DNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增法聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的早期診斷價(jià)值

趙國(guó)連 雷倩 王佩 任云霞 關(guān)靖

結(jié)核性胸膜炎是由結(jié)核分枝桿菌直接感染胸膜或結(jié)核分枝桿菌菌體成分引起胸膜發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)引起,被劃歸為第5型肺結(jié)核,在我國(guó)結(jié)核病患者中約占6.5%～8.7%[1-2]。結(jié)核性胸膜炎的早期癥狀與肺結(jié)核相似,常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查方法的特異度較低,診斷難度較高。目前,結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)為胸腔積液或胸膜活檢標(biāo)本培養(yǎng)陽性,菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌,或胸膜活檢組織符合結(jié)核病改變[3]。由于胸膜穿刺活檢創(chuàng)傷大,胸腔積液含菌量低且培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),使得結(jié)核性胸膜炎的診斷尤其是早期診斷仍然具有挑戰(zhàn)性。近年來,分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)為結(jié)核性胸膜炎的快速診斷提供了新的思路[4]。據(jù)報(bào)道,恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)痰液中結(jié)核分枝桿菌DNA無需溫度變化,擴(kuò)增效率高,反應(yīng)時(shí)間短,且其反應(yīng)受抑制物的影響較小[5-6],但該檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用還鮮有報(bào)道。筆者探索了胸腔積液DNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增法(簡(jiǎn)稱“恒溫?cái)U(kuò)增法”)對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值,以及聯(lián)合常規(guī)快速檢測(cè)中的腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)和外周血結(jié)核感染 T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)檢測(cè)的診斷價(jià)值,以期在不增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的前提下加快診斷速度,以盡早開展治療。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象遴選

1.研究對(duì)象:采用回顧性研究方法,選取2020年1月至2021年12月西安市胸科醫(yī)院收治的不明原因胸腔積液患者427例作為研究對(duì)象,其中,男性294例(68.9%),女性133例(31.1%),年齡范圍為3～99歲,年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為56(34,70)歲。收集研究對(duì)象的人口學(xué)特征和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)包括恒溫?cái)U(kuò)增法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、ADA、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、C反應(yīng)蛋白、外周血T-SPOT.TB、胸膜組織活檢等檢測(cè)結(jié)果。

2.納入和排除標(biāo)準(zhǔn):(1)納入標(biāo)準(zhǔn):研究對(duì)象于入院后3 d內(nèi)進(jìn)行了外周血T-SPOT.TB、胸部CT掃描或胸部超聲檢查,并抽取胸腔積液進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、胸腔積液常規(guī)檢測(cè)及生化檢測(cè);(2)排除標(biāo)準(zhǔn):檢查結(jié)果缺失、HIV陽性、免疫抑制、非結(jié)核分枝桿菌感染患者。

3.診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)患者有發(fā)熱、咳嗽、乏力、盜汗等癥狀,影像學(xué)表現(xiàn)為胸腔積液,或抗結(jié)核藥物治療后胸腔積液明顯吸收;(2)胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性;(3)胸腔積液結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)檢測(cè)陽性;(4)胸膜組織活檢結(jié)核分枝桿菌陽性[7]。符合(1)且滿足(2)～(4)之一者,診斷為結(jié)核性胸膜炎。其他原因引起的胸腔積液為非結(jié)核性胸膜炎,包括感染性胸腔積液和惡性胸腔積液等。

二、研究方法

(一)儀器與試劑

恒溫?cái)U(kuò)增試劑購(gòu)自廣州迪澳生物科技有限公司,ADA、LDH、C反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑購(gòu)自寧波瑞源生物科技有限公司,MPB64蛋白單克隆抗體試劑購(gòu)自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司,T-SPOT.TB試劑購(gòu)自廣東希格生物科技有限公司。Deaou-308C恒溫?zé)晒釶CR快速檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自廣州迪澳生物科技有限公司,BACTEC MGIT 960系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BD公司,ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自德國(guó)西門子公司。胸膜組織全自動(dòng)活檢槍及配套活檢針購(gòu)自美國(guó)巴德公司。

(二)檢測(cè)方法

1.恒溫?cái)U(kuò)增法:將胸腔積液用氫氧化鈉處理,按照說明書加入DNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增試劑,在Deaou-308C恒溫?zé)晒釶CR快速檢測(cè)系統(tǒng)中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA特異性片段(插入序列IS6110)的熒光信號(hào)。儀器捕獲熒光產(chǎn)生的樣本曲線與閾值線(閾值線設(shè)置為超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn))交點(diǎn)橫坐標(biāo)讀數(shù)即為探測(cè)時(shí)間(detection time,dt;1 dt=1 min),dt<40判斷為陽性,dt≥40或無結(jié)果判斷為陰性。

