蝴蝶豆種質(zhì)資源芽期耐鹽性篩選及評價

王燕茹　袁秉琛　孫郁婷　王志勇　虞道耿

關(guān)鍵詞：蝴蝶豆；相關(guān)性分析；主成分分析；隸屬函數(shù)；聚類分析

中圖分類號：S541.9 文獻標識碼：A

世界上約20%的耕地屬于鹽堿地[1]。而土壤鹽度是降低植物生產(chǎn)力的主要非生物脅迫之一，因此人們生產(chǎn)耐鹽作物的必要性顯而易見[2]。目前篩選種植耐鹽植物是利用鹽堿地最科學高效的方式[3]。眾所周知，植物的耐鹽強弱一般隨不同物種和不同生長階段而發(fā)生變化[4]。鹽脅迫條件下，植物最敏感的階段是芽期和苗期[5]。因而，對芽期或苗期的植物進行耐鹽測試，能從大量材料中快速有效地篩選出耐鹽種質(zhì)。鹽害主要是土壤可溶性鹽分過高改變植物的細胞膜透性，使植物細胞失水，并阻礙植物進行光合作用，對植物的生長不利[6-7]，嚴重時致死。

蝴蝶豆是豆科距瓣豆屬多年生纏繞性草本，具有根深、莖細、葉大、產(chǎn)量高不易木質(zhì)化等特點，年產(chǎn)鮮莖葉可達30～45 t/hm2；營養(yǎng)豐富，適口性好，作為青飼料可為各種家畜提供高蛋白，也可曬制成干草[8]，是優(yōu)良綠肥和覆蓋植物、飼料[9]，生長管理粗放能在貧瘠的磚壤土中生長；并且它極其耐旱、耐蔭，適口性好，可固氮，能抵御葉斑病和紅蜘蛛侵害，抵制雜草入侵，具有極大的種植潛力[10-15]。目前已在草地早熟禾[16]、狗牙根[17]、豇豆[18]等多種草本、豆科植物的不同生育期開展了耐鹽性鑒定與篩選。國內(nèi)外對蝴蝶豆的研究主要包括其苗期耐鹽[19]、抗旱[20]、高溫脅迫[21]等一些抗逆性研究，但都未形成可靠有效的評價體系。嚴琳玲等[19]對20 份蝴蝶豆種質(zhì)材料苗期進行不同鹽濃度脅迫，將其分為2 類：耐鹽型種質(zhì)和不耐鹽種質(zhì)。相對于蝴蝶豆而言耐鹽性研究略有欠缺，且作為優(yōu)質(zhì)牧草、綠肥能夠更加廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)、生活中。故此，評估現(xiàn)有75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)資源的耐鹽性強弱，挑選出耐鹽種質(zhì)，大面積種植之后，不僅提高生產(chǎn)量也實現(xiàn)了高效利用鹽堿地的目標。

本研究以75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)為材料，鹽脅迫針對芽期做處理，記錄相關(guān)的形態(tài)，并利用隸屬函數(shù)、主成分分析、聚類分析等評價方法對蝴蝶豆屬種質(zhì)萌芽期耐鹽性進行評價，得出鑒定蝴蝶豆耐鹽性的最適濃度和篩選耐鹽性的指標，并對不同評價方法所得結(jié)果進行聚類分析，最終挑選出耐鹽性較強的材料。為開發(fā)耐鹽優(yōu)異的蝴蝶豆資源和培育耐鹽性強的新品種提供材料和理論支持，為前人研究進行補充。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用75 份蝴蝶豆種質(zhì)由國家熱帶牧草種質(zhì)資源中期（備份）庫提供。包括CIAT 國外引進的資源和國內(nèi)野外收集的資源，共1 屬3 種75 份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫濃度確定 從所有距瓣豆屬種質(zhì)資源材料中隨機選取7 份，挑選均勻、飽滿、健康的種子。采用培養(yǎng)濾紙法。鹽（NaCl）濃度為：0、50、100、150、200、250 mmol/L，以50 mmol/L為梯度設(shè)置。每濃度處理3 個重復(fù)，每重復(fù)種子30 粒。種子用75%酒精浸泡15 min，再用10%的過氧化氫浸泡30 s 殺菌、消毒，再用清水清洗，打破種子休眠，待用。將種子均勻地置于90 mm的培養(yǎng)皿中，每處理添加10 mL 對應(yīng)的鹽溶液，放入培養(yǎng)箱中進行恒溫培養(yǎng)（25 ℃，16 h 光照，8 h 黑暗，光強4000 lx）。每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，第6 天發(fā)芽停止，結(jié)束試驗，測量其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長、芽長等。發(fā)芽標準：胚根長≥種子長度的1/2。

