基于TLR4/NF-κB信號通路探討丹參酮ⅡA對病毒性心肌炎模型小鼠的心肌保護(hù)作用

陶斯陽

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是由柯薩奇病毒、埃可病毒等多種病毒感染誘發(fā)的,以局限性或彌漫性炎癥改變?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)的感染性心肌病,為常見的心臟疾病之一[1]。病毒性心肌炎好發(fā)于40歲以下的青壯年人群,資料顯示,其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率為0.12%～12.00%,我國發(fā)病率略高,為5%～15%,并且呈逐年上升趨勢[2]。該病起病隱匿,病情復(fù)雜,大部分可痊愈,但有研究顯示,若治療不當(dāng),10%～20%的病人可發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病[3],而8%～12%的病人會(huì)發(fā)生心源性猝死[4],嚴(yán)重威脅病人的生命健康。目前,病毒性心肌炎尚無特異性療法,西醫(yī)臨床治療以自由基清除劑為主,抗病毒藥、免疫抑制劑等及其他對癥療法為輔,療效并不理想。因此,尋找更為安全有效的藥物成為研究的熱點(diǎn),而中醫(yī)藥以其獨(dú)特的優(yōu)勢日益受到關(guān)注。丹參酮ⅡA為中藥丹參活性成分之一,其注射劑治療病毒性心肌炎有顯著的臨床療效,且安全性較高[5]。本研究主要通過觀察丹參酮ⅡA對Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號通路的影響,探討其對病毒性心肌炎小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級4～6周齡雄性健康BALB/C小鼠75只,由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2017-0005,體質(zhì)量16～20(18.25±1.13)g。所有小鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,保證環(huán)境恒溫21～23 ℃,恒濕50%～60%,有良好的通風(fēng)和采光,自然光線,自由飲用滅菌純水,進(jìn)食普通飼料,適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 柯薩奇病毒B3(CVB3)Nancy病毒、人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)購自美國ATCC公司。丹參酮ⅡA,CAS號:568-72-9,純度:高效液相色譜(HPLC)≥98%,規(guī)格:每瓶20 mg,購自南京道斯夫生物科技有限公司,采用0.9% NaCl配成濃度2.5 mg/mL、5.0 mg/mL的丹參酮ⅡA溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配;利巴韋林顆粒,規(guī)格:每袋0.1 g,國藥準(zhǔn)字H10970280,生產(chǎn)批號:20190314,沈陽藥科大學(xué)制藥有限公司生產(chǎn),采用0.9% NaCl溶解配成濃度為6.7 mg/mL的利巴韋林溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。磷酸鹽緩沖液(PBS)、含吐溫的Tris緩沖鹽溶液(TBST)購自北京凱瑞基生物科技有限公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自愛必信(上海)生物科技有限公司;大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒購自武漢維克賽思科技有限公司;TNF-α、IL-6、IL-1β免疫組化試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司;3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司;蛋白裂解液(RIPA)購自北京百奧萊博科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測試盒購自上?，庬嵣锟萍加邢薰?。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、電化學(xué)發(fā)生(ECL)法超敏發(fā)光液購自上海烜雅生物科技有限公司。兔抗鼠TLR4/NF-κB、肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自北京澤平科技有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 2406-2型CO2培養(yǎng)箱,美國SHELLAB公司產(chǎn)品;4200型離心機(jī),日本Kubota公司產(chǎn)品;Primo Star iLED型光學(xué)顯微鏡,蔡司Zeiss公司產(chǎn)品;TKA Teknolabo Miro型全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng),意大利TKA Teknolabo公司產(chǎn)品;Sub-Cell192型電泳槽、Trans-Blot SD 型半干轉(zhuǎn)印槽,美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.4 病毒溶液制備 采用CVB3感染Hela細(xì)胞,于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,后置于-70 ℃冰箱15 min,室溫融化,重復(fù)上述操作3 次后,1 500 r/min離心30 min,取上清液,即CVB3病毒液;稀釋病毒液,取10-10～1的10個(gè)滴度的病毒液各30 μL分別滴加到含有Hela細(xì)胞的96孔板內(nèi),每個(gè)滴度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,連續(xù)5 d觀察細(xì)胞病變情況,其中浮起且折光性增強(qiáng)的細(xì)胞為病變細(xì)胞,若病變細(xì)胞比例>50%即為病變孔。采用Reed等[6]的方法測得CVB3致半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

