CD47 蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的相關(guān)性研究

張獻(xiàn)方，孟凡亮

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 巢湖 238000）

肺癌（lung cancer）是目前全世界發(fā)病率及死亡率最高的癌癥類型之一，嚴(yán)重影響人類的健康與生命，臨床上肺癌以非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer）為主，占據(jù)總數(shù)的85%左右[1]。對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)的非小細(xì)胞肺癌，手術(shù)切除是其首選的治療方法[2]，但部分患者在手術(shù)后仍然會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，影響患者生存時(shí)間。因此，為了配合肺癌患者術(shù)后的臨床治療及評(píng)估患者預(yù)后，尋找合適的復(fù)發(fā)預(yù)后標(biāo)志物至關(guān)重要。白細(xì)胞分化抗原47（cluster of differentiation，CD47）是一種50 kDa 的免疫球蛋白超家族成員，可與信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）、血小板反應(yīng)蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）等配體結(jié)合[3]，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞凋亡、增殖、遷移[4]。病理情況下，一些腫瘤細(xì)胞上調(diào)CD47 的表達(dá)，以增強(qiáng)CD47-SIRPα信號(hào)軸抑制機(jī)體的巨噬細(xì)胞的吞噬作用，從而逃避免疫系統(tǒng)的清理[5]。研究表明[6-8]，在不同類型的惡性腫瘤如乳腺癌、胃癌、急性淋巴細(xì)胞白血病等癌組織中都發(fā)現(xiàn)CD47 處于高表達(dá)狀態(tài)。然而，關(guān)于CD47表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的臨床結(jié)局的潛在關(guān)系數(shù)據(jù)仍然有限。因此，本研究檢測(cè)了CD47 蛋白表達(dá)情況，分析其與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，以期為NSCLC 的抗CD47 免疫治療提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015 年1 月1 日-2019 年10 月1 日于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院心胸外科行肺癌手術(shù)切除且術(shù)后病理科確診為非小細(xì)胞肺癌的患者癌組織標(biāo)本50 例及癌旁組織標(biāo)本20 例（癌旁組織距癌組織大于3 cm）。50 例非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)如下：年齡＜60 歲20 例，≥60 歲30 例；男26 例、女24 例；吸煙23 例，不吸煙27 例；臨床分期[參照2017 年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的第八版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)]：Ⅰ期18 例，Ⅱ期13 例，Ⅲ期19 例；鱗癌13 例，腺癌37 例；高分化21 例，中分化15 例，低分化14 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26 例。本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①經(jīng)病理學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌患者；②所有患者確診前均沒有接受過任何抗腫瘤治療（包括放療、化療、手術(shù)及靶向治療等）；③石蠟包埋病例肺癌組織標(biāo)本保存完好；④有完整的臨床病例資料患者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并其他腫瘤患者；②合并嚴(yán)重的功能性或器質(zhì)性疾病，如泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等疾病。

1.3 隨訪 隨診方式采用門診隨診、住院復(fù)查及電話隨診，主要隨訪指標(biāo)為無進(jìn)展生存期（progressionfree survival，PFS），即從自確診之日至發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展（主要依據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)）或死亡時(shí)間，以月單位，隨訪至2022 年10 月1 日。

1.4 CD47 蛋白的檢測(cè)方法 采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CD47 蛋白在非小細(xì)胞肺癌樣本中的表達(dá)，具體方法：將包含有肺癌組織的石蠟塊制作成石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，采用pH 9.0 的EDTA 抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 緩沖液沖洗后甩去切片上多余水分，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，PBS 緩沖液沖洗后，滴加適量的抗CD47 抗體（抗體按1∶500 稀釋），使其能完全覆蓋肺癌組織，37 ℃孵育1 h，PBS 沖洗后加酶標(biāo)山羊抗兔IgG 聚合物，室溫下孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗后DAB顯色30 s～2 min，低倍鏡下觀察顯色適中后，自來水終止顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，烤片箱烘干切片，中性樹膠封片。

1.5 免疫組化結(jié)果判讀 基于染色強(qiáng)度和膜和（或）細(xì)胞質(zhì)染色評(píng)估腫瘤CD47 表達(dá)。染色評(píng)分為0：不存在或＜10% 的腫瘤細(xì)胞染色；1+：＞10%的腫瘤細(xì)胞較弱；2+：＞10%的腫瘤細(xì)胞中度染色；3+：＞10%的腫瘤細(xì)胞強(qiáng)染色。染色評(píng)分為0 或1+為CD47 陰性表達(dá)，2+或3+為CD47 陽性表達(dá)。由我院具有豐富免疫組化經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采取雙盲法判讀。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，并進(jìn)行Log-rank 檢驗(yàn)；采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析；使用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別CD47 與PD-L1之間的關(guān)聯(lián)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD47 蛋白在NSCLC 組織及癌旁組織中的表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，CD47 主要位于肺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，少量彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中。癌組織中CD47 陽性表達(dá)率為52.00%（26/50），CD47 陰性表達(dá)率為48.00%（24/50）。癌旁組織中CD47 陽性表達(dá)率為20.00%（4/20），CD47 陰性表達(dá)率為80.00%（16/20）。NSCLC 組織中CD47 的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.973，P=0.015），見圖1。

