基于多基因SNP的LASSO回歸模型預(yù)測(cè)高危人群缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值

田 齊,賈海莉,龐永鵬,趙 剛,陳璽龍

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是目前國(guó)內(nèi)導(dǎo)致中老年人群死亡的重要因素之一,針對(duì)高危人群進(jìn)行早期預(yù)防性干預(yù)能有效降低IS的發(fā)生率,避免嚴(yán)重后果的發(fā)生[1-2]。而目前針對(duì)IS高危人群的相關(guān)預(yù)測(cè)研究較多,但由于既往構(gòu)建的模型指標(biāo)質(zhì)量差異,導(dǎo)致預(yù)測(cè)質(zhì)量參差不齊[3]。伴隨著基因研究的深入,對(duì)于IS疾病基因?qū)用娴难芯渴蛊渑R床檢測(cè)指標(biāo)的特異性明顯提升。Li等[4]的研究顯示,CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)等基因位點(diǎn)中的不同表達(dá)與IS病人各類(lèi)指標(biāo)顯著相關(guān),故本研究在其基礎(chǔ)上針對(duì)性建立IS預(yù)測(cè)模型,旨在為臨床診斷及治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年7月—2019年12月于我院就診并明確存在頸動(dòng)脈粥樣硬化且改良的弗明漢卒中量表評(píng)分≥15分的病人350例作為研究對(duì)象。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)影像學(xué)檢查明確存在頸動(dòng)脈粥樣硬化;②年齡>18歲,具有獨(dú)立意識(shí),能完成隨訪;③改良的弗明漢卒中量表評(píng)分≥15分;④病人及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①既往IS病史;②合并其他嚴(yán)重的慢性疾病,預(yù)計(jì)生存期無(wú)法完成隨訪;③合并其他腦血管疾病;④長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、細(xì)胞毒類(lèi)藥物且無(wú)法暫停治療;⑤半年內(nèi)嚴(yán)重感染疾病病史。符合上述要求并上報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)后納入研究。

1.3 方法

1.3.1 儀器及試劑 DNA提取試劑(DNAzolTMBD,賽默飛世爾公司生產(chǎn));逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)Kit mRNA定量檢測(cè)試劑盒(SYBR PrimeScriptTM,日本TaKaRa公司提供);定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀及ABI377全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems ABI7500型,美國(guó)Biolytic公司提供);探針和引物的設(shè)計(jì)由北京三搏遠(yuǎn)志生物完成。

1.3.2 各基因位點(diǎn)表達(dá)測(cè)定 所有病人于納入研究后次日清晨抽取空腹靜脈血,并提取樣本內(nèi)DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后取4 μL產(chǎn)物與緩沖液、濃度為2 μmol/L的混合探針各1 μL及Taq酶2 U混合成總量為10 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)(反應(yīng)體系總量不足用雙蒸水補(bǔ)足),而后使用測(cè)序儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)基因型及等位基因的分型檢測(cè),使用SDS2軟件進(jìn)行分析。擴(kuò)增程序:預(yù)變性(95 ℃,2 min)、變性(94 ℃,30 s)、退火(65 ℃,30 s)、延伸(65 ℃,30 s),進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后再次延伸(65 ℃,10 min)。連接反應(yīng)程序:預(yù)變性(95 ℃,2 min)、變性(94 ℃,15 s)、延伸(50 ℃,25 s),共40個(gè)循環(huán)。PCR引物及連接反應(yīng)探針和Taq酶序列見(jiàn)詳表1、表2。

表1 各基因PCR引物序列

表2 連接反應(yīng)探針和Taq酶序列

1.3.3 隨訪方法及IS診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有病人納入研究后,每周由研究組醫(yī)生進(jìn)行電話(huà)隨訪,病人每個(gè)月定時(shí)到我院門(mén)診進(jìn)行相關(guān)檢查,隨訪時(shí)間為2年。參照《中國(guó)急性缺血性腦卒中早期血管內(nèi)介入診療指南2018》[5]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)IS進(jìn)行診斷,在隨訪期間統(tǒng)計(jì)IS發(fā)生例數(shù)及時(shí)間。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般資料 包括:年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、家族史、藥物使用史[包括鈣離子拮抗劑(CCB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、他汀類(lèi)藥物、降糖類(lèi)藥物、胰島素]、血壓。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)資料 包括:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、血肌酐(Cr)、同型半胱氨酸(Hcy)、血糖(Glu)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、頸部斑塊不穩(wěn)定、合并冠心病。

1.4.3 多基因SNP情況 包括CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)SNP表達(dá)及分布頻率情況。

