油莎豆生長素受體TIR1基因家族鑒定及響應(yīng)鹽脅迫和外源IBA的表達(dá)分析

李昕儒　高宇　苗淑楠　李騰　董書言　史先飛　薛金愛　季春麗　李潤植

關(guān)鍵詞：油莎豆；運(yùn)輸抑制劑響應(yīng)蛋白1（TIR1）；吲哚丁酸（IBA）；鹽脅迫；基因表達(dá)

中圖分類號：S565.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

油莎豆（Cyperus esculentus L.）又稱油莎草、老虎豆等，是莎草科莎草屬多年生草本植物[1]，其塊莖富含油脂、蛋白質(zhì)、淀粉、糖等營養(yǎng)成分[2]。油莎豆是目前發(fā)現(xiàn)的唯一已知地下部分營養(yǎng)器官積累大量油脂的作物[3]，油脂中油酸含量高達(dá)68%～75%，品質(zhì)和營養(yǎng)成分可媲美橄欖油、榛子油等優(yōu)質(zhì)食用油，且優(yōu)于菜籽油及芝麻油等[4]。油莎豆塊莖還可制作其他食品或藥品，地上部分亦可用作優(yōu)質(zhì)牧草飼料，是一種集油、糧、草、飼、藥于一體的多用途經(jīng)濟(jì)作物[4-5]。油莎豆種植范圍廣，具有適應(yīng)性強(qiáng)、高抗逆性等特點(diǎn)[6-7]，也是植物抗逆性研究的理想作物材料。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，作物生長常受到非生物脅迫的危害。干旱、洪澇、高溫、低溫、鹽堿和重金屬等非生物脅迫直接影響植物新陳代謝、生長和發(fā)育，不僅會降低作物產(chǎn)量，甚至在極端情況下會導(dǎo)致植物死亡[8]。鹽脅迫是最普遍的非生物脅迫之一，嚴(yán)重影響全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[9]。鹽脅迫破壞植物滲透平衡系統(tǒng)，導(dǎo)致植物膜脂過氧化，抑制營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響植物正常生長發(fā)育[10]。植物進(jìn)化出各種機(jī)制抵御鹽脅迫的侵害，包括調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)、激活滲透脅迫途徑、介導(dǎo)植物激素信號傳導(dǎo)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動力學(xué)和細(xì)胞壁組成等[11]。其中，植物激素在細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，不僅調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育，還可以調(diào)節(jié)植物非生物脅迫響應(yīng)，在植物抵御非生物脅迫的應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用[12]。生長素作為一類生長促進(jìn)激素，參與植物對鹽脅迫信號的感知和防御，可以通過調(diào)節(jié)氣孔閉合來調(diào)節(jié)水分平衡和滲透性穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而提高植物對鹽脅迫的耐性[10]。

運(yùn)輸抑制劑響應(yīng)蛋白1（transport inhibitorresponse protein 1，TIR1）是植物響應(yīng)生長素信號的一類重要蛋白[13]。TIR1 蛋白N 端有引起蛋白水解的SCF 蛋白復(fù)合物成分之一F-box 結(jié)構(gòu)域，C 端有富集多個亮氨酸序列（LRR）的AMN1 超結(jié)構(gòu)域[14]。生長素與受體TIR1 蛋白結(jié)合后，TIR1編碼F-box 蛋白可以與S 期激酶相關(guān)蛋白1（SKPI）類似物ASK1 和ASK2 及Cullin 形成SCF（SKPI/cullin/F-box）型26S 泛素蛋白酶復(fù)合體，該復(fù)合體與生長素以及Aux/IAA 轉(zhuǎn)錄因子相互作用[15]，促使Aux/IAA 蛋白經(jīng)泛素化修飾后進(jìn)入26S 蛋白酶體途徑降解，進(jìn)而激活與生長素反應(yīng)相關(guān)的基因[16]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達(dá)MiR393–TIR1（mTIR1）基因，生長素信號傳導(dǎo)增加可能觸發(fā)生長素介導(dǎo)的下游途徑，通過滲透調(diào)節(jié)和增加Na+排出來增強(qiáng)植物鹽脅迫抗性，從而顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗鹽能力[17]。大白菜（Brassica rapa）BrTIR1 啟動子上存在響應(yīng)鹽脅迫的順式作用元件，BrTIR1 在大白菜響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮重要作用[18]。鹽脅迫信號對植物生長素受體基因TIR1 的表達(dá)也起著調(diào)控作用，如NaCl 脅迫處理能夠調(diào)控灰綠藜（Chenopodium glaucum L.）CgTIR1 基因的表達(dá)[19]等。油莎豆作為一種抗逆性強(qiáng)、綜合利用價值高的糧油兼用新型經(jīng)濟(jì)作物，關(guān)于CeTIR1 基因的生物學(xué)特性、響應(yīng)鹽脅迫和生長素信號的調(diào)控等鮮有報道。

