細菌外泌體DNA的來源與生物學(xué)功能研究進展

劉丁一 孫宏 盛鋼 孫照剛

外泌體(extracellular vesicles)的生成與釋放在自然界中是一種普遍現(xiàn)象,無論是哺乳動物細胞,還是細菌都會釋放外泌體,且釋放的外泌體大小相近,一般在20～400 nm。外泌體內(nèi)可包含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)及一些其他代謝產(chǎn)物,對于細胞或細菌的種內(nèi)和種間交流都起著十分重要的作用。有研究表明,人體細胞產(chǎn)生外泌體就可參與進行信號傳導(dǎo)的信號級聯(lián)和神經(jīng)細胞間的相互溝通[1-2]。同時,對細菌外泌體結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn),其具有多種形式,如外膜囊泡、外-內(nèi)膜囊泡、質(zhì)膜囊泡等[3]。

細菌外泌體是包裹有細菌部分內(nèi)容物的囊性結(jié)構(gòu)體,呈圓球狀,可釋放到鄰近組織或進行長距離運輸。細菌外泌體很早開始進入大眾視野。最初,細菌外泌體被認為是細菌死后產(chǎn)生的碎片,被極性脂類包裹而成的囊性結(jié)構(gòu)。在20世紀60年代,研究人員觀察到大腸埃希菌在活性狀態(tài)下可產(chǎn)生囊泡,首次提出了細菌外泌體的概念,20世紀90年代革蘭陽性菌的外泌體被發(fā)現(xiàn)。至此,學(xué)界達成共識,細菌外泌體是細菌生命活動中的一種普遍現(xiàn)象,且可由活細菌產(chǎn)生,在細菌的生存生長過程中細菌外泌體發(fā)揮著重要作用[4-6]。

在以往實驗中,研究人員通過運用透射電子顯微鏡、質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多種方式進行分析,發(fā)現(xiàn)細菌外泌體攜帶著多種細胞內(nèi)含物,包括蛋白質(zhì)、毒素、核酸、脂質(zhì)及代謝產(chǎn)物等。這些內(nèi)容物參與影響了細菌的許多生命活動,如某些毒力因子介導(dǎo)參與了病原菌對宿主的侵襲,某些脂質(zhì)與外泌體膜的穩(wěn)定及外泌體的釋放有關(guān),外泌體內(nèi)的mRNA也可以進入到宿主細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄翻譯等[7]。因此,細菌外泌體在感染性疾病、免疫性疾病和腫瘤等多種疾病中具有廣闊的研究前景。

DNA作為細菌重要的遺傳物質(zhì),在其生物學(xué)功能上有不言而喻的重要作用。諸多研究證實了細菌DNA可以被包裹進細菌外泌體中,在細胞毒性、抗生素耐藥、水平基因轉(zhuǎn)移、生物膜合成及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。同時,受限于現(xiàn)有的外泌體分離純化及深入分析的方法尚未成熟,目前人們對于細菌外泌體DNA的了解還十分有限。筆者對細菌外泌體DNA的產(chǎn)生及生物學(xué)功能進行了較為系統(tǒng)的整理,并分析討論該領(lǐng)域未來可能的研究方向。

細菌外泌體DNA的產(chǎn)生

細菌外泌體可以包裹細菌DNA作為其內(nèi)容物,實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的遠距離遞送。根據(jù)細菌外被結(jié)構(gòu)不同,對細菌外泌體DNA的產(chǎn)生進行分類研究,大致可以分為革蘭陰性菌外泌體DNA分泌機制和革蘭陽性菌外泌體DNA分泌機制兩個方面。革蘭陰性菌具有雙重雙層膜結(jié)構(gòu),兩層之間有一層肽聚糖,并且外膜含有脂多糖;而革蘭陽性菌只有一重雙層內(nèi)膜,最外層是由肽聚糖構(gòu)成的厚細胞壁。因此,從結(jié)構(gòu)理論上講,革蘭陽性菌分泌外泌體比革蘭陰性菌分泌外泌體的阻力更大,在這樣的假想下,人們對于革蘭陽性菌外泌體研究產(chǎn)生了偏見,使其落后于革蘭陰性菌外泌體研究長達30年之久,直到近些年革蘭陽性菌外泌體研究才開始發(fā)展起來。而到現(xiàn)在,對于革蘭陰性菌和革蘭陽性菌細菌外泌體的分泌機制的研究,學(xué)者們也僅僅是提出了很多假設(shè)模型。

