固相萃取-液相質(zhì)譜聯(lián)用測定大豆中異黃酮類化合物的方法研究

姜川 范蕾 張夏翊 鄒小龍 陳夢 汪昕

大豆異黃酮是一種植物化學(xué)素，屬植物黃酮類，主要來源于豆科植物的莢豆類，在大豆中含量較高。研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮具有抑制腫瘤生長、降低心血管疾病、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松以及緩解婦女更年期綜合癥等多種生理保健作用。

大豆中天然存在的大豆異黃酮共有12種，可以分為3類，即黃豆苷類、染料木苷類、黃豆黃素苷類，每類都以游離型、葡萄糖苷型、乙?；咸烟擒招?、丙二?；咸烟擒招瓦@4種形式存在。目前，如何簡單準(zhǔn)確地測試大豆中異黃酮的含量仍是檢測領(lǐng)域一個有待探索的問題，國內(nèi)外使用較多的測定方法包括高效液相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等。無論何種測定方法，準(zhǔn)確的前處理都是得到可靠結(jié)果的關(guān)鍵步驟，因此本研究分別采用直接提取法和SPE 1000全自動固相萃取系統(tǒng)對大豆進(jìn)行前處理，處理液則同時使用液相-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備進(jìn)行測定，對大豆苷、染料木苷、黃豆苷、大豆素、染料木素、黃豆素6種元素進(jìn)行回收率的測定對比。

一、材料與方法

1.試劑。正己烷（色譜純，F(xiàn)ischer公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)ischer公司）；乙酸乙酯（色譜純，F(xiàn)ischer公司）；大豆異黃酮對照品溶液（Anpel公司，純度96.5%）。

2.實(shí)驗(yàn)材料。大豆（市場購得）。

3.實(shí)驗(yàn)儀器。SPE 1000，全自動固相萃取系統(tǒng)，LabTech公司；Flex-MVP，全自動真空濃縮儀，LabTech公司；SCIEX Exion LC?液相系統(tǒng)+Triple Quad? 4500質(zhì)譜，液質(zhì)聯(lián)用儀，SCIEX公司。

4.試驗(yàn)方法。（1）直接提取法。精確稱取5g大豆樣品，加入90%甲醇水溶液90mL，60℃超聲提取30min，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液。在殘?jiān)性偌尤?0%甲醇水溶液60mL，重復(fù)上述提取、離心操作。合并兩次提取液，真空濃縮至40mL，再用10%甲醇水溶液定容至50mL。取0.5mL提取濃縮液，定容至1mL，過0.22μm微孔濾膜，供測。

（2）直提+固相萃取法。精確稱取5g大豆樣品，加入90mL正己烷，60℃超聲提取30min，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液。在殘?jiān)性偌尤?0mL正己烷，重復(fù)上述提取、離心操作。合并兩次提取液，真空濃縮至40mL，再用正己烷定容至50mL。取5mL濃縮液，通過已經(jīng)活化過的硅膠固相萃取柱（5mL甲醇、5mL正己烷活化小柱，流速1mL/min），再用10%乙酸乙酯正己烷溶液5mL淋洗小柱，淋洗液不收集。用6mL甲醇洗脫，收集洗脫液。用10%甲醇水溶液定容至10mL，取1mL，過0.22μm微孔濾膜，供測。

5.實(shí)驗(yàn)部分。量取0.5g均質(zhì)后的大豆樣品置于50mL離心管中，加入10mL甲醇溶液（甲醇：水=9：1），60℃超聲提取30min，4000r/min離心5min，將上清液放入150mL濃縮瓶中。在殘?jiān)屑尤?mL甲醇溶液（甲醇：水=9：1），60℃超聲提取30min，4000r/min離心5min，將上清液也轉(zhuǎn)入150mL濃縮瓶中。真空度100mbar，水浴40℃濃縮至近干，分別加入90%甲醇溶液（甲醇：水=9：1）、50%甲醇溶液（甲醇：水=5：5）復(fù)溶，定容至10mL，取1mL過膜，作為直提樣品上樣。同樣處理復(fù)溶后，分別用C18、HLB、C18-U（500mg/3mL）固相萃取柱進(jìn)行固相萃取，收集過柱后溶液，并用10mL甲醇洗脫固相萃取柱，分別取1mL過膜后上樣。

量取0.5g均質(zhì)后的大豆樣品置于50mL離心管中，分別加入90%甲醇溶液（甲醇：水=9：1）10mL、50%甲醇溶液（甲醇：水=5：5），60℃超聲提取30min，4000r/min離心5min，將上清液放入15mL離心管中。在殘?jiān)屑尤?mL對應(yīng)濃度的甲醇溶液，60℃超聲提取30min，4000r/min離心5min，再將上清液也轉(zhuǎn)入15mL離心管中。用HLB（500mg/3mL）固相萃取柱進(jìn)行固相萃取，收集過柱后溶液，并用10mL甲醇洗脫固相萃取柱，分別取1mL過膜后上樣。

二、分析條件

1.液相方法條件。色譜柱：不銹鋼柱，內(nèi)徑4.6mm、長250mm的C18柱，填料粒徑10μm。流動相A：1‰甲酸水，流動相B：乙腈。進(jìn)樣量：10.0μL。流量：1mL/min。柱溫：30℃。洗脫程序設(shè)置如表1所示。

2.質(zhì)譜方法。離子源溫度：550℃；IS電壓：5500V；流速：0.25mL/min；離子源：ESI，正離子模式。異黃酮類質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

三、結(jié)果與討論

1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（1）大豆苷直接提取法和固相萃取法的色譜圖對比，如圖1所示。

（2）大豆素直接提取法和固相萃取法的色譜圖對比，如圖2所示。

（3）黃豆苷直接提取法和固相萃取法的色譜圖對比，如圖3所示。

（4）黃豆素直接提取法和固相萃取法的色譜圖對比，如圖4所示。

（5）染料木苷直接提取法和固相萃取法的色譜圖對比，如圖5所示。

（6）染料木素直接提取法和固相萃取法的色譜圖對比，如圖6所示。

（7）固相萃取法和直接提取法的回收率對比，如表3所示。

2.結(jié)論與討論。實(shí)驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)，大豆苷、染料木苷、黃豆苷、黃豆素、大豆素、染料木素在經(jīng)過直接提取法處理后，使用質(zhì)譜測試的回收率分別為29.4%、27.0%、32.1%、34.1%、83.3%、90.8%。由此可見，除了大豆素和染料木素，其他幾種物質(zhì)在前處理過程中已經(jīng)有很大的損失，這給準(zhǔn)確定量帶來了巨大的困難。反之，使用固相萃取法提取的大豆苷、染料木苷、黃豆苷、黃豆素、大豆素、染料木素的回收率分別為100.8%、105.6%、104.8%、102.1%、98.9%、100.3%。由此可見，使用固相萃取法對待測物質(zhì)進(jìn)行收集和洗脫后，再使用質(zhì)譜測試，能夠得到非常好的回收率。

基金項(xiàng)目：浙江省市場監(jiān)督管理局檢驗(yàn)檢測技術(shù)裝備項(xiàng)目“高鹽稀態(tài)醬油殘?jiān)写蠖巩慄S酮提取與檢測技術(shù)的研究與開發(fā)”（ZB2022475）。

作者簡介：姜川（1979-），男，漢族，黑龍江哈爾濱人，副教授，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)、分析測試。