呋咱氮氧化薯蕷皂苷元拼合物的合成及其抗腫瘤活性研究

肖敏捷,劉永謙,梁家榮,邱 翔,雷橋良,招仲恒,王 濤*

（1.佛山市婦幼保健院a.藥劑科;b.產(chǎn)二科，廣東 佛山 528000;2.廣東省婦幼保健院 藥學部,廣東 廣州510010;3.廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院,廣東 廣州 510006）

呋咱氮氧化薯蕷皂苷元拼合物的合成及其抗腫瘤活性研究

肖敏捷1a,劉永謙2,梁家榮3,邱 翔3,雷橋良1b,招仲恒3,王 濤3*

（1.佛山市婦幼保健院a.藥劑科;b.產(chǎn)二科，廣東 佛山 528000;2.廣東省婦幼保健院 藥學部,廣東 廣州510010;3.廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院,廣東 廣州 510006）

目的：合成強生物活性的薯蕷皂苷元衍生物并探討其體外抗腫瘤活性。方法：實驗通過環(huán)加成、縮合、氧化等反應，設計薯蕷皂苷元與呋咱氮氧化物類一氧化氮供體拼合得到目標化合物。并采用噻唑藍（MTT）法考察目標化合物對HT-29、HepG-2、MCF-7等3種腫瘤細胞株的體外細胞毒性。結(jié)果：實驗合成了6個新的呋咱氮氧化薯蕷皂苷元拼合物，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)IR、1H NMR和、13C NMR等確證。同時MTT實驗結(jié)果表明，所合成目標化合物對HT-29、Hepg-2、MCF-7 3種腫瘤細胞均無明顯細胞毒性。結(jié)論：實驗設計的呋咱氮氧化薯蕷皂苷元拼合物合成路徑可行，但化合物的無明顯抗腫瘤活性，推測化合物NO釋放呈低濃度釋放，而低濃度NO釋放表現(xiàn)為抑制細胞凋亡。

薯蕷皂苷元拼合物；合成；NO供體；抗腫瘤活性

薯蕷皂苷元（Diosgenin，Dio）作為一種天然甾體化合物，早期主要用于合成甾體激素類藥物。但隨著研究的深入，其抗腫瘤作用也日益受到廣大學者的關注。有研究表明，Dio參與癌細胞發(fā)展的多個生物學過程從而發(fā)揮抗腫瘤作用[1]，且作用效果呈明顯的劑量依賴性，并可通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達和增加促凋亡蛋白半胱天冬酶-3（caspase-3）來誘導細胞凋亡[2，3]。也可促進巨噬細胞內(nèi)NO的分泌，改善特異性和非特異性細胞免疫反應、抑制survivin基因表達、抑制人胃低分化粘液腺癌MGC-803細胞的DNA合成以及人骨肉瘤U-2OS細胞MMP-9/TIMP-1 RNA的表達從而改善免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用[4-6]。

NO是具有高度反應性的小分子自由基，在細胞調(diào)控和超氧化介導細胞毒性中發(fā)揮重要作用。且高濃度的NO是化合物對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性的必備條件。Melissa等人發(fā)現(xiàn)，NO可通過影響細胞線粒體膜的通透性以及調(diào)控細胞色素C氧化酶產(chǎn)生毒性作用[7]。

而在已知的多種NO供體中，呋咱氮氧化物由于具有釋放NO更持久、更好的穩(wěn)定性、且不產(chǎn)生耐受的優(yōu)越性，在抗腫瘤新藥的研發(fā)中越來越受到重視[8]。目前，普遍認為其在巰基共同作用下釋放出NO從而發(fā)揮生物活性，而硝酸酯NO釋放則需要在酶激活下才能產(chǎn)生[9]。因此，實驗設計將薯蕷皂苷元與呋咱氮氧化合物進行拼接，期望合成出具有高活性的新型抗腫瘤化合物。

1 合成路線

方法[10]，采用不同取代基的烯醛為原料環(huán)合，并經(jīng)瓊斯試劑氧化得到呋咱氮氧化合物NO供體片段。將Dio母核上的3位羥基酯化，引入鹵代酯片段，最后將Dio鹵代酯與呋咱氮氧化合物進行拼合得到目標化合物。見圖1。