一、革蘭陰性菌外泌體DNA的分泌機制

早在1995年就有報道發(fā)現(xiàn)來自銅綠假單胞菌的外泌體中含有DNA,證明了革蘭陰性菌外泌體中含有DNA。革蘭陰性菌外泌體起泡于細菌外膜,包裹著細菌周質(zhì)成分,這種細菌外泌體被稱為外膜囊泡。然而,DNA主要在細菌胞質(zhì)內(nèi),肽聚糖成為了胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)進入細菌外泌體的最大阻礙。后來,在對囊泡希瓦氏菌M7(T)超微結(jié)構(gòu)進行研究時,發(fā)現(xiàn)了一種由內(nèi)膜和外膜,二重雙層膜構(gòu)成的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的細菌外泌體。同時,該研究還運用特異性單克隆IgM對雙鏈DNA進行免疫金標記,證實了囊泡內(nèi)有DNA的存在[8]。之后這種特殊的細菌外泌體被命名為外-內(nèi)膜囊泡。由此,研究人員提出一種細菌DNA進入細菌外泌體的假設(shè)——內(nèi)膜和外膜之間的肽聚糖層被削弱溶解,得以讓內(nèi)膜包裹著細胞質(zhì)內(nèi)容物(其中包括DNA)向外膜方向突出,最終形成完整的細菌外泌體,即外-內(nèi)膜囊泡。隨后,諸多研究也發(fā)現(xiàn),許多細菌在產(chǎn)生外膜囊泡的同時也會產(chǎn)生外-內(nèi)膜囊泡,且DNA幾乎全部被裝載在外-內(nèi)膜囊泡中釋放[9]。

外-內(nèi)膜囊泡結(jié)構(gòu)可以解釋胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)粒DNA的分泌過程,而基因組DNA作為細菌最為穩(wěn)定的遺傳物質(zhì),其進入細菌外泌體的難度巨大。研究人員曾認為細菌外泌體中出現(xiàn)了基因組DNA是由于細菌裂解的緣故。DNA損傷引發(fā)細菌裂解,之后DNA片段被包裹進細菌的囊泡,釋放到外周環(huán)境。這種細菌外泌體DNA的出現(xiàn)就意味著細菌生命周期的結(jié)束。后來,有研究人員通過對5種不同革蘭陰性致病菌外膜囊泡內(nèi)的DNA進行分析,發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期,基因組DNA被包裹進細胞外膜囊泡后釋放到細胞外,這些DNA大部分位于外膜囊泡外,少量位于外膜囊泡內(nèi)部[10]。因此,通過早期對細菌(主要是革蘭陰性菌)外泌體的研究,表明了胞質(zhì)質(zhì)粒DNA及基因組DNA均可作為細菌外囊泡DNA的來源。

雖然研究人員對革蘭陰性菌外泌體早已展開研究,但對其內(nèi)容物的選擇機制和內(nèi)容物所含物質(zhì)的完整分析等方面的研究還存在很多不足。時至今日,在結(jié)合大量研究結(jié)果進行整理分析后,對于革蘭陰性菌外泌體的起泡模型,研究人員基本達成了一致。大致分為4種:(1)錯誤折疊的蛋白質(zhì)、脂多糖及DNA片段在周質(zhì)的積累導(dǎo)致包膜壓力的增加,從而在壓迫下形成外泌體;(2)外層膜和肽聚糖層之間共價鍵斷裂或相互錯位,以及肽聚糖內(nèi)肽酶降解破壞肽聚糖的交聯(lián),從而使膜的連接呈現(xiàn)不穩(wěn)定性,促使外泌體在其薄弱部位形成出芽;(3)某些特殊的分子化合物,如脂質(zhì)、脂多糖和氟喹諾酮假單胞菌信號(pseudomonas quinolone signal,PQS)等,可通過增加膜彎曲,促進外泌體的形成;(4)存在一種特殊情況:在DNA損傷應(yīng)激條件下,前噬菌體來源的內(nèi)毒素表達增加會引起肽聚糖變薄,導(dǎo)致細菌裂解,裂解的碎片被包裹形成外-內(nèi)膜囊泡[3]。