本研究基于實驗室的油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定獲得油莎豆CeTIR1 基因家族的編碼序列并對其進(jìn)行克隆；通過生物信息學(xué)分析其編碼蛋白的序列特征、理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)和生物進(jìn)化關(guān)系；測定鹽脅迫及添加生長素處理后油莎豆幼苗POD、SOD 酶活性和MDA 含量；通過qRT-PCR分析油莎豆CeTIR1 基因組織表達(dá)特性及其在鹽脅迫和添加生長素處理后的表達(dá)譜。本文旨在為后續(xù)深入研究CeTIR1 功能和CeTIR1 參與外源生長素介導(dǎo)植物鹽脅迫抗逆性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

油莎豆種質(zhì)材料為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所保存的晉農(nóng)1 號，2021 年4 月22日種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)作站。取晉農(nóng)1號萌發(fā)時期（80 d）的油莎豆根、葉及塊莖樣品，液氮速凍后保存于?80 ℃?zhèn)溆?。另選取大小均勻、飽滿、無蟲眼的油莎豆塊莖，發(fā)芽預(yù)處理后，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)條件為溫度（252）℃、光暗比16/8。選取生長25 d，長勢良好且基本均勻一致的油莎豆幼苗分別用Hoagland營養(yǎng)液添加250 mmol/L NaCl ， 250 mmol/LNaCl+1 mg/L IBA 處理，并以不添加NaCl 和IBA的幼苗為對照（CK），取處理0、3、12、24、48、72 h 時的油莎豆幼苗，經(jīng)液氮冷凍后，存于?80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 油莎豆CeTIR1 基因克隆 基于本實驗室油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選鑒定出4 個油莎豆TIR1基因（ CeTIR1-1 、CeTIR1-2 、CeTIR1-3 和CeTIR1-4）。根據(jù)4 個基因的CDS 序列，設(shè)計PCR 引物（表1）用于基因編碼序列的克隆。以油莎豆萌發(fā)時期塊莖的cDNA 作為模板， 用TOBOYO 的KOD-Plus-Neo 高保真酶擴(kuò)增目的基因CDS 序列。取PCR 產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。用EasyPure? Quick Gel ExtractionKit（TRANs）試劑盒對正確的目的片段進(jìn)行回收純化。使用核酸儀測量產(chǎn)物濃度，將PCR 產(chǎn)物連接到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板后挑取單克隆菌落，菌檢為陽性后送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫在線工具CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對從本實驗室油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定獲得的CeTIR1 基因編碼的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。使用MEME（https：//memesuite.org/meme/tools/meme）在線軟件預(yù)測CeTIR1基因家族編碼蛋白的Motif；利用Expasy 網(wǎng)站提供的Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具分析CeTIR1 基因家族編碼蛋白的氨基酸組成、理論等電點(diǎn)、相對分子質(zhì)量和原子組成等理化性質(zhì)；使用在線分析網(wǎng)站TMHMM Server 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）對CeTIR1 蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測分析；運(yùn)用Expasy 網(wǎng)站提供的Protscale 工具（https：//web.expasy.org/protscale/）對蛋白疏水區(qū)域進(jìn)行預(yù)測分析；使用在線分析網(wǎng)站PSORT II（https：//psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測CeTIR1 基因家族編碼蛋白的亞細(xì)胞定位；使用SOPMA 網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析；通過在線軟件Phyre2（http：//www. sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)建模分析。使用Genedoc 軟件對CeTIR1 基因家族編碼蛋白和其他物種TIR1 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對； 利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）通過MEGA 7.0 軟件構(gòu)建所測物種TIR1 蛋白（表2）的系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)設(shè)置bootstrap 1000，其余參數(shù)默認(rèn)。