1.5 造模及給藥方法[7]將所有小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組,每組15只。模型組、丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組分別給予100的TCID50病毒液0.1 mL腹腔注射,對照組給予不含病毒的Eagle′s氏液0.1 mL腹腔注射。病毒接種30 min后,模型組和對照組分別給予0.9% NaCl溶液10 mL/kg灌胃,每日1次;丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組分別給予2.5 mg/mL、5.0 mg/mL丹參酮ⅡA溶液10 mL/kg灌胃,每日1次;陽性對照組給予6.7 mg/mL利巴韋林溶液灌胃,每日1次。各組小鼠均連續(xù)給藥14 d。

1.6 標(biāo)本采集與處理[8]末次給藥后,每組選取13只小鼠,稱量體質(zhì)量(BM)后摘眼球采血1 mL,室溫靜置60 min,用低溫離心機(jī)3 000 r/min離心15 min,分離血清,保存于-20 ℃冰箱備檢。處死小鼠,完整取出心臟,吸凈表面血液后稱量心臟重量(HM),沿左心室長軸分為兩部分,其中一部分心肌組織置于10%甲醛內(nèi)固定24 h,常規(guī)經(jīng)上行梯度乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,制成厚度為4 μm的切片,60 ℃烤片30 min,保存于4 ℃冰箱內(nèi),用于HE染色、免疫組化染色;另一部分心肌組織保存于-80 ℃冰箱,用于蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.7.1 心臟指數(shù)計(jì)算 計(jì)算公式為:心臟指數(shù)=HM/BM。

1.7.2 HE染色法觀察小鼠心肌組織病理變化 將心肌組織切片取出,經(jīng)二甲苯脫蠟、下行梯度乙醇(100%→95%→90%→80%→70%)水化后,參照文獻(xiàn)[9]以及HE染色試劑盒說明書進(jìn)行HE染色,之后常規(guī)上行梯度乙醇逐級脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在×400光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織變化,每張切片隨機(jī)采集5個(gè)不重復(fù)視野的圖像,計(jì)算心肌病理積分并取平均值,評分標(biāo)準(zhǔn)[10]:無組織壞死或炎性浸潤,計(jì)0分;組織壞死或炎性浸潤面積<25%,計(jì)1分;組織壞死或炎性浸潤面積為25%～50%,計(jì)2分;組織壞死或炎性浸潤面積為51%～75%,計(jì)3分;組織壞死或炎性浸潤面積>75%,計(jì)4分。

1.7.3 ELISA法檢測小鼠血清心肌損傷指標(biāo)及炎性因子水平 將血清恢復(fù)至室溫,依據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作,采用TKA Teknolabo Miro型全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)測定血清CK-MB、cTnT、TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.7.4 免疫組化染色觀察小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平 心肌組織切片脫蠟、水化后,置于枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù),按照免疫組化試劑盒的說明書進(jìn)行染色,分別依次采用1∶50稀釋的TNF-α、IL-6、IL-1β一抗4 ℃孵育16 h、生物素化二抗37 ℃孵育30 min,然后采用DAB試劑盒顯色,蘇木精復(fù)染,結(jié)束后常規(guī)脫水、透明、封片。在×400倍光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況,陽性細(xì)胞被染成棕褐色或棕黃色,每張切片隨機(jī)采集5個(gè)不重復(fù)視野的圖像,采用IPP 6.0軟件分析TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)的積分光密度值(IOD),并取平均值。