2.結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng):將胸腔積液用氫氧化鈉處理,離心后,將上清液加入BACTEC MGIT 960系統(tǒng)進(jìn)行分枝桿菌液體培養(yǎng),培養(yǎng)出的陽性菌株先用萋-尼抗酸桿菌染色法進(jìn)行涂片鏡檢,再用膠體金標(biāo)記的MPB64蛋白單克隆抗體試劑進(jìn)行抗原檢測(cè),均為陽性的樣本則為結(jié)核分枝桿菌陽性。

3.ADA和LDH檢測(cè):將胸腔積液離心后加入緩沖液和ADA過氧化物酶試劑、LDH乳酸底物試劑,在ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀中測(cè)定ADA和LDH活性。

4.T-SPOT.TB檢測(cè):參照說明書,將外周血經(jīng)培養(yǎng)液處理后,使用Ficoll淋巴分離液分離出淋巴細(xì)胞,用AIM-V培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,加入特異性抗原反應(yīng)檢測(cè)孔培養(yǎng)20～22 h,隨后加入顯色液顯色,計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。

5.C反應(yīng)蛋白檢測(cè):在血清中加入氯化銨緩沖液,混勻孵育1～5 min,加入抗人C反應(yīng)蛋白抗體乳膠顆粒,混勻后讀取吸光度值。

6.胸膜組織活檢:采用超聲引導(dǎo)下的胸膜穿刺活檢術(shù)取出胸膜組織,將組織用福爾馬林液固定后,從顯微鏡下觀測(cè)組織是否有結(jié)核結(jié)節(jié)以及干酪樣壞死。

三、判斷標(biāo)準(zhǔn)

各檢測(cè)指標(biāo)中有一項(xiàng)陽性即判斷為并聯(lián)檢測(cè)陽性;各診斷指標(biāo)均為陽性即判斷為串聯(lián)陽性。成本-效果由成本與效果的比值表示(C/E),C/E越小性價(jià)比越高。本研究用各種檢測(cè)方法的約登指數(shù)(敏感度+特異度-1)表示其對(duì)結(jié)核性胸膜炎和非結(jié)核性胸膜炎的識(shí)別能力[8]。使用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)評(píng)估胸腔積液ADA的最佳診斷臨界值,以及各檢測(cè)方法的診斷效能。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料非正態(tài)分布,以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]”描述,組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn),相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)性分析;計(jì)數(shù)資料以“頻數(shù)和百分率(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本情況

427例研究對(duì)象中,279例(65.3%)確診為結(jié)核性胸膜炎(結(jié)核性胸膜炎組),其中,胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性者有84例(30.1%),胸腔積液恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)陽性88例(31.5%),合并肺結(jié)核者占88.2%(246/279)。427例研究對(duì)象中有30例參與了胸膜組織活檢,結(jié)核分枝桿菌陽性者占46.7%(14/30)。

148例確診為非結(jié)核性胸膜炎(非結(jié)核性胸膜炎組),其中,肺炎旁胸腔積液者110例(74.3%),惡性胸腔積液者37例(25.0%),合并肺結(jié)核者22例(14.9%)。37例惡性胸腔積液患者最終診斷為肺腺癌13例、肺鱗癌6例、肺小細(xì)胞癌4例、乳腺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移瘤3例、胸膜間皮瘤2例、淋巴癌1例、胸椎腫瘤1例、黏液纖維肉瘤1例、胸膜腺癌1例;另有5例未最終確診。

兩組患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果中,恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果、ADA水平、LDH水平、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果、外周血T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果,以及外周血C反應(yīng)蛋白水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。ADA和LDH有明顯相關(guān)性(r=0.709,P<0.001)。結(jié)核性胸膜炎患者、肺炎旁胸腔積液患者、惡性胸腔積液患者出現(xiàn)胸腔積液滲出液的比例分別為97.5%(272/279)、80.0%(88/110)、81.1%(30/37),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.687,P<0.001);出現(xiàn)血性胸腔積液的比例分別為7.9%(22/279)、6.4%(7/110)、43.2%(16/37),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.012,P<0.001)。

表1 各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果在結(jié)核性胸膜炎和非結(jié)核性胸膜炎患者中的分布情況