1.2.3 抗氧化相關(guān)酶活性測定 超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定，過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[20]。

1.2.4 油莎豆CeTIR1 基因表達(dá)實時熒光定量PCR 分析 利用Primer 6.0 設(shè)計檢測CeTIR1 基因表達(dá)的qRT-PCR 引物，以Ce18S RNA 為內(nèi)參基因（表1）。采用北京全式金公司的TransZol Plant試劑盒提取總RNA 。使用Genstar 公司的StarScript Ⅱ cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用TaKaRa 公司的TB Green? Premix ExTaqTM Ⅱ試劑盒，進(jìn)行實時熒光定量PCR 分析。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 1 min，39 個循環(huán)，設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。采用2?ΔΔCT 法[21]計算基因相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆CeTIR1 基因的ORF克隆

用晉農(nóng)1 號塊莖cDNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離鑒定結(jié)果如圖1 所示，PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到的目的基因條帶與預(yù)期相符。經(jīng)測序驗證，油莎豆CeTIR1 基因家族成員CeTIR1-1、CeTIR1-2、CeTIR1-3 和CeTIR1-4 基因的ORFs 分別為1770、1875、1836、1800 bp。經(jīng)測序鑒定，擴(kuò)增到各CeTIR1 基因的ORF 序列與前期測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

2.2 油莎豆CeTIR1 蛋白的理化性質(zhì)分析

對CeTIR1 基因家族編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖2），CeTIR1 家族蛋白與擬南芥AtTIR1 都含有典型的3 個結(jié)構(gòu)域：富集多個亮氨酸序列（LRR）的AMN1 超結(jié)構(gòu)域、F-box_5結(jié)構(gòu)域（為SCF 型泛素E3 連接酶復(fù)合體中的一個組分引起蛋白水解）和Transp_inhibit 結(jié)構(gòu)域（是LRR 區(qū)域的特定單位）。Motif 預(yù)測結(jié)果顯示（圖3），CeTIR1 家族蛋白有6 個Motif，與AtTIR1 結(jié)構(gòu)相似。CeTIR1 家族蛋白與擬南芥AtTIR1 類似，有典型的TIR1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守Motif，預(yù)示著油莎豆CeTIR1 可能與擬南芥AtTIR1 有相似的生物學(xué)功能。

4 個CeTIR1 蛋白之間理化性質(zhì)差異不明顯（表3）。蛋白序列最長為CeTIR1-2（624 aa），最短為CeTIR1-1（589 aa）。CeTIR1 理論等電點(diǎn)在5.13～6.72 之間，不穩(wěn)定系數(shù)在42.64～46.33 之間，均為酸性不穩(wěn)定蛋白。除CeTIR1-3 蛋白為疏水性蛋白，其余CeTIR1 蛋白均為親水性蛋白。CeTIR1 蛋白均無跨膜區(qū)域。亞細(xì)胞定位分析顯示CeTIR1 蛋白均位于細(xì)胞核內(nèi)。CeTIR1 蛋白理化性質(zhì)相似，預(yù)示著它們可能發(fā)揮類似的功能。