2 結(jié) 果

2.1 病人隨訪結(jié)果、分組及一般資料比較 隨訪結(jié)束,共332例病人完成隨訪,完成隨訪率為94.86%。其中發(fā)生IS 103例,發(fā)生率為31.02%。將332例病人分為IS組(103例)和非IS組(229例),IS組吸煙史、飲酒史、收縮壓高于非IS組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 兩組病人一般資料比較

2.2 兩組病人實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查資料比較 IS組病人Hcy、Glu、TC、頸部斑塊不穩(wěn)定占比及合并冠心病占比明顯高于非IS組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡驗(yàn)證,各組基因頻率均符合遺傳平衡法則(P>0.05);IS組病人CD137基因(rs161827)CC型占比及等位基因C分布頻率、RNLS基因(rs10887800)AA型占比及等位基因A分布頻率、ALOX5AP基因(rs4073259)TT型占比及等位基因T分布頻率高于非IS組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4、表5。

表4 兩組病人實(shí)驗(yàn)室檢查資料及影像學(xué)檢查資料比較

表5 兩組病人IS關(guān)鍵基因SNP情況比較

2.3 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子的選擇及預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建 以是否發(fā)生IS為因變量,共納入11個(gè)自變量。由于不同自變量之間可能存在相關(guān)性,故對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維,并篩選出最具代表性的IS發(fā)生預(yù)測(cè)因子,對(duì)所有自變量進(jìn)行LASSO回歸分析,由圖1可知,隨著懲罰系數(shù)λ的變化,模型初始納入的自變量的系數(shù)被逐步壓縮,最后為0。為尋找最佳懲罰系數(shù) λ、使模型性能優(yōu)良且影響因素最少,選擇十折交叉驗(yàn)證法中誤差最小λ+1(0.094)作為最優(yōu)值。最終篩選出Hcy、Glu、TC、收縮壓、飲酒史、頸部斑塊不穩(wěn)定、CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)9個(gè)預(yù)測(cè)IS的自變量(見(jiàn)圖2)。

圖1 納入LASSO回歸的11個(gè)臨床特征的系數(shù)曲線

圖2 經(jīng)LASSO回歸、十折交叉驗(yàn)證法選擇最合適的臨床特征

2.4 影響IS相關(guān)因素的Cox回歸分析 根據(jù)單因素分析結(jié)果,以是否發(fā)生IS及IS發(fā)生時(shí)間為因變量,以LASSO回歸分析9個(gè)臨床特征結(jié)果作為自變量進(jìn)行Cox回歸分析,結(jié)果顯示,Hcy、Glu、TC、飲酒史、頸部斑塊不穩(wěn)定、CD137(rs161827)、RNLS(rs10887800)、ALOX5AP(rs4073259)是IS的影響因素(P<0.05)。詳見(jiàn)表6。

表6 IS影響因素的Cox回歸分析

2.5 綜合模型預(yù)測(cè)IS發(fā)生的ROC曲線 根據(jù)Cox回歸分析結(jié)果,建立預(yù)測(cè)模型并構(gòu)建分析ROC曲線,結(jié)果顯示,模型對(duì)于IS發(fā)生預(yù)測(cè)的敏感度74.75%,特異度為87.55%,具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值[AUC=0.901,95%CI(0.864,0.936),P<0.05]。詳見(jiàn)圖3。

圖3 綜合模型對(duì)IS發(fā)生預(yù)測(cè)的ROC曲線

3 討 論

IS的主要病理改變?yōu)樗ㄗ踊蜓ㄗ枞X動(dòng)脈而導(dǎo)致的血流量和供氧減少,識(shí)別與IS發(fā)生相關(guān)的基因和分子對(duì)于了解和控制該疾病具有重要意義[6-7]。由于具有大量遺傳成分,IS 的遺傳力范圍為16%～40%,相關(guān)研究已揭示了屬于不同基因的幾種變異對(duì) IS 及其特定亞型的貢獻(xiàn)作用[8]。同時(shí),IS屬于多因素疾病,其病理機(jī)制涉及多種成分,包括眾多環(huán)境和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素,故通過(guò)聯(lián)合基因檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于提升IS的預(yù)測(cè)效能具有較為實(shí)用的臨床價(jià)值[9-10]。

在本研究中,所有病人隨訪2年內(nèi)的IS發(fā)生率為31.02%,高于國(guó)內(nèi)外指南中IS的發(fā)病率[11],主要原因可能是由于本研究選取的病例全部為存在頸動(dòng)脈粥樣硬化的高危病人,此類(lèi)病人因?yàn)榘邏K可能發(fā)生脫落,所以IS發(fā)生率遠(yuǎn)高于正常人。一般資料顯示,具有吸煙史及飲酒史的病人IS發(fā)生率較高,首先,煙草及酒精與心血管疾病的發(fā)生顯著相關(guān),尤其是對(duì)于具有IS高風(fēng)險(xiǎn)因素的病人,煙草及酒精戒斷是公認(rèn)的有效預(yù)防措施,故此二項(xiàng)對(duì)于IS發(fā)生具有一定的影響[2,12]。兩組收縮壓存在明顯差異,通過(guò)血液流動(dòng)特點(diǎn)可以得出,收縮壓較高對(duì)于血管內(nèi)斑塊的沖擊力相對(duì)較強(qiáng),而收縮壓較高時(shí),斑塊不穩(wěn)定甚至脫落的風(fēng)險(xiǎn)高于低收縮壓及舒張壓時(shí),故IS病人收縮壓相對(duì)較高[13]。