1.7.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法測定小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平[11]取出心肌組織100 mg,加入RIPA裂解液(含苯甲基磺酰氟)1 mL,于冰上研磨并裂解30 min,4 ℃、15 000 r/min離心15 min,上清液采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定總蛋白濃度;根據(jù)測定結(jié)果加入相應(yīng)體積4×蛋白上樣緩沖液,95 ℃加熱變性10 min;采用試劑盒制備SDS-PAGE凝膠固定在電泳槽上,加樣后,以恒壓50 V開始電泳,至目的蛋白剛跑出分離膠停止,用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至100%甲醇處理過的PVDF膜上,置于封閉液內(nèi)室溫?fù)u床封閉2 h,然后將PVDF膜置于1∶500稀釋的TLR4、NF-κB及內(nèi)參β-actin一抗工作液內(nèi),4 ℃搖床反應(yīng)過夜,取出后用TBST洗滌10 min×3次,將PVDF膜置于1∶3 000稀釋的二抗工作液內(nèi),室溫?fù)u床反應(yīng)90 min,再次用TBST洗滌10 min×3次,將配制好的ECL超敏發(fā)光液鋪于暗盒內(nèi)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜表面,曝光、顯影、定影。采集蛋白條帶圖像,采用Image J軟件分析TLR4、NF-κB及β-actin蛋白條帶灰度值,并分別計(jì)算TLR4、NF-κB相對內(nèi)參β-actin的表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心肌組織病理觀察結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)、纖維排列無異常,未見炎性細(xì)胞浸潤或組織壞死(見圖1A);模型組小鼠心肌組織存在心肌纖維溶解,大片組織壞死,大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(見圖1B);丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心肌組織壞死和炎性細(xì)胞浸潤較模型組不同程度緩解,其中丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組改善更為明顯(見圖1D、圖1E)。

圖1 各組小鼠心肌組織病理變化(HE染色,×400)(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

半定量分析顯示,與對照組比較,模型組小鼠心肌組織病理積分明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心肌組織病理積分降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠心肌組織病理積分降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠心肌組織病理積分比較(±s) 單位:分

2.2 各組小鼠心臟指數(shù)及血清心肌損傷指標(biāo)比較 與對照組比較,模型組小鼠心臟指數(shù)及血清CK-MB、cTnT水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心臟指數(shù)及血清CK-MB、cTnT水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠心臟指數(shù)及血清CK-MB、cTnT水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠心臟指數(shù)及血清CK-MB、cTnT水平比較(±s)

2.3 各組小鼠血清炎性細(xì)胞因子水平比較 與對照組比較,模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較(±s)

2.4 各組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平比較 與對照組比較,模型組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4、圖2～圖4。

表4 各組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平比較(±s) 單位:×102IOD值

圖2 各組小鼠心肌組織TNF-α表達(dá)結(jié)果(免疫組化染色,×400)(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

圖3 各組小鼠心肌組織IL-6表達(dá)結(jié)果(免疫組化染色,×400)(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

圖4 各組小鼠心肌組織IL-1β表達(dá)結(jié)果(免疫組化染色,×400)(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

2.5 各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平比較 與對照組比較,模型組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表5、圖5。

表5 各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較(±s)

圖5 各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)條帶圖(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