1.2.2 芽期耐鹽種質(zhì)篩選 確定適宜篩選濃度150 mmol/L，處理組加入10 mL 該濃度鹽溶液，對照組加入等量的蒸餾水，每種質(zhì)3 個重復(fù)，每個重復(fù)50 粒。種子處理方法同1.2.1，并測量相關(guān)指標：

發(fā)芽率=發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢=6 d 發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)=Σ 每天發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)

根冠比=根長/芽長

相對值=鹽處理測定值/對照處理測定值

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和IBM SPSS 軟件對所測數(shù)據(jù)進行處理和分析。計算每項指標的隸屬函數(shù)值和平均隸屬函數(shù)值，參考張會麗等[22]的方法；計算權(quán)重（W_j）和綜合得分值（Z_j），參考劉丙花等[23]和李艷輝等[24]的方法，如以下公式所示。利用系統(tǒng)聚類法，將所有種質(zhì)分類，得到種質(zhì)資源聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選耐鹽種質(zhì)的適宜鹽濃度

為了確定蝴蝶豆萌芽期耐鹽的適宜篩選濃度，隨機挑選7 份蝴蝶豆種質(zhì)在不同鹽濃度下進行處理。由表2、表3，圖1 可知，當鹽濃度為0～100 mmol/L 時，各組材料間的發(fā)芽勢和發(fā)芽率大多在50%以上，相比差異均不顯著；鹽濃度為200～250 mmol/L 時，多組材料的發(fā)芽勢均低于40%，發(fā)芽率均低于30%，且個別組的材料表現(xiàn)未發(fā)芽，由此可見鹽濃度越高對種子萌發(fā)影響力越大甚至導(dǎo)致其死亡；但鹽濃度在150 mmol/L時，各組材料的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均值為50%的約占1/2，這說明各種質(zhì)在此濃度下表現(xiàn)差異顯著，可有效區(qū)分各種質(zhì)的耐鹽差異性。因此，本研究借助發(fā)芽勢、發(fā)芽率的顯著差異性確定了蝴蝶豆耐鹽種質(zhì)的適宜篩選濃度為150 mmol/L 的鹽溶液。

2.2 鹽脅迫下蝴蝶豆種子萌發(fā)的影響

在150 mmol/L 鹽脅迫下，75 份蝴蝶豆種質(zhì)發(fā)芽指標中相對根冠比變異系數(shù)最大，為67.75%（表4）。這表明所測蝴蝶豆耐鹽性相對根冠比變異比較豐富，存在較大差異，可以作為蝴蝶豆耐鹽性評價指標。各種質(zhì)的發(fā)芽率和發(fā)芽勢集中在50%左右，根長和芽長小于15 mm 的種質(zhì)分別占30%和50%（圖2），說明鹽脅迫對蝴蝶豆的發(fā)芽指標相對于根長、芽長來說影響較小，鹽脅迫嚴重抑制了蝴蝶豆根和芽的生長發(fā)育。

2.3 鹽脅迫下各指標的相關(guān)性分析

鹽脅迫下，對各指標進行相關(guān)性分析（表5）表明，蝴蝶豆與發(fā)芽率、發(fā)芽勢相關(guān)的任意2 個發(fā)芽指標之間均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），其中發(fā)芽率與發(fā)芽勢的相關(guān)系數(shù)最大，為0.992，發(fā)芽指數(shù)和相對發(fā)芽指數(shù)相關(guān)系數(shù)最小，為0.344。而芽長和根冠比以及相對值之間呈極顯著負相關(guān)（P<0.01），且相關(guān)系數(shù)表示芽長與根冠比之間關(guān)系密切，系數(shù)最大，為?0.609，說明芽長越長根冠比、相對根冠比就越小，反之則越大。鹽脅迫下蝴蝶豆萌芽期各指標間均存在著不同程度的相關(guān)性，因此可選擇主要指標來評價蝴蝶豆種質(zhì)的耐鹽性。

2.4 主成分分析

在對蝴蝶豆所有發(fā)芽指標進行標準化后，再進行主成分分析，并根據(jù)每個成分的特征值和貢獻率提取主成分（表6）。其中有4 個特征值大于1 的成分，因此將這4 個成分作為主成分，其特征值分別為5.20、2.99、2.06、1.39，方差貢獻率為37.12%、21.37%、14.72%和9.95%。這4 個主成分累積方差貢獻率達83.17%，超過了80%，說明因子的提取效果很好，涵蓋了所有指標的大部分信息，整體歸納性好、綜合反應(yīng)性強，可將其作為蝴蝶豆耐鹽種質(zhì)評價篩選的綜合指標。