二、革蘭陽性菌外泌體DNA的分泌機制

由于厚細胞壁的存在,在很長時間內(nèi),研究人員對革蘭陽性菌外泌體的研究興趣不大。最近幾年有關(guān)革蘭陽性菌外泌體的研究開始受到關(guān)注,并展現(xiàn)出了巨大的潛力[11]。有研究人員發(fā)現(xiàn),在對枯草芽孢桿菌的研究中,類似于革蘭陰性菌外-內(nèi)膜囊泡的起泡機制,噬菌體來源內(nèi)毒素會在肽聚糖細胞壁上產(chǎn)生孔洞,致使細胞質(zhì)膜包裹物質(zhì)以囊泡的形式突破到細胞外[12]。這一過程會致使細菌細胞壁產(chǎn)生缺損,誘導(dǎo)細胞死亡,稱為“鼓泡細胞死亡”。此過程中所產(chǎn)生的囊泡被稱為細胞質(zhì)膜囊泡,常出現(xiàn)于革蘭陽性菌生命活動中?，F(xiàn)有的關(guān)于革蘭陽性菌外泌體DNA的研究中,產(chǎn)生了許多有意義的發(fā)現(xiàn)。有研究人員在觀察了單核增生李斯特菌的ΔsigB突變體和同源的野生型后發(fā)現(xiàn),野生型菌株的外泌體的產(chǎn)量約為ΔsigB突變體的9倍,同時所產(chǎn)生的外泌體更為完整[13]。而與毒力相關(guān)的雙組分調(diào)節(jié)因子CovRS的基因破壞會導(dǎo)致A組鏈球菌(GAS)外泌體產(chǎn)量的增加[14]。這些均為全局性調(diào)控因子,驅(qū)動著眾多遺傳基因的表達。同時也存在著特異性基因,如結(jié)核分枝桿菌的virR基因、Rv3371基因,以及金黃色葡萄球菌中的psmα基因,可調(diào)節(jié)外泌體的分泌[15-17]。由此可以看出,革蘭陽性菌外泌體的分泌并不是靠少數(shù)幾個基因,而是需要全局調(diào)控因子的參與,同時不可忽視某些特殊基因的調(diào)節(jié)作用[18]。

雖然研究人員對革蘭陽性菌外泌體的研究越來越多,但是其發(fā)生機制仍不明確。根據(jù)現(xiàn)有的研究成果,革蘭陽性菌外泌體的分泌機制大致分為3種假說:(1)與革蘭陰性菌類似,受迫于膨脹壓力,外泌體得以穿過細胞壁,從質(zhì)膜釋放;(2)存在細胞壁修飾酶,在外泌體釋放的同時一起到達細胞壁,導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)改變,引起外泌體的釋放,如金黃色葡萄球菌通過肽聚糖降解酶促進其外泌體的釋放[19],質(zhì)膜囊泡是由于細胞壁被破壞,也可歸為此類;(3)在細胞壁上存在一些運輸通道,外泌體具有變形能力,可以允許它們通過比自身體積更窄的孔隙,如隱球菌細胞壁上的細胞孔徑在50～500 nm不等,與外泌體直徑相似,猜測與其釋放有關(guān)[20]。