2.3 油莎豆CeTIR1 蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

CeTIR1 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示（表4），4 個CeTIR1 蛋白主要是由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲占比較高。CeTIR1 蛋白預(yù)測三級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示（圖4），以膜蛋白c2p1nE 為模版，CeTIR1 家族蛋白和AtTIR1 蛋白都為螺旋環(huán)狀結(jié)構(gòu)。AtTIR1蛋白與模版的相似性為96%。CeTIR1 家族蛋白中，CeTIR1-1、CeTIR1-2、CeTIR1-3 和CeTIR1-4蛋白與模版的相似性分別為96%、91%、93%和95%。通過以上分析預(yù)測4 個CeTIR1 家族蛋白可能發(fā)揮與AtTIR1 蛋白相似的生物學(xué)功能。

2.4 油莎豆CeTIR1 蛋白多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹

多序列比對結(jié)果顯示（圖5），4 個CeTIR1蛋白和擬南芥AtTIR1 蛋白具有較高的相似度，都含有典型的F-box 蛋白結(jié)構(gòu)域、AMN1 超結(jié)構(gòu)域和Transp_inhibit 結(jié)構(gòu)域。通過MEGA 7.0 軟件構(gòu)建油莎豆CeTIR1 蛋白與其他物種TIR1 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示（圖6），4 個油莎豆CeTIR1的進(jìn)化關(guān)系有明顯的差異。從多序列比對和進(jìn)化關(guān)系上來看，油莎豆CeTIR1-1 和CeTIR1-2 在同一分支與禾本目莎草科的康藏嵩草ClTIR1 關(guān)系較近，序列一致性值分別為78.68%和69.12%；CeTIR1-3 與木犀科油橄欖OeTIR1 關(guān)系較近，序列一致性值為39.02%；油莎豆CeTIR1-4 與十字花科油菜BnTIR1 關(guān)系較近，序列一致性值為51.31%。進(jìn)化關(guān)系上的差異，預(yù)示著它們可能差異化行使功能。

2.5 油莎豆CeTIR1 基因家族組織表達(dá)特性分析

為進(jìn)一步探究油莎豆CeTIR1 基因家族在不同組織器官中的表達(dá)特性，以晉農(nóng)1 號的根、葉、塊莖的cDNA 為材料，以Ce18S rRNA 作為內(nèi)參基因，qRT-PCR 檢測各CeTIR1 基因的表達(dá)量。結(jié)果如圖7 所示，油莎豆CeTIR1 基因家族的表達(dá)特性呈多樣性。油莎豆CeTIR1 基因家族在各組織中均有表達(dá)，其中，在根中CeTIR1-2 表達(dá)量最高，在葉中CeTIR1-4 表達(dá)量最高，在塊莖中CeTIR1-2 表達(dá)量最高。相比較而言， 油莎豆CeTIR1 基因家族均在塊莖組織中高表達(dá)，在根和葉組織中表達(dá)量較低。

2.6 外源IBA 可緩解鹽脅迫對油莎豆幼苗生長的損害

鹽脅迫處理下，油莎豆中SOD 和POD 活性隨處理時間的延長呈先增加后下降的趨勢，在48 h 時均達(dá)到最大值后開始下降。對鹽脅迫下的油莎豆幼苗外源添加IBA 處理12、24 h 時，油莎豆幼苗SOD 活性升高趨勢明顯，處理48 h 時幼苗SOD 活性下降。添加IBA 處理的SOD 活性仍高于僅鹽脅迫處理的SOD 活性（圖8）。外源IBA處理下，POD 活性相比僅鹽脅迫處理的POD 活性升高。在IBA 處理48 h 時，幼苗POD 活性達(dá)到峰值（圖8）。鹽脅迫處理對油莎豆幼苗產(chǎn)生一定的損傷，對鹽脅迫下的油莎豆幼苗外源添加IBA 處理顯著提升油莎豆幼苗抵御鹽脅迫的抗性。因此，IBA 處理可以緩解鹽脅迫對于油莎豆幼苗的傷害。