3 討 論

在中醫(yī)理論中病毒性心肌炎屬“風(fēng)溫”“心悸”“胸痹”“怔忡”等范疇,多因素體虧虛,溫邪趁虛而入,犯肺傷心所致,核心病機(jī)不外乎“虛”“毒”“瘀”,治療應(yīng)以補(bǔ)虛祛邪、活血化瘀為主[12]。丹參為臨床常用活血化瘀藥,有活血祛瘀、涼血消癰、養(yǎng)血安神之效,是中醫(yī)治療病毒性心肌炎的高頻用藥[13]。丹參酮ⅡA為提取自丹參的脂溶性非醌類衍生物成分,在丹參內(nèi)含量最高,其代謝產(chǎn)物能夠在機(jī)體內(nèi)發(fā)生多種生物化學(xué)反應(yīng)從而產(chǎn)生相應(yīng)藥理作用,研究顯示,其具有抗炎癥反應(yīng)、抗菌、抗病毒、抗脂質(zhì)過氧化、提高心功能、提高血管內(nèi)皮功能及心臟保護(hù)、抗腫瘤等多方面的藥理活性,在臨床廣泛用于心腦血管病的治療[14-15]。王德坤等[16]研究顯示,丹參酮ⅡA可能通過下調(diào)TNF-α、IL-6的表達(dá)來減輕病毒性心肌炎小鼠的心肌損傷,減少病死率,達(dá)到治療病毒性心肌炎的目的。研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可以通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá),促進(jìn)血管內(nèi)皮因子表達(dá),來減輕CVB3 Nancy病毒感染小鼠引起的冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷,并改善心肌灌流,促進(jìn)受損心功能恢復(fù)[17]。可見,丹參酮ⅡA能夠從多個(gè)途徑干預(yù)病毒性心肌炎的進(jìn)展,但具體的作用機(jī)制尚未明確。本研究采用CVB3 Nancy病毒腹腔內(nèi)接種,結(jié)果顯示,模型組小鼠心臟指數(shù)、血清CK-MB、cTnT水平及心肌組織病理積分等指標(biāo)均高于對照組,心肌組織病理觀察也出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常、大量炎性細(xì)胞浸潤及壞死灶,表現(xiàn)與人類病毒性心肌炎類似,成功建立了病毒性心肌炎小鼠模型。經(jīng)不同濃度的丹參酮ⅡA或利巴韋林干預(yù)后發(fā)現(xiàn),用藥組上述指標(biāo)均較模型組降低(P<0.05),且具有一定的量效關(guān)系,表明丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴性地改善病毒性心肌炎小鼠心肌組織的病理變化,減輕心肌損傷,對病毒性心肌炎發(fā)揮有效的治療作用。

作為一種炎癥性心肌病,炎癥反應(yīng)貫穿病毒性心肌炎的始終,故炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路、細(xì)胞因子等也成為病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制及藥物治療靶點(diǎn)研究的重要方面。關(guān)于丹參酮ⅡA治療病毒性心肌炎的具體作用機(jī)制,本研究從TLR4/NF-κB信號通路入手進(jìn)行了研究。TLR4屬于病原模式識(shí)別受體中的一員,對多種病毒抗原具有識(shí)別作用,可介導(dǎo)抗病毒固有免疫。研究顯示,TLR4可介導(dǎo)心肌組織炎癥反應(yīng),機(jī)體被CVB3等病毒感染時(shí),分布于心肌細(xì)胞膜上的TLR4能夠?qū)Σ《净蛐募〖?xì)胞被損傷后釋放的因子進(jìn)行識(shí)別,然后將相關(guān)刺激信號傳入細(xì)胞內(nèi),誘發(fā)級聯(lián)反應(yīng),激活下游的NF-κB,NF-κB為快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,被TLR4激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞因子合成釋放,產(chǎn)生免疫應(yīng)答,誘發(fā)炎癥反應(yīng)[18]。病毒性心肌炎病毒感染后NF-κB活性增強(qiáng),研究發(fā)現(xiàn),NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)能夠抑制NF-κB活性,下調(diào)A型流感病毒感染導(dǎo)致的病毒性心肌炎小鼠心肌促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β等表達(dá),減輕心肌炎癥浸潤[19-23]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低,心肌組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平也降低,且丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組與模型組的差異最明顯(P<0.05),表明丹參酮ⅡA能夠有效降低病毒性心肌炎小鼠心肌TLR4/NF-κB信號通路活性,降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平,這可能是丹參酮ⅡA降低病毒性心肌炎小鼠炎癥反應(yīng)程度的作用機(jī)制之一。

綜上所述,丹參酮ⅡA能有效減輕病毒性心肌炎小鼠心肌損傷和炎癥反應(yīng),且呈現(xiàn)一定量效關(guān)系,其心肌保護(hù)作用可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路的活性、減少炎性細(xì)胞因子釋放有關(guān)。