細菌外泌體DNA的生物學(xué)作用

細菌通過將某些大分子物質(zhì)包裹進入外泌體后,將其分泌到細菌細胞外,在細菌的周圍環(huán)境或?qū)κ荏w細胞產(chǎn)生重要的生物學(xué)作用。有研究證明,細菌外泌體DNA在物種間和物種內(nèi)進行運輸,促進了種間和種內(nèi)的DNA交換。通過外泌體進行的水平基因轉(zhuǎn)移,在信息傳遞的同時還防止了酶等物質(zhì)對DNA的破壞,保障了DNA信息的完整性。同時,也有研究說明,外泌體相關(guān)的外DNA(eDNA)協(xié)助了細菌生物膜的形成和穩(wěn)定,輔助宿主定植。在感染發(fā)病方面,細菌外泌體DNA可以刺激誘導(dǎo)機體的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。通過對以上生物學(xué)功能的研究,或許會進一步拓展人們對細菌外泌體DNA的了解。

一、細菌外泌體DNA促進基因在細菌間的轉(zhuǎn)移

細菌可以通過種間或種內(nèi)的水平基因的轉(zhuǎn)移和遞送,實現(xiàn)其生物學(xué)功能的進化,使細菌能在不同環(huán)境下都具有更強的生存適應(yīng)性。利用細菌外泌體進行遺傳物質(zhì)的呈遞,避免了熱溶解效應(yīng),以及核酸酶降解對基因產(chǎn)生的影響,實現(xiàn)了遺傳物質(zhì)長距離穩(wěn)定的運輸[21]。有研究表明,大腸埃希菌O157∶H7釋放的外泌體內(nèi)含有志賀毒素和毒力基因,之后通過對該外泌體的進一步研究發(fā)現(xiàn),通過外泌體對毒力基因的呈遞,使得受體大腸埃希菌JM109產(chǎn)生了基于毒力基因生物學(xué)功能的表達[22]。同樣,在產(chǎn)氣夾膜桿菌外泌體的研究中,研究人員從純化外泌體中擴增出編碼α毒素和毒素產(chǎn)氣夾膜溶解素O的基因[23],以及在銅綠假單胞菌的細胞外泌體中也發(fā)現(xiàn)了DNA和毒力因子的存在[24],進一步確定了外泌體具備毒力基因轉(zhuǎn)移的能力。另一方面,鮑曼不動桿菌通過表達bla(OXA-24)基因,可產(chǎn)生對碳青霉烯酶類藥物的耐藥。有研究發(fā)現(xiàn),將包裹有bla(OXA-24)基因的外膜囊泡與對碳青霉烯酶類藥物敏感的鮑曼不動桿菌宿主菌株一起進行孵化,使該菌株對碳青霉烯酶類藥物產(chǎn)生了耐藥性;同時檢測出宿主菌株可以釋放出包含攜帶bla(OXA-24)基因的原始質(zhì)粒的外膜囊泡[25]。這表明細菌外泌體具有抗生素耐藥基因轉(zhuǎn)移的能力。另外,在對外泌體RNA的研究中也發(fā)現(xiàn),癌癥相關(guān)成纖維細胞分泌含有miRNA的外泌體增強癌癥干細胞的生長,從而提高了結(jié)腸癌的耐藥性,這種依賴外泌體進行的耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移在乳腺癌中也有發(fā)現(xiàn)[26-27]。綜上說明,細菌通過外泌體進行水平基因的轉(zhuǎn)移,產(chǎn)生了多樣的生物學(xué)功能,使細菌可以在多種環(huán)境下都具有極強的生存能力。