鹽脅迫處理下，MDA 的含量緩慢升高且在處理72 h 時達(dá)到最高，油莎豆幼苗細(xì)胞膜過氧化程度愈加嚴(yán)重。對鹽脅迫下的油莎豆幼苗外源添加IBA 處理后，幼苗MDA 含量降低（圖8）。幼苗細(xì)胞膜過氧化程度隨鹽脅迫處理時間增加而加劇，外源IBA 減輕了鹽脅迫下油莎豆幼苗細(xì)胞膜的損傷。

2.7 油莎豆CeTIR1 基因在鹽脅迫及外源IBA處理后的表達(dá)譜分析

油莎豆CeTIR1 基因在鹽脅迫下的表達(dá)分析如圖9 所示，隨著鹽脅迫處理時間延長，CeTIR1-1和CeTIR1-3 表達(dá)量逐漸升高，在24 h 時達(dá)到最高后下降。CeTIR1-4 表達(dá)量隨處理時間延長逐漸升高。CeTIR1-2 表達(dá)量在3 h 時升高，在12 h 時降低，而后又在72 h 時顯著升高。鹽脅迫下油莎豆幼苗外源添加IBA 處理，CeTIR1-1，CeTIR1-3和CeTIR1-4 表達(dá)量在24、48、72 h 時相比鹽脅迫處理條件下這3 個基因表達(dá)量顯著降低。然而，CeTIR1-2 表達(dá)量在3、12、48、72 h 時相比鹽脅迫處理顯著升高，且在不同時間相對表達(dá)量均高于鹽脅迫處理。以上結(jié)果表明CeTIR1-1 、CeTIR1-2、CeTIR1-3 和CeTIR1-4 可能都參與鹽脅迫抗逆反應(yīng)。尤其是CeTIR1-2 基因在外源IBA處理時高表達(dá)?？梢?，外源IBA 處理顯著上調(diào)了CeTIR1-2 基因表達(dá)，CeTIR1-2 可能進(jìn)一步激活相關(guān)信號通路及其相關(guān)生理生化反應(yīng)，從而緩解了鹽脅迫對油莎豆幼苗的損傷。由此推測CeTIR1-2基因可能是參與調(diào)控油莎豆幼苗鹽脅迫抗性的重要基因。

3 討論

土壤鹽漬化會嚴(yán)重阻礙植物生長發(fā)育，降低作物產(chǎn)量，給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全帶來嚴(yán)重威脅[22-23]。在植物抵御非生物脅迫過程中，生長素起到了提高植物對非生物脅迫適應(yīng)性的關(guān)鍵作用[24]。生長素信號通路離不開上游的調(diào)控因子生長素受體的參與，生長素受體是控制生長素信號通路的開關(guān)[25]。TIR1 是一種被廣泛研究的生長素受體，可介導(dǎo)Aux/IAA 蛋白的快速降解，進(jìn)而導(dǎo)致生長素調(diào)控基因表達(dá)的變化[26]。因此，研究油莎豆生長素受體CeTIR1 基因是否參與生長素響應(yīng)和鹽脅迫應(yīng)答及其作用機(jī)制，對于油莎豆抗逆性改良和提高油莎豆在鹽堿地等逆境種植管理有重要科學(xué)參考價值。

本研究通過生物信息學(xué)分析在油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出油莎豆4 條TIR1 序列。通過功能結(jié)構(gòu)域分析，4 條CeTIR1 基因和擬南芥AtTIR1基因高度相似，編碼蛋白都含有F-box 結(jié)構(gòu)域。預(yù)測其有TIR1 蛋白功能，可響應(yīng)生長素信號且在非生物脅迫應(yīng)答中起作用。通過蛋白高級結(jié)構(gòu)分析和多序列比對顯示，油莎豆CeTIR1 蛋白與擬南芥AtTIR1 結(jié)構(gòu)類似。預(yù)示其亦可與生長素、Aux/IAA 轉(zhuǎn)錄因子相互作用，這與百子蓮ApTIR1蛋白的功能類似[27]。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，油莎豆CeTIR1 蛋白與來自禾本目莎草科的康藏嵩草、木犀科的油橄欖和十字花科的油菜的TIR1 蛋白等同源性較高。