由各主成分載荷矩陣（表7）可知，唯一對第一主成分產(chǎn)生負向影響的是根冠比且影響不大，其數(shù)值為?0.026，其余指標均對第一主成分產(chǎn)生正向影響。其中，影響最大的是發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽勢，數(shù)值分別為0.872、0.865、0.855、0.789，說明發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)及相對發(fā)芽勢對第一主成分起主要正向影響作用。

對第二主成分產(chǎn)生正向影響的指標有發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、鮮重、相對芽長、芽長、相對鮮重、根冠比，其余指標對第二主成分產(chǎn)生負向影響。其中，相對芽長、芽長起主要正向影響較大，數(shù)值分別為0.786、0.709；根長、相對根冠比、相對根長起主要負向影響，數(shù)值分別為?0.464、?0.835、?0.552；發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)對第二主成分影響不大。

第三主成分負向指標：相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽率、芽長，其載荷值分別為?0.528、?0.613、?0.639、?0.018，其余均為第三主成分正向指標。其中，根長、相對根冠比、相對根長、根冠比對第三主成分起主要正向影響，數(shù)值為0.479、0.342、0.521、0.339；而相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽率起主要負向影響；芽長對第三主成分影響可忽略不計。

第四主成分影響因素中鮮重、相對鮮重可忽略不計，負向影響因素有發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、芽長，其余均為正向指標。其中，相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對芽長、根冠比對第三主成分起主要正向影響，數(shù)值為0.300、0.333、0.444、0.662；而發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長起主要負向影響。

2.5 蝴蝶豆耐鹽性綜合評價

對75 份蝴蝶豆種質(zhì)耐鹽性進行綜合評價，將綜合得分值和平均隸屬函數(shù)值（ASF）作為評價耐鹽性強弱的標準，綜合得分值和ASF 值越大，表明其耐鹽性就越強，反之則越弱。首先將蝴蝶豆發(fā)芽指標原始數(shù)據(jù)標準化后，借助公式（5）計算綜合得分（Z=0.37Z1+0.21Z2+0.14Z3+0.09Z4）進行排序（表8）。綜合得分值為?0.745～2.003，跨度范圍大也表明各種質(zhì)間耐鹽性差異較大。排名前十的耐鹽種質(zhì)為：69＞2＞4＞12＞49＞1＞21＞6＞20＞18，排名后十的敏鹽種質(zhì)為：57＜55＜63＜45＜52＜54＜65＜30＜70＜73。這2 種評價方法都表達了蝴蝶豆的耐鹽差異性較大。

然后對平均隸屬函數(shù)值進行排序（表8），平均隸屬函數(shù)值（不超過1）范圍在0.14～0.61 之間，其值跨度范圍大表明各種質(zhì)間耐鹽性差異較大。綜合排名前十的種質(zhì)為：59>67>12>20>2>4>1>69>75>49，綜合排名后十的種質(zhì)為：45＜63＜65＜30＜48＜31＜15＜57＜51＜55。用這2 種綜合評價方法來評價蝴蝶豆的耐鹽性，表明不同評價方法對75 份蝴蝶豆種質(zhì)耐鹽強弱的排名稍有不同，但大體差異不大，耐鹽材料和敏鹽材料的篩選結(jié)果基本一致。

2.6 聚類分析

綜合得分值（Z）其包括信息全面，因此對蝴蝶豆耐鹽綜合得分值進行最遠距離系統(tǒng)聚類分析，在歐式距離為4 處可將75 份蝴蝶豆種質(zhì)分為四大類（圖3）。第1 類為極耐鹽種質(zhì)，編號69單獨分為一類；第2 類為耐鹽種質(zhì)，包括編號2、4、12、49、1、21、6、20、18、13、5、23、28、7、39、46、34 共17 份；第3 類為低耐鹽種質(zhì)，編號52、65、54、63、45、57、55 共7 份種質(zhì)；第4 類編號29、10、59 等50 份材料為敏鹽種質(zhì)。