圖1 呋咱氮氧化薯蕷皂苷元拼合物的合成路線Fig.1 Synthesis route of diosgenin complex

1 方法與結(jié)果

1.1 儀器與試劑

超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀，Bruker AVANCE AV 400（美國Bruker公司）；X-4數(shù)字顯示顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司）；DF-1型集熱式磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；L535R臺式冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（江蘇蘇凈安泰公司）；MCO-20AIC型培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；光學倒置顯微鏡（重慶市奧利巴斯公司）；Multiskan FC酶標儀（美國Themo公司）。

薯蕷皂苷元（純度98%，南通飛宇生物科技有限公司）；反式-2-戊烯醛、反式-2-己烯醛（純度99%，賽默飛世爾科技有限公司）；MTT（噻唑藍，sigma M2128，sigma公司）；順鉑（注射用，齊魯制藥有限公司）；其余試劑、溶劑均為分析純。

人-肝癌細胞HepG-2、人 -結(jié)腸癌細胞HT-29、人-乳腺癌細胞MCF-7（中科院上海細胞庫）。

2.2 制備方法

2.2.12 -[（3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]乙酸薯蕷皂苷元酯的合成

2.2.1.1 3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-甲醛（b1）的合成 在氮氣保護下，50mL二頸瓶中加入1mL（10.2mmol） 反式 -2- 戊烯醛、2mL（35.5mmol）HAC，且在冰浴下攪拌5min后緩慢滴加2g（29.5mmol）NaNO2的飽和水溶液，0.5h內(nèi)滴完。滴加過程中保持冰浴，持續(xù)充氮氣反應3h。反應結(jié)束后，加入15mL飽和食鹽水，用乙醚（20mL×3）萃取，合并有機層。減壓濃縮后得淡黃液體1.28g，產(chǎn)率88.37%。

2.2.1.2 3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-甲酸（c1）的合成 將 1g（7.0mmol）化合物（A）用 20mL丙酮溶解于50mL二頸瓶中，冰浴攪拌下滴加新配制的Jones試劑（0.7g的CrO3溶于0.6mL濃H2SO4中，加H2O1.9mL稀釋即得）。滴加完畢后，升至室溫反應，TCL監(jiān)控反應，反應4h。反應結(jié)束后，加入15mL甲醇淬滅反應，繼續(xù)攪拌5min。減壓蒸干溶劑后，殘留物中加入20mL飽和食鹽水，用乙醚（20mL×3）萃取，合并有機層。有機層用20mL水洗滌后，無水MgSO4干燥過夜。過濾有機層，減壓蒸干溶劑，得黃色液體0.95g，產(chǎn)率：85.89%。

2.2.1.3 3-O-溴乙酰-薯蕷皂苷元酯（e1）的合成稱取2g（4.8mmol）薯蕷皂苷元置于250mL三頸瓶

中，加入50mL二氯甲烷使其溶解，加入0.04g（0.3mmol）DMAP作催化劑，冰浴攪拌下滴加1mL（11.5mmol）溴乙酰溴。滴加完后，繼續(xù)冰浴攪拌30min，升至室溫下反應，TLC監(jiān)控反應，反應3h。反應結(jié)束后，加入飽和NaHCO3水溶液調(diào)pH至中性，二氯甲烷（20mL×3）萃取，合并有機層，有機層用20mL洗滌后，加入無水MgSO4干燥過夜。過濾有機層，減壓蒸干溶劑，200-300目硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯（50∶1，V/V）洗脫得到白色固體 0.95 g，收率35.91%，m.p.196～198℃。

2.2.1.42 -[（3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]乙酸薯蕷皂苷元酯（f1）的合成 稱取0.9g（1.5mmol）化合物（C）和 1g（6mmol）化合物（B）置于50mL二頸瓶中，用20mL DMF溶解，加入0.1g（0.72mmol）無水碳酸鉀為催化劑，100℃回流攪拌反應3h，TLC監(jiān)控反應（石油醚：乙酸乙酯=50∶1，V/V）。反應結(jié)束后，待反應液冷卻至室溫，反應液中加入30mL蒸餾水，乙醚（20mL×4）萃取，合并有機層。有機層用20mL蒸餾水洗滌后，無水硫酸鎂干燥過夜。過濾有機層，減壓蒸干溶劑，200-300目硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯（50∶1，V/V）洗脫。得到白色固體0.41g，收率43.52%，m.p.155-156℃。