二、胸腔積液ADA最佳診斷臨界值

結(jié)核性胸膜炎組ADA水平明顯高于非結(jié)核性胸膜炎組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)ROC曲線,兩組ADA水平的最佳分界值為19.5 U/L,敏感度為74.9%,特異度為87.8%(圖1)。根據(jù)最佳分界值,胸腔積液ADA水平>19.5 U/L的為ADA陽性,≤19.5 U/L為ADA陰性,結(jié)核性胸膜炎組ADA陽性者有209例(74.9%),非結(jié)核性胸膜炎組ADA陽性者有19例 (12.8%),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=149.729,P<0.001)。

圖1 胸腔積液腺苷脫氨酶水平診斷結(jié)核性胸膜炎效能的受試者工作特征曲線

三、不同檢測(cè)方法的診斷價(jià)值

1.單獨(dú)檢測(cè):恒溫?cái)U(kuò)增法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的特異度均為100%,敏感度分別為31.54%和30.11%。ADA和外周血T-SPOT.TB的敏感度較高,分別為74.91%和84.95%,特異度分別為87.16%和74.91%。ADA和外周血T-SPOT.TB的ROC曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.81和0.78,比恒溫?cái)U(kuò)增法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法高(分別為0.66和0.65)。4種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值見表2,ROC曲線見圖2。

圖2 不同方法診斷結(jié)核性胸膜炎效能的受試者工作特征曲線

表2 不同檢測(cè)方案用于結(jié)核性胸膜炎檢測(cè)的成本-效果比較

2.聯(lián)合檢測(cè): 恒溫?cái)U(kuò)增法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、ADA,以及外周血T-SPOT.TB檢測(cè)可以通過并聯(lián)或串聯(lián)的方式組成多種聯(lián)合檢測(cè)方案。本研究根據(jù)敏感度、特異度、臨床適用性等最終選取了4種聯(lián)合檢測(cè)方案,分別是:(1)ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)并聯(lián);(2)ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)串聯(lián);(3)恒溫?cái)U(kuò)增法+ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)并聯(lián);(4)恒溫?cái)U(kuò)增法+結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)+ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)并聯(lián)。其中,ADA+T-SPOT.TB串聯(lián)、恒溫?cái)U(kuò)增法+ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)并聯(lián)、恒溫?cái)U(kuò)增法+結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)+ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)并聯(lián)的敏感度較高,分別為94.27%、94.98%、94.98%;ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)串聯(lián)的特異度為100.00%。方案(3)和(4)的各項(xiàng)指標(biāo)均一致。具體見圖3。

圖3 不同方法聯(lián)合診斷結(jié)核性胸膜炎效能的受試者工作特征曲線

四、不同檢測(cè)方案成本比較

4種檢測(cè)方法和4種聯(lián)合檢測(cè)方法的成本-效果(C/E)比較,其中,單種檢測(cè)方法中ADA檢測(cè)的C/E最小(16.13),性價(jià)比最高。聯(lián)合檢測(cè)方法中ADA+T-SPOT.TB檢測(cè)串聯(lián)性價(jià)比最高,C/E為669.23(表2)。恒溫?cái)U(kuò)增法+ADA+T-SPOT.TB并聯(lián)檢測(cè)有利于結(jié)核性胸膜炎早期診斷,且不會(huì)增加患者負(fù)擔(dān)。

討 論

結(jié)核性胸膜炎臨床癥狀與肺結(jié)核不易區(qū)分,許多結(jié)核性胸膜炎繼發(fā)于肺結(jié)核,通過臨床特征、影像學(xué)、結(jié)核抗體等常規(guī)檢查手段很難確診結(jié)核性胸膜炎[9]。結(jié)核性胸膜炎常伴有胸腔積液,其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)除了胸膜組織活檢陽性,還包括從胸腔積液中找到結(jié)核分枝桿菌,采用如抗酸桿菌染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測(cè)等方法。但是很多結(jié)核性胸膜炎患者是由少量的結(jié)核分枝桿菌及其菌體成分引起的胸膜變態(tài)反應(yīng),胸腔積液中的含菌量非常低,僅通過以上檢測(cè)方法容易導(dǎo)致漏診[1,10]。

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)需要約21～30 d才能獲得結(jié)果,延誤診斷時(shí)間。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,快速檢測(cè)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的RNA和DNA有利于早期診斷肺結(jié)核[4,11-12]。目前,PCR-熒光探針法檢測(cè)胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌DNA(TB-DNA)和恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌RNA在臨床已有應(yīng)用,但其檢測(cè)陽性率不足20%,且價(jià)格較高,臨床適用性不強(qiáng)[10-11]。恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌DNA的應(yīng)用少有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增法與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的檢測(cè)陽性率相當(dāng)(超過30%),且特異度均為100%,未發(fā)現(xiàn)假陽性,檢測(cè)速度快(僅需3 h)。另外,GeneXpert MTB/RIF和胸腔積液游離核酸檢測(cè)(cell-freeMycobacteriumtuberculosisDNA test,CF.TB)可明顯提高結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感度[13-16],但由于GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)價(jià)格昂貴及CF.TB還未有成熟的商品化試劑等因素,筆者所在醫(yī)院檢測(cè)患者較少,難以對(duì)照,因此沒有納入研究。

