葡萄籽總酚的提取及其抗氧化活性評(píng)價(jià)*

咸玥桐,高 原,王 越,趙瑩瑩,王 曦,李 凡，張曉萌

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150076）

葡萄籽總酚的提取及其抗氧化活性評(píng)價(jià)*

咸玥桐,高 原,王 越,趙瑩瑩,王 曦,李 凡，張曉萌

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150076）

本文通過(guò)比較幾種不同提取方法對(duì)葡萄籽總酚進(jìn)行了提取，進(jìn)一步對(duì)葡萄籽總酚的含量進(jìn)行了測(cè)定，并通過(guò)DPPH自由基清除率的測(cè)定、FRAP總抗氧化能力評(píng)價(jià)了幾種提取方法葡萄籽總酚的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波輔助提取法葡萄籽總酚提取物提取率最高，達(dá)到52.68%，總酚含量為57.40mg GAE·g-1。抗氧化實(shí)驗(yàn)表明超聲波輔助提取法葡萄籽總酚的DPPH清除率較高，IC50值為0.13倍葡萄籽總酚提取液，F(xiàn)RAP總抗氧化能力在總酚原液條件下達(dá)到175.84μm FeSO4。本研究為葡萄籽資源的開(kāi)發(fā)和綜合利用提供了基礎(chǔ)。

葡萄籽，總酚；DPPH；FRAP；抗氧化

葡萄籽是葡萄加工產(chǎn)業(yè)中的副產(chǎn)物之一，它不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還有很高的保健價(jià)值。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽的功效主要包括：清除自由基、抗衰老、增強(qiáng)自身免疫力、美容護(hù)膚、抗過(guò)敏、保護(hù)心血管、防輻射、保護(hù)消化系統(tǒng)等功能。綜合高效的利用葡萄籽，可變廢為寶，保護(hù)環(huán)境，節(jié)約資源，又能創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益[1-3]。

本文通過(guò)比較幾種不同提取方法對(duì)葡萄籽總酚進(jìn)行了提取，進(jìn)一步對(duì)葡萄籽總酚的含量進(jìn)行了測(cè)定，并通過(guò)DPPH自由基清除率的測(cè)定、FRAP總抗氧化能力評(píng)價(jià)了幾種提取方法葡萄籽總酚的抗氧化能力。為葡萄籽多酚類(lèi)物質(zhì)在食品、醫(yī)藥、美容等多方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

葡萄籽（購(gòu)自哈爾濱家樂(lè)福超市）；福林-酚試劑（上海源葉生物科技公司）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；TPTZ（上海新寶精細(xì)化工廠）；DPPH（Sigma）；FeCl3（上海新寶精細(xì)化工廠）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA223S-CW分析天平（上海精天電子儀器公司）；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）；KQ3200DV數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；HH-ZK二孔多能水浴鍋（鄭州英峪予乎華儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；T6新世紀(jì)型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.3.1 葡萄籽中總酚的提取方法考察 將葡萄籽經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80目篩之后，準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后的葡萄籽樣品。用適量的石油醚浸泡30min，過(guò)濾后，將濾渣攤開(kāi)以利于石油醚的揮發(fā)。分別通過(guò)乙醇浸提法、熱回流提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取等方法對(duì)葡萄籽中的總酚進(jìn)行提取。提取完畢后料液經(jīng)抽濾后，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得葡萄籽粗提物。將粗提物用乙醇溶解，備用[4,5]。每種方法均取10g葡萄籽粉末于三角瓶中，料液比為1∶20、浸提時(shí)間2h、超聲功率150W、溫度50℃、超聲及微波時(shí)間30min。

1.3.2 葡萄籽提取物總酚含量的測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品50mg，放置在100mL容量瓶中，加適量蒸餾水，超聲溶解，放冷，定容。分別配制濃度為50,100,150,200,250,300,350,400,450,500mg·L-1的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別取各標(biāo)準(zhǔn)溶液40μL置于離心管中，加入10倍稀釋的福林-酚試劑1.8mL，室溫放置5min，加入1.2mL 7.5%的碳酸鈉溶液，作用90min，765nm檢測(cè)OD值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取樣品溶液40μL置于離心管中，加入10倍稀釋的福林-酚試劑1.8mL，室溫放置5min，加入1.2mL 7.5%的碳酸鈉溶液，作用90min，765nm測(cè)OD值檢測(cè)?？偡雍勘硎緸閙g（GAE）·g-1[6,7]。