2.2.22 -[（3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]-丙酸薯蕷皂苷元酯（f2）、2-[（3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]-異丁酸薯蕷皂苷元酯（f3）、2-[（3-丙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]-乙酸薯蕷皂苷元酯（f4）、2-[（3-丙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]-丙酸薯蕷皂苷元酯（f5）、2-[（3-丙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]丙酸薯蕷皂苷元酯（f6）均參照化合物f1的制備方法進行合成，其氫譜及碳譜解析見表1、2。

表1 薯蕷皂苷員呋咱氮氧拼合物氫譜數(shù)據(jù)Tab.1 1H NMR data of of diosgenin complex

表2 目標化合物13C NMR數(shù)據(jù)Tab.2 13C NMR data of of diosgenin complex

2.3 MTT法測定目標化合物的體外抗腫瘤活性

分別取生長期的人肝癌細胞HepG-2、人結(jié)腸癌細胞HT-29、人乳腺癌細胞MCF-7于96孔細胞板培養(yǎng)12h后進行試驗。實驗分別設立藥物組、溶劑組、空白組以及陽性對照組（順鉑），其中藥物組中每藥設立 7個不同濃度組，分別為 60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375μmol·L-1。藥物作用 48h 后，在培養(yǎng)板中加入0.5%MTT溶液，每孔10μL，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。除去上層液，并加入150μL二甲基亞砜溶解藍紫色結(jié)晶。常溫下置微型振蕩器振搖10min，酶標儀檢測器在570nm波長處測定各孔吸光值，即OD值。由以下公式計算出目標化合物對三種癌細胞的增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=[1-（給藥組平均OD值-空白組平均OD值）/（溶劑組平均OD值-空白組平均OD值）]×100%，并根據(jù)各濃度組的抑制率，求出各組作用48h后的IC50值。實驗結(jié)果表示，采用GraphPad Prisim 4.0軟件處理結(jié)果。并采用單因素方差檢驗進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果見表3：可見，實驗組與陰性組比較，并無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組化合物作用于人HepG-2、MCF-7、HT-29細胞的IC50值Tab.3 Each group of compounds acted on the IC50values of human HepG-2,MCF-7 and HT-29 cells

體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果表明，目標產(chǎn)物對人肝癌細胞HepG-2、人結(jié)腸癌細胞HT-29、人乳腺癌細胞MCF-7 3種細胞的增殖抑制不明顯，推測目標產(chǎn)物具有持續(xù)釋放低濃度NO特性，而持續(xù)低濃度的NO可抑制細胞凋亡，對細胞具有保護和促進生長的作用；該化合物體外NO釋放規(guī)律值得進一步研究。

2.4 討論

烯醛環(huán)合的反應中，采用乙酸作溶劑，反應進行比較徹底，副產(chǎn)物較少，但使用的兩種烯醛原料在空氣中易氧化，因此，操作需在氮氣保護下進行。3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-甲醛及3-丙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-甲醛結(jié)構(gòu)中有雙鍵及醛基，可采用多種催化劑，如活性MnO2、醋酸銅－醋酸錳等[11]，而本實驗中則嘗試著使用了瓊斯試劑，結(jié)果顯示，該方法可行的，且具有反應時間短、產(chǎn)率較高的特點。在將呋咱氮氧化物與薯蕷皂苷元母體相連的反應中，2－溴丙酰溴和2-溴異丁酰溴由于支鏈較多，產(chǎn)生較大的空間阻礙，導致目標產(chǎn)物的產(chǎn)率較低。

而從MTT實驗結(jié)果可知，目標產(chǎn)物對3種人源腫瘤細胞體外抑制活性不強，所有濃度組的抑制率均低于順鉑組，推測化合物NO釋放呈低濃度釋放，而低濃度NO釋放表現(xiàn)為抑制細胞凋亡。

3 結(jié)論

本實驗設計的合成路徑簡單可行，成功合成了6個新的呋咱氮氧化薯蕷皂苷元拼合物，可為NO供體薯蕷皂苷元的設計提供新思路。而體外抗腫瘤活性篩選亦表明，化合物NO釋放量或呈低濃度釋放，可為薯蕷皂苷元類抗腫瘤新藥的深入研究奠定基礎。

參考文獻

［1］ 許麗娜,魏永麗,彭金詠.天然產(chǎn)物薯蕷皂苷的研究進展［J］.中國中藥雜志,2015,40（1）：36-41.