二、細菌外泌體DNA與細菌生物膜的聯(lián)系

細胞eDNA是生物膜細胞外基質(zhì)的主要組成部分。研究人員發(fā)現(xiàn),幽門螺旋桿菌和羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生包裹有eDNA的外泌體,并通過對活細胞和死細胞進行熒光染色之后的對比分析,證明外泌體與生物膜的生成有關(guān)[28-29]。并且研究人員通過將變形鏈球菌的生物膜培養(yǎng)在含有DNA酶的培養(yǎng)基中,觀察到變形鏈球菌生物膜的產(chǎn)生顯著減少,之后又將用DNA酶處理過的生物膜與接受熱滅活酶的生物膜進行分析比較,發(fā)現(xiàn)前者更脆弱,更容易被破壞,說明eDNA在生物膜生成與穩(wěn)定方面具有十分重要的生物學(xué)作用;同時還發(fā)現(xiàn)生物膜的形成也促進了eDNA的產(chǎn)生,證明二者相輔相成,相互促進[30]。而在對幽門螺旋桿菌的研究中發(fā)現(xiàn),其產(chǎn)生的外泌體可以通過阻止DNA酶對eDNA的降解來發(fā)揮結(jié)構(gòu)性作用,并且外泌體可以在其表面的eDNA 鏈之間發(fā)揮橋接作用并促進聚集,說明外泌體對eDNA與生物膜的聯(lián)系可產(chǎn)生積極作用[29]。Gloag等[31]通過運用延時顯微鏡和計算機視覺算法觀察分析銅綠假單胞菌生物膜的運動,發(fā)現(xiàn)生物膜在生物表面移動擴張的過程中形成溝壑,擴張的細菌運動首先沿溝壑進行,頭部細菌的運動需要eDNA的協(xié)調(diào),同時eDNA使細菌在運動過程中排列保持連貫,形成了高速有效的擴張運動,保障了生物膜的無障礙形成過程。由此證明了eDNA的協(xié)助和溝通作用促進了生物膜復(fù)雜溝壑網(wǎng)絡(luò)的形成。上述研究可以證明,細菌外泌體DNA(特別是eDNA)促進了細菌生物膜的生成并在生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。

三、細菌外泌體DNA與感染發(fā)病

外泌體中包裹的許多物質(zhì)都有成為免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中抗原或者配體成分的潛力,因此研究人員進行諸多研究,發(fā)現(xiàn)外泌體存在誘導(dǎo)先天和適應(yīng)性免疫方面的能力。同時發(fā)現(xiàn),外泌體在免疫調(diào)節(jié)方面的功能可能與DNA介導(dǎo)信號通路、抗原肽的呈遞、miRNA的基因表達操控,以及表面配體誘導(dǎo)不同信號途徑有關(guān)[32]。在金黃色葡萄球菌外泌體的研究中發(fā)現(xiàn),外泌體DNA可以被Toll樣受體和含核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2蛋白檢測到,最終導(dǎo)致核因子-κB的激活,以及上皮細胞產(chǎn)生促炎癥細胞因子和趨化因子[33]。而在另一種革蘭陽性菌——單核增生李斯特菌外泌體DNA的研究中也發(fā)現(xiàn),外泌體可以作為載體,將DNA作為刺激干擾素生成的病原體相關(guān)分子模式,從供體細胞中釋放出來,刺激受體細胞環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶-干擾素基因刺激物(cGAS-STING)信號通路,激活其免疫反應(yīng),同時外泌體也促進T淋巴細胞的干擾素基因刺激物依賴性凋亡[34]。同樣的現(xiàn)象在土拉弗朗西斯菌、結(jié)核分枝桿菌和嗜肺軍團菌中也存在。在對結(jié)核分枝桿菌的研究中還發(fā)現(xiàn),外泌體可以刺激分枝桿菌致敏的CD4+和CD8+T細胞,以及促進體內(nèi)巨噬細胞的招募[35-36]。而進一步對結(jié)核分枝桿菌DNA進行分析,其存在cGAS-STING信號通路的同時還有其他的結(jié)構(gòu)通路以激活機體的免疫反應(yīng)。一方面,結(jié)核分枝桿菌DNA中存在未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸,通過Toll樣受體9可以刺激激活哺乳動物的免疫細胞,另一方面,結(jié)核分枝桿菌DNA可以通過外泌體的方式向外分泌,二者可能存在聯(lián)系[37-38]。而在病毒相關(guān)機體免疫反應(yīng)的研究中,發(fā)現(xiàn)T細胞通過外泌體將基因組DNA和線粒體DNA傳遞到樹突狀細胞(DC細胞)內(nèi),從而單向地激活抗病毒反應(yīng),同時在與外泌體接觸后,DC細胞具備了更強的病毒抵抗力[39]。同樣在寄生蟲引起人體免疫反應(yīng)的研究中也發(fā)現(xiàn),人單核細胞吸收惡性瘧原蟲產(chǎn)生外泌體,其內(nèi)部含有DNA,可引發(fā)干擾素基因刺激物依賴性的DNA傳感。該途徑可能是增強瘧原蟲感染毒力的重要機制[40]。這證明寄生蟲感染引起的機體免疫也與外泌體有關(guān)。上述各研究綜合說明,外泌體(尤其是外泌體DNA)在感染性疾病免疫方面起到重要作用,這種現(xiàn)象在細菌、寄生蟲和病毒中均存在。