3 討論

我國土壤鹽漬化形勢日益嚴峻，目前，最為經(jīng)濟、有效利用鹽漬土的途徑是種植耐鹽植物對土壤進行生物改良[25]。蝴蝶豆在國內(nèi)外作為優(yōu)質(zhì)飼料[26]和綠肥覆蓋物[10-11]，其種質(zhì)資源數(shù)量龐大、質(zhì)量優(yōu)異，遺傳變異種類豐富多樣，為開展蝴蝶豆種質(zhì)資源的研究和創(chuàng)新提供重要材料基礎(chǔ)。因此，系統(tǒng)性評價和利用耐鹽性強的蝴蝶豆種質(zhì)資源，對蝴蝶豆品種的選育具有重要的現(xiàn)實意義。本研究首先對7 份蝴蝶豆種質(zhì)萌芽期在6個不同鹽濃度下的研究發(fā)現(xiàn)，150 mmol/L 鹽溶液脅迫下，蝴蝶豆表現(xiàn)出較大的耐鹽性差異，因此確定該濃度為最適宜篩選濃度，與張紅梅等[18]在豇豆耐鹽性研究方面的結(jié)果一致。然后在150 mmol/L 濃度下，綜合評價75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)材料的耐鹽性，研究表明，鹽處理材料與對照相比，各種質(zhì)的開始發(fā)芽時間普遍延遲了約1 d，該現(xiàn)象與田蕾等[27]對粳稻進行鹽脅迫過程的表現(xiàn)一致，說明鹽脅迫對植物芽期影響嚴重。

變異系數(shù)變化值較大的性狀指標更能反映出材料間的耐鹽性差異[28]。研究中，蝴蝶豆種質(zhì)發(fā)芽指標中相對根冠比變異系數(shù)最大（67.75%），表明所測蝴蝶豆耐鹽性相對根冠比變異比較豐富，存在較大差異，因此可作為蝴蝶豆耐鹽性評價指標。通過相關(guān)性分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽指數(shù)、相對根冠比、相對發(fā)芽率和根冠比這4 個指標與主成分關(guān)系最為密切，完全囊括了變異分析的信息，且包括蝴蝶豆耐鹽特性的大部分信息，因此將這4 個指標作為耐鹽評價指標。田蕾等[27]發(fā)現(xiàn)水稻芽期評價指標為發(fā)芽指數(shù)、相對根長和相對鹽害率；孫璐等[29]確定根長、鮮重和發(fā)芽率作為鑒定高粱耐鹽性指標。由此可以看出，發(fā)芽指數(shù)、根長、發(fā)芽率差異變化較大，可作為耐鹽評價指標。研究發(fā)現(xiàn)，蝴蝶豆種質(zhì)的根長和芽長均在25 mm 以下，且15 mm 左右的占比最大，發(fā)芽率和發(fā)芽勢普遍在50%左右，由此可知，相對于種質(zhì)發(fā)芽，胚根和胚芽的生長對NaCl 脅迫更為敏感，這與羅小燕等[30]對山螞蝗的研究、楊林[31]對豆科牧草的研究結(jié)果一致，根長、芽長受鹽脅迫影響最大。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，蝴蝶豆在鹽脅迫下，萌芽期各類指標間有不同程度的關(guān)聯(lián)性，這與前人研究結(jié)果一致[32]，發(fā)芽率與發(fā)芽勢相關(guān)任意2個指標間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P<0.01），胚芽長和相對根冠比、根冠比相互之間呈極顯著負相關(guān)（P<0.01）。本研究使用的各類指標對蝴蝶豆耐鹽性綜合評價貢獻率不同，因此，要精確得出蝴蝶豆的耐鹽性，應(yīng)有更多的指標進行研究，再進行綜合分析，這樣才能全面反映蝴蝶豆種質(zhì)耐鹽性強弱。

本研究對綜合得分進行聚類分析，將75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)分為四大類，編號69 為第1 類極耐鹽種質(zhì)；第2 類為耐鹽種質(zhì)（編號2、4、12、49、1、21、6、20、18、13、5、23、28、7、39、46、34 共17 份）；第3 類為低耐鹽種質(zhì)（編號52、65、54、63、45、57、55 共7 份種質(zhì)）；第4 類為敏鹽種質(zhì)（編號29、10、59 等50 份）。編號69 的蝴蝶豆種質(zhì)通過平均隸屬函數(shù)分析，得出其數(shù)值0.542，排名第8，綜合分析得分2.003，排名第1，2 種評價體系下綜合表現(xiàn)優(yōu)異，最耐鹽。但由于不同生長階段，植物的耐鹽性有一定的差異，所以萌芽期篩選出的耐鹽種質(zhì)能在苗期有何種表現(xiàn)需進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究通過不同鹽濃度梯度篩選出最適濃度為150 mmol/L，在該濃度處理下測定75 份蝴蝶豆種質(zhì)萌芽期相關(guān)耐鹽指標，通過相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析對75 份蝴蝶豆種質(zhì)耐鹽性進行綜合評價，確定蝴蝶豆耐鹽評價指標是發(fā)芽指數(shù)、相對根冠比、相對發(fā)芽率和根冠比，結(jié)果表明，050321057 蝴蝶豆（編號69）在參試種質(zhì)材料中表現(xiàn)出極其耐鹽性。為蝴蝶豆耐鹽性研究和選育耐鹽品種提供理論支撐。