Hcy是介導(dǎo)體內(nèi)甲硫氨酸和半胱氨酸分解及代謝的重要影響因素,而高水平Hcy可引起凝血功能異常升高及心腦血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖、增強(qiáng)體內(nèi)氧化反應(yīng)導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,從而引起血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙,誘發(fā)腦血管動(dòng)脈粥樣硬化,最終導(dǎo)致IS的發(fā)生[14]。而本研究所納入病人均為頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病人,其Hcy值本就高于正常人,而過(guò)高的Hcy水平會(huì)導(dǎo)致粥樣硬化的進(jìn)一步加重,從而導(dǎo)致IS的發(fā)生[15-16]。Glu對(duì)于循環(huán)系統(tǒng)具有顯著影響,研究顯示,Glu升高會(huì)在導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的同時(shí)誘發(fā)神經(jīng)損傷,二者在各自進(jìn)展的同時(shí)還存在相互影響的作用,可導(dǎo)致兩個(gè)系統(tǒng)損傷由周?chē)┥蚁蛑醒腙P(guān)鍵部位的進(jìn)展[3]。TC是構(gòu)成粥樣硬化斑塊的重要成分,同時(shí),過(guò)高的TC會(huì)導(dǎo)致血液流變情況遲緩,從而導(dǎo)致局部血流情況變差,這是導(dǎo)致IS的重要影響因素,而本研究中IS病人TC明顯升高,說(shuō)明TC對(duì)于IS的發(fā)生可能具有一定的影響,這與Carson等[17]的研究相似。在影像學(xué)表現(xiàn)中,斑塊不穩(wěn)定及冠心病病人IS發(fā)生率升高,斑塊不穩(wěn)定脫落形成血栓是IS發(fā)生的重要機(jī)制之一,而頸動(dòng)脈粥樣硬化合并冠心病病人形成血栓的概率更高,尤其是冠心病會(huì)導(dǎo)致心肌功能損傷,從而影響心房、心室的功能,最終影響血流狀態(tài),進(jìn)一步提升IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[18-19]。CD137是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員,研究表明,CD137/CD137L相互作用可能會(huì)激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的分泌和提高白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的轉(zhuǎn)錄[20]。而Ye等[21]的研究提示,TNF-α和IL-6在影響血管緊張素Ⅱ調(diào)節(jié)血壓作用中發(fā)揮重要作用,其中rs161827的顯性基因已經(jīng)被證實(shí)對(duì)于收縮壓具有顯著的影響,且并不排除其通過(guò)其他途徑對(duì)IS產(chǎn)生進(jìn)一步影響。RNLS是一種由腎臟分泌的單胺氧化酶,參與循環(huán)兒茶酚胺的氧化降解,研究表明,RNLS(rs10887800)可能是通過(guò)介導(dǎo)血糖代謝從而導(dǎo)致IS的發(fā)生[22]。ALOX5AP基因是5-脂氧合酶激活蛋白的編碼基因,研究顯示,rs4073259位點(diǎn)在普通人群中多處于沉睡狀態(tài),當(dāng)基因發(fā)生突變導(dǎo)致其顯性表達(dá)時(shí),可以通過(guò)激活白三烯等炎性因子表達(dá)途徑引起血管內(nèi)皮損傷進(jìn)而導(dǎo)致IS的發(fā)生[23]。而本研究結(jié)果顯示,IS病人上述3個(gè)基因顯性表達(dá)占比高于非IS病人,與上述研究結(jié)果類(lèi)似。

通過(guò)LASSO篩選使預(yù)測(cè)模型更具有可讀性,并建立Cox模型分析上述因素預(yù)測(cè)IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),AUC為0.901[95%CI(0.864,0.936)],說(shuō)明本研究構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述,基于多基因SNP的LASSO回歸模型對(duì)高危人群2年內(nèi)發(fā)生IS的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)具有一定的臨床價(jià)值,但是本研究為單中心、小樣本研究,需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并增加不同影響因素進(jìn)行驗(yàn)證;同時(shí)本研究由于時(shí)間限制隨訪期較短,需要進(jìn)一步延長(zhǎng)隨訪時(shí)間來(lái)證實(shí)本研究結(jié)果。