［2］ Raju J,Patlolla J.M.R.,Swamy M.V,et al.Diosgenin,a steroid saponin of trigonella foenum graecum（fenugreek），inhibits azoxymethaneinduced aberrant crypt foci formation in F344 rats and induces apoptosis in HT-29 human colon cancer cells［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2004,13（8）：1392-1398.

［3］ He Z,Tian Y,Zhang X,et al.Antitumour and immunomodulating activities of diosgenin,a naturally occurring steroidal saponin［J］.Nat Prod Res,2012,26（23）：2243-2246.

［4］ 蘇贊妍,霍木蘭.薯蕷皂甙元誘導人卵巢癌細胞系HO-8910凋亡及對 Survivin基因表達的影響［J］.中國醫(yī)師雜志,2006,8（9）：1161-1163.

［5］ 洪振強,林建華.薯蕷皂苷元對U-2OS細胞MMP-9/TIMP-1mRNA的影響［J］.福建中醫(yī)學院學報,2006,16（3）：21-24.

［6］ 宋寧,何忠梅,李晶華,等.薯蕷皂苷元對人胃低分化粘液腺癌細胞作用的研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報,2005,28（4）：42-44.

［7］ Melissa M.Reynolds,Scott D.Witzeling,Vinod B.Damodaran,et al.Applications for nitric oxide in halting proliferation of tumor cells.Biochemical and Biophysical Research Communictions.2013,431：647-651.

［8］ 李澤民,李文赟,凌靜,等.氧化呋咱類一氧化氮供體藥物研究進展［J］.中國抗生素雜志，2016,41（11）：801-809.

［9］ Yasinalli Tamboli,Loretta Lazzarato,Elisabetta Marini,et al.Synthesis and preliminary biological profile of new NO-donor tolbutamide analogues［J］.Bioorganicamp;Medicinal Chemistry Letters，2012,22：3810-3815.

［10］ Roberata Fruttero,Bruno Ferrarotti,Anna Serafino,et al.Unsymmetrically substituted furoxans.Part 11［J］.Methylfuroxancar baldehydes，Cheminform,1990,21（11）：1345-1347.

［11］ 蔣振武，唐萬果.巴豆醛氧化制備巴豆酸［J］.廣西輕工業(yè)，2005，（6）：28-31.

Study on the synthesis and antitumor activity of diosgenin complex

XIAO Min-jie1a,LIU Yong-qian2,LIANG Jia-rong3,QIU Xiang3,LEI Qiao-liang1b,ZHAO Zhong-heng3,WANG Tao3,*
（1.a.Faculty of pharmaceutical sciences ；b.The Second of Obstrics Departmen，F(xiàn)oshan Women and Children Hospital，F(xiàn)oshan 528000,China；2.Faculty of pharmaceutical sciences of Guangdong Provincial Maternal and Child Health Hospital,Guangzhou 510010，China；3.School of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006，China）

To synthesize a novel diosgenin derivative of nitric oxide and to investigate its antitumor activity in vitro.Methods:Diosgenin was designed to combine with nitric oxide donor of nitric oxide through the cycloaddition,condensation and oxidation reactions,to obtain the target compound.The cytotoxicity on cells of HT-29,HepG-2 and MCF-7,was evaluated by MTT.Results:The 6 new combinations of diosgenin were synthesized,and their structures were confirmed by IR,1H NMR and13C NMR.At the same time,MTT experiments showed that the target compounds were not obviously cytotoxic to HT-29,HepG2,MCF-7 cells.Conclusion:The synthetic route of the experiment is feasible,but there is no obvious anti-tumor activity of the new compound.It is speculated that the release of NO is low concentration,while the low concentration of NO release inhibits apoptosis.

diosgenin combination；Synthesis；NO donor；antitumor activity

R914

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171171

2017-09-15

肖敏捷（1990-），女，藥師，2016年畢業(yè)于廣州中醫(yī)藥大學藥物化學專業(yè)，碩士研究生，佛山市婦幼保健院藥劑科，研究方向：天然化合物的結(jié)構(gòu)修飾及活性研究；醫(yī)院藥事管理。

王 濤（1970-），女，教授，廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，研究方向：天然化合物的結(jié)構(gòu)修飾及活性研究。