1.3.3 葡萄籽總酚 DPPH自由基清除率的測(cè)定分別將4種不同提取方法獲得的葡萄籽總酚提取物浸膏定容至10mL乙醇溶解，并對(duì)樣品溶液進(jìn)行二倍稀釋?zhuān)謩e取不同稀釋倍數(shù)的各樣品溶液（1.00，0.50，0.25，0.13，0.063,0.031）100μL，置 4mL離心管中，加入1.4mL無(wú)水乙醇，1.0mL的DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)70min，同時(shí)用無(wú)水乙醇做空白，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值；以1.5mL無(wú)水乙醇加1mL DPPH為對(duì)照。按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率。用無(wú)水乙醇做空白對(duì)照[8,9]。見(jiàn)式（1）

式中 Ac：1.5mL無(wú)水乙醇 +1mLDPPH；A0：100μL樣品+1.4mL無(wú)水乙醇+1mL DPPH。

1.3.4 葡萄籽總酚FRAP總抗氧化能力實(shí)驗(yàn) 依次配 制 1000、800、600、400、200、100μmol·L-1FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.3mL FeSO4與2.7mL FRAP工作液充分混合，37℃保溫30min，于593nm下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸分方程式：y=0.0023x+0.191（R2=0.9996）。以 1μmol·L-1FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的微摩爾數(shù)表示。

分別取不同稀釋倍數(shù)的各葡萄籽總酚溶液（1.00，0.50，0.25，0.13，0.063,0.031）300μL 與 2.7m LFRAP工作液混合，在37℃恒溫水浴鍋中保溫30min，593nm測(cè)吸光度。將300μL無(wú)水乙醇和2.7mL FRAP工作液混合液作對(duì)照?？瞻资菬o(wú)水乙醇。根據(jù)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得方程，以1μmol·L-1FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4微摩爾數(shù)表示[10]。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及方法。 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用ANOVA方差分析并行方差齊性檢驗(yàn)；結(jié)果以X±S表示

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄籽中總酚的提取方法考察

對(duì)乙醇浸提法、熱回流提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取等方法對(duì)葡萄籽中的總酚進(jìn)行提取，提取率計(jì)算公式如下：

式中 m：葡萄籽粗粉質(zhì)量，g；n：濾液中浸膏的質(zhì)量，mg。

比較幾種提取葡萄籽總酚的方法，超聲輔助提取的方法葡萄籽中總酚的提取率較高，提取效果較好，達(dá)到52.68%，見(jiàn)圖1。

2.2 葡萄籽總酚的含量測(cè)定

以765nm吸光度為縱坐標(biāo)、沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=0.0022x+0.0729（R2=0.9991），結(jié)果表明，在50～500mg·L-1范圍內(nèi)沒(méi)食子酸對(duì)照品的濃度與吸光度成良好的線性關(guān)系。根據(jù)回歸方程，對(duì)四種提取方法的總酚含量進(jìn)行測(cè)定，總酚含量表示為mg（GAE）·g-1，見(jiàn)式（3）

經(jīng)計(jì)算可知，超聲波輔助提取葡萄籽中總酚含量最高，代入數(shù)據(jù)得到葡萄籽提取物中總酚含量為57.40mg·g-1，見(jiàn)圖 1。

圖1 不同提取方法葡萄籽多酚提取率及含量比較Fig.1 Grape seed polyphenols extraction yield and content by different methods

2.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，常用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的體外抗氧化能力。其能力用清除率來(lái)表示，清除率越大，其抗氧化能力越強(qiáng)[10]。4種不同提取方法所獲得的葡萄籽總酚提取液的IC50值分別為0.19、0.16、0.13和0.15倍原液濃度，即當(dāng)乙醇浸提法、熱回流提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取獲得的總酚溶液分別稀釋至 0.19、0.16、0.13和 0.15倍時(shí)，DPPH 清除率達(dá)到50%（見(jiàn)圖2）。葡萄籽總酚提取物具有較好的清除自由基能力，且超聲波輔助提取法葡萄籽總酚溶液的清除自由基能力最強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照維生素C的DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)其IC50值為0.756μg·mL-1。

圖2 DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)Fig.2 DPPH radical scavenging assay