除了結(jié)核性胸膜炎,炎癥、惡性腫瘤、自身免疫性疾病也常伴有胸腔積液,可以使用具有一定特異性的生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒別診斷。不同研究中利用胸腔積液ADA檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的界值差異較大,還未有定論[17-18]。ADA檢測(cè)還會(huì)受到免疫狀態(tài)、年齡、吸煙史、結(jié)核性胸膜炎發(fā)展階段等因素的影響[19-20]。本研究初步確定了利用ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的最佳分界值,可為后續(xù)研究提供參考。另外,雖然胸腔積液T-SPOT.TB的診斷效果明顯高于外周血,較少受到肺結(jié)核伴胸腔積液的干擾[21],但是在實(shí)際臨床應(yīng)用中,不明原因胸腔積液的患者在初期篩查時(shí),尤其在綜合醫(yī)院就診時(shí)通常會(huì)檢測(cè)外周血T-SPOT.TB,轉(zhuǎn)入?？漆t(yī)院后為了節(jié)約費(fèi)用不會(huì)再做胸腔積液T-SPOT.TB檢測(cè)。因此,本研究?jī)H收集了外周血T-SPOT.TB檢測(cè)數(shù)據(jù)。經(jīng)過對(duì)比分析,胸腔積液ADA和外周血T-SPOT.TB檢測(cè)并聯(lián)的檢測(cè)敏感度較高(94.27%),串聯(lián)的特異度較高(99.32%)?？梢?合理利用胸腔積液ADA和外周血T-SPOT.TB聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果可以提高結(jié)核性胸膜炎的診斷效能。

本研究顯示,恒溫?cái)U(kuò)增法+ADA+T-SPOT.TB并聯(lián)和恒溫?cái)U(kuò)增法+結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)+ADA+T-SPOT.TB并聯(lián)的檢測(cè)效能完全一致。在實(shí)際臨床應(yīng)用中,可以通過胸腔積液ADA<19.5 U/L且T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陰性排除結(jié)核性胸膜炎,用任意胸腔積液ADA≥19.5 U/L、T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果陽性、恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)果陽性確診結(jié)核性胸膜炎。雖然這3項(xiàng)檢查結(jié)果分別為生化、免疫、病原學(xué)指標(biāo),但是均為快速檢測(cè)方法,有助于早期診斷和治療。且ADA和T-SPOT.TB為結(jié)核性胸膜炎疑似患者的常規(guī)檢查,并不會(huì)額外增加患者負(fù)擔(dān)。

根據(jù)各檢測(cè)方案的成本比較,獨(dú)立檢驗(yàn)中胸腔積液ADA檢測(cè)的成本-效果比最低,方案最為經(jīng)濟(jì),但其敏感度和特異度不足90%,且影響因素較多,不宜作為單獨(dú)診斷方案。對(duì)于結(jié)核性胸膜炎早期診斷,使用恒溫?cái)U(kuò)增法獲得病原學(xué)診斷依據(jù),同時(shí)可以聯(lián)合ADA、T-SPOT.TB檢測(cè)獲得較高的性價(jià)比。

本研究的不足之處在于未能納入檢測(cè)效能更高的GeneXpert MTB/RIF、CF.TB等方法作為對(duì)照。另外,本研究為回顧性分析和單中心研究,結(jié)果有局限性,還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,胸腔積液結(jié)核分枝桿菌DNA恒溫?cái)U(kuò)增法在結(jié)核性胸膜炎的臨床診斷中具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,與ADA、T-SPOT.TB等快速檢測(cè)方案并聯(lián)可以在患者就診早期診斷結(jié)核性胸膜炎。靈活運(yùn)用以上幾種檢測(cè)的聯(lián)合方案可以獲得較高的性價(jià)比,減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)趙國(guó)連:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、采集數(shù)據(jù)、獲取研究經(jīng)費(fèi);雷倩:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析、起草文章;王佩和任云霞:采集、分析/解釋數(shù)據(jù)、行政、技術(shù)或材料支持;關(guān)靖:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析