問題及展望

細菌外泌體DNA對于細菌的生存和發(fā)育都起著十分重要的作用。從現(xiàn)有研究來看,人們對于細菌外泌體DNA有了一定的了解,包括不同的來源、多種的分泌形式,以及其發(fā)揮的重要生物學(xué)作用。目前已知,對于細菌DNA,無論是細胞核內(nèi)DNA還是胞質(zhì)中的質(zhì)粒DNA,都可通過外泌體進行運輸釋放,之后可以通過水平基因的轉(zhuǎn)移引起細菌的抗生素耐藥,參與細菌的細胞毒性反應(yīng);也可以在生物膜生成與穩(wěn)定中發(fā)揮作用;還可以促進細菌對機體的感染,激活機體的免疫反應(yīng)。

當前,對于細菌外泌體DNA的研究,受限于研究條件的影響,缺乏分離和純化細菌外泌體的標準方法,并且缺乏細菌外泌體個體標記物的特異性識別方式,因此對于細菌外泌體還存在許多未知的方面,但這也說明對于細菌外泌體和外泌體DNA的研究還存在著十分廣闊的發(fā)展空間。

對于細菌外泌體介導(dǎo)的其他生命活動功能,如群體感應(yīng)、抗噬菌體效應(yīng)、細菌的黏附和入侵,以及宿主免疫調(diào)節(jié)等,可以明確的是,外泌體內(nèi)的諸多大分子物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等都參與其中,而外泌體DNA是否發(fā)揮了一定作用,還需要更進一步的研究。這一方向可能將成為未來外泌體DNA研究的重點。另外,在外泌體與臨床應(yīng)用聯(lián)系方面,現(xiàn)有研究已經(jīng)證明,所有細胞都可分泌外泌體,且外泌體存在于所有生物液體中,這使得其具備了成為縱向追蹤疾病進程的微創(chuàng)活檢采集物的潛力。并且,研究人員發(fā)現(xiàn)外泌體與人體諸多疾病有著密切的聯(lián)系,包括感染性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管和代謝性疾病及癌癥等,這說明了外泌體在疾病的預(yù)防和診療方面的巨大潛力。未來外泌體將會成為臨床上疫苗開發(fā)、藥物傳遞、納米醫(yī)療和疾病診斷的重要手段[32]?，F(xiàn)如今針對外泌體DNA的臨床應(yīng)用,已經(jīng)初步開始進行外泌體基因工程的研究,通過添加程序性死亡蛋白1(programmed death 1,PD1)的胞外域來修飾外泌體的表面。工程化的外泌體PD1可以結(jié)合腫瘤細胞表面上的程序性死亡受體配體1(programmed death ligand 1,PD-L1),并促進其減少表面上的PD-L1,從而抑制T細胞和癌細胞之間的PD1與PD-L1相互作用[41]。未來還需要繼續(xù)探究細菌外泌體DNA的臨床應(yīng)用領(lǐng)域,深究其優(yōu)勢與潛力方向,同時也要注意解決細菌外泌體DNA臨床應(yīng)用出現(xiàn)的問題,包括臨床應(yīng)用的可重復(fù)性、細菌外泌體的免疫毒性,以及針對應(yīng)用的有效性等,如何減輕甚至消除這些影響,也將是我們今后研究的重點方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻劉丁一:醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章;孫宏:醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導(dǎo);盛鋼:采集數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導(dǎo);孫照剛:醞釀和設(shè)計實驗、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導(dǎo)