由圖2可以看出，幾種提取方法下的葡萄籽多酚稀釋液對(duì)DPPH自由基的清除作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，表明葡萄籽多酚清除自由基的能力越強(qiáng)，抗氧化的能力也越強(qiáng)。

2.4 FRAP總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)

在FRAP鐵還原能力實(shí)驗(yàn)中，抗氧化劑通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基。樣品中的抗氧化劑可使鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）的 Fe3+被還原成Fe2+，與 FeCl3生成普魯士蘭（Fe4[Fe（CN）6]3），在700nm處有最大吸光度，因此，可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明其清除自由基能力的大小，還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。

通過(guò)繪制硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸分方程式：y=0.0023x+0.191（R2=0.9996）。根據(jù)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得方程，以1μmol·L-1FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4微摩爾數(shù)表示。把數(shù)據(jù)帶入回歸方程，計(jì)算得出4種不同提取方法，即乙醇浸提法、熱回流提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取獲得的葡萄籽總酚提取液的FRAP值，分別為 136.29、145.32、175.84 和 157.48μm

FeSO4，陽(yáng)性對(duì)照生育酚 （Trolox） 的 IC50值為0.96μg·mL-1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波輔助提取法獲得的葡萄籽總酚提取液的FRAP值較大，具有較好的抗氧化能力，且隨著樣品濃度的增加，F(xiàn)RAP值也隨之增加，表明濃度越高抗氧化能力越強(qiáng)（見(jiàn)圖3）。

圖3 總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)Fig.3 Ferric ion total antioxidant power assay

3 結(jié)論

本文通過(guò)乙醇浸提法、熱回流提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法比較幾種不同提取方法對(duì)葡萄籽總酚的溶出及抗氧化能力。進(jìn)一步對(duì)不同提取方法下葡萄籽提取液的總酚含量進(jìn)行了測(cè)定，并通過(guò)DPPH自由基清除率的測(cè)定、FRAP總抗氧化能力評(píng)價(jià)了幾種提取方法葡萄籽總酚的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波輔助提取法葡萄籽總酚提取物提取率最高，達(dá)到52.68%，總酚含量為57.40mg GAE·g-1。抗氧化實(shí)驗(yàn)表明超聲波輔助提取法葡萄籽總酚的DPPH清除率較高，IC50值為0.13倍葡萄籽原液濃度，F(xiàn)RAP總抗氧化能力在總酚原液條件下達(dá)到 175.84μm FeSO4。

超聲波輔助提取法作為一種常用的有效提取方式，能夠利用超聲波的機(jī)械破碎和空化效應(yīng)，加速有效成分的擴(kuò)散和溶解，時(shí)間短、效率高，較其他提取方法有著明顯的優(yōu)勢(shì)。該方法在葡萄籽多酚的提取以及葡萄籽資源的綜合開(kāi)發(fā)和利用有著廣闊的前景，本研究也為葡萄籽多酚類(lèi)成分抗氧化活性及機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Total phenolic extract of grape seed and antioxidant activity evaluation*

XIAN Yue-tong,GAO Yuan,WANG Yue,ZHAO Ying-ying,WANG Xi,LI Fan,ZHANG Xiao-meng
（College of Pharmacy,Cell and Molecular Biology Research Institute,Harbin Commercial Vniversity,Harbin 150076，China）

In this paper,the total phenol extract of grape seed were extracted by different methods,and the total phenol content was determined.The antioxidant capacity of grape seed total phenol extract was evaluated by DPPH free radical scavenging and FRAP total antioxidant capacity tests.The results showed that ultrasonic assisted extraction method has the highest yield reached 52.68%,the total phenol content was 57.40 GAE mg·g-1.Antioxidant tests showed that ultrasonic assisted extraction of grape seed total phenol DPPH scavenging rate is highest,the IC50value was 0.13 times concentration of grape seed total phenol extract.FRAP total antioxidant capacity value was 175.84μm FeSO4.This study provides the basis on the development and comprehensive utilization of grape seed resources.

grape seed;total phenols；DPPH；FRAP；antioxidant activity

TS262

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171167

2017-09-26

哈爾濱市科技局青年后備人才項(xiàng)目（2016RQQXJ115）；哈爾濱商業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃國(guó)家級(jí)項(xiàng)目（201610240004）資助

高 原（1983-），女，講師，博士，主要從事藥用植物、微生物次生代謝產(chǎn)物活性研究。