在不同物種中TIR1 發(fā)揮的功能亦有不同，可能與物種本身特性有關(guān)。有報道表明，TIR1 可能調(diào)控龍眼體胚發(fā)生[28]，與茶樹越冬芽休眠密切相關(guān)[29]，可能與紅麻花藥敗育有關(guān)[30]。亦有研究表明TIR1 基因可以增強(qiáng)植物對鹽脅迫的抗逆性。例如，鹽穗木HcTIR1 響應(yīng)高鹽脅迫且其表達(dá)量與鹽脅迫濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性[19]。擬南芥過表達(dá)MiR393–TIR1（mTIR1）基因的植株抗鹽能力顯著增強(qiáng)[17] 。本研究發(fā)現(xiàn)， 油莎豆CeTIR1-1 、CeTIR1-2、CeTIR1-3 和CeTIR1-4 均響應(yīng)鹽脅迫信號，在NaCl 處理時表達(dá)量顯著增加。鹽脅迫處理下油莎豆幼苗抗氧化酶活性升高，在48 h 時達(dá)到峰值后下降，MDA 的含量也有所升高，說明鹽脅迫對油莎豆幼苗生長造成了一定程度的損害。外源IBA 處理鹽脅迫下油莎豆幼苗的SOD、POD酶活性提高，MDA 含量降低，說明外源添加IBA使鹽脅迫下油莎豆幼苗的鹽毒害有所緩解。特別是，油莎豆CeTIR1-2 在外源添加IBA 處理后表達(dá)量顯著增加， 預(yù)示著外源IBA 顯著上調(diào)CeTIR1-2 基因表達(dá)。有研究表明，外源添加一定濃度的IBA 處理沙冬青幼苗能夠促進(jìn)鹽脅迫下幼苗的生長，提高幼苗的耐鹽性[31]。外源生長素能夠緩解鹽脅迫對小麥幼苗傷害，強(qiáng)化小麥幼苗的抗鹽能力[32]等。但關(guān)于TIR1 響應(yīng)鹽脅迫和生長素信號的詳盡分子機(jī)制的研究還未見報道。外源添加IBA 對鹽脅迫下的油莎豆幼苗起到一定程度的緩解作用，可提高鹽脅迫下油莎豆幼苗的抗氧化性，還可能調(diào)控油莎豆生長素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這對于提高植物耐鹽性和改善鹽堿地有重要意義。綜合分析顯示，CeTIR1-2 是通過生長素調(diào)控來響應(yīng)鹽脅迫的一個重要靶標(biāo)基因。后期將對CeTIR1-2 基因生物學(xué)功能等進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，以闡明CeTIR1-2 介導(dǎo)的抗逆性調(diào)控作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究基于油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定到4 條油莎豆CeTIR1 基因并對其進(jìn)行克隆，4 個CeTIR1s都含有典型的F-box 蛋白結(jié)構(gòu)域、AMN1 超結(jié)構(gòu)域和Transp_inhibit 結(jié)構(gòu)域，均為定位于細(xì)胞核的無跨膜區(qū)域的不穩(wěn)定蛋白。油莎豆CeTIR 基因均在塊莖組織中高表達(dá)，在根和葉組織中表達(dá)量較低。油莎豆幼苗在鹽脅迫下抗氧化酶活性和MDA含量升高，添加外源IBA 可緩解鹽脅迫對油莎豆幼苗生長的不利影響。鹽脅迫可誘導(dǎo)CeTIR1 基因的表達(dá)，尤其是外源IBA 可顯著上調(diào)CeTIR1-2基因表達(dá)，進(jìn)而激活相關(guān)信號通路和脅迫應(yīng)答體系，提高油莎豆幼苗抗逆性。CeTIR1-2 可能是介導(dǎo)生長素信號通路和油莎豆脅迫應(yīng)答反應(yīng)的一個重要調(diào)節(jié)因子。