。乙腈-0.5%磷酸溶液（15∶85）亦能使各組分完全分離，但是新橙皮苷的出峰時間較遲且理論塔板數(shù)較低，因此選擇本文中的梯度洗脫方法，使新橙皮苷出峰時間提前且理論塔板數(shù)更高。

3.2 檢測波長的選擇

使用DAD 檢測器掃描對照品溶液色譜圖，獲得190～400 nm 各成分的光譜圖（圖2），考慮到目前國家藥品標準中同一方法下少見多波長進行含量測定，且單一波長測定可以擴大方法適用性，故選定在225 nm 光譜下同時測定6 個成分的含量。

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷（A）、阿魏酸（B）、異阿魏酸（C）、特女貞苷（D）、柚皮苷（E）及新橙皮苷（F）對照品光譜圖

3.3 供試品溶液制備方法的確定

實驗過程中，考察了提取溶劑的種類以及提取方法。分別比較了50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)50%甲醇、甲醇的提取效果較好，但是由于樣品中含有大量糖粉，50%甲醇制備的供試品溶液粘度大、難過濾，故選擇甲醇作為提取溶劑[7]。分別比較了不同時間的超聲提取和加熱回流提取，發(fā)現(xiàn)二者提取效果相當，無顯著性差異，但是超聲處理更為便捷，故選擇超聲提取30 min 作為樣品的提取方法。

3.4 檢測成分的選擇

《中國藥典》2020 年一部中以黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、當歸中阿魏酸、升麻中異阿魏酸、女貞子中特女貞苷、枳殼中柚皮苷和新橙皮苷作為各藥材的含量測定指標成分[6]，本文采用HPLC 法同時測定6 種成分以反映處方中黃芪、當歸、升麻、女貞子、枳殼5 味藥材的質(zhì)量及投料情況。宮血停顆粒處方中益母草藥材的指標成分為鹽酸水蘇堿，鹽酸水蘇堿在C18色譜柱保留較弱，通常采用SCX-強陽離子交換樹脂柱進行分離，故本文未對益母草進行研究。