圖1 CD47 蛋白在NSCLC 組織及癌旁組織中的表達(dá)情況（×200）

2.2 CD47 蛋白表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系 CD47 蛋白在臨床分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者中高于臨床分期早、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而不同年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度間CD47 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 CD47 蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

2.3 CD47 蛋白、各臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系 采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行單因素分析，并用Log-rank進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD47 的陽性表達(dá)組較CD47 陰性表達(dá)組的無進(jìn)展生存期短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；此外，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況也與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后具有相關(guān)性（P＜0.05），即分期晚、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后PFS 越短；而患者年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度和非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后無相關(guān)性（P＞0.05）。多因素分析顯示，CD47 蛋白表達(dá)水平和臨床分期與PFS 具有相關(guān)性（P＜0.05），而年齡、性別、吸煙史、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度與PFS間無相關(guān)性（P＞0.05），見表2、圖2～圖4。

表2 CD47 蛋白、各臨床病理特征與NSCLC 患者預(yù)后的單因素及多因素分析

圖2 臨床分期與PFS 的關(guān)系

圖3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PFS 的關(guān)系

圖4 CD47 與PFS 的關(guān)系

2.4 CD47 和PD-L1 在NSCLC 患者中的表達(dá)及相關(guān)性 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中研究CD47 與PD-L1 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示CD47 和PD-L1 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)具有正相關(guān)性（P=5.3e-08，r=0.16），見圖5。

圖5 CD47 和PD-L1 在NSCLC 患者中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

肺癌是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌是其臨床上最常見的類型，傳統(tǒng)的治療方法有手術(shù)、放療、化療、靶向治療[9]。近年來，隨著對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制的不斷深入研究，免疫療法成為肺癌治療的新興領(lǐng)域。盡管肺癌的治療手段多樣化、個(gè)體化，較之前有明顯提升，但多數(shù)患者的臨床結(jié)局并不理想[10]。尋找非小細(xì)胞肺癌治療過程中腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及有效判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物具有重要意義。

CD47 作為重要的免疫檢查點(diǎn)，廣泛表達(dá)于正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜表面[11]。SIRPα 是CD47 主要的配體之一，在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞上均有表達(dá)，當(dāng)CD47 和SIRPα 結(jié)合形成CD47-SIRPα 信號(hào)復(fù)合體時(shí)，SIRPα 分子的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)中免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）發(fā)生磷酸化，從而傳導(dǎo)抑制性信號(hào)通路，使巨噬細(xì)胞的吞噬功能以及樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞作用受到抑制[12]。機(jī)體通過這種方式維持自身抗原的免疫耐受，使健康細(xì)胞避免被免疫細(xì)胞殺傷，而腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)CD47的表達(dá)，躲避巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞的識(shí)別，降低機(jī)體的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，出現(xiàn)“免疫逃逸”。多種類型的癌細(xì)胞都出現(xiàn)了CD47 蛋白的過度表達(dá)[4]，本研究結(jié)果顯示CD47 蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率高于非肺癌組織，說明在NSCLC 組織中也存在CD47 的高表達(dá)，這與既往研究結(jié)果一致[13]。至于CD47 蛋白在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

既往體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[14，15]，CD47 參與調(diào)節(jié)了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的過程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中CD47 蛋白陽性表達(dá)與年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度無關(guān)，而與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即臨床分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織CD47 陽性表達(dá)的概率越高，提示CD47 的過度表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)。此外，單因素以及多因素分析顯示，CD47 蛋白的過度表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良相關(guān)。且研究中發(fā)現(xiàn)，CD47 陽性表達(dá)組的平均和中位PFS 較CD47 陰性表達(dá)組縮短，多因素分析結(jié)果也證實(shí)了CD47 陽性是NSCLC 術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，這與以往的臨床實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論一致[13,16]，表明高CD47 表達(dá)可作為NSCLC 預(yù)后不良的生物標(biāo)志物，同時(shí)也意味著靶向阻斷CD47 將對(duì)NSCLC 患者有很大的治療潛力。

另有研究發(fā)現(xiàn)[17,18]，在靶向阻斷CD47-SIRPα 信號(hào)軸后能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲。目前針對(duì)某些惡性腫瘤的抗CD47 抗體藥物也進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，并且取得初步療效[19]。但鑒于CD47 表達(dá)的普遍性，抗CD47抗體體內(nèi)給藥可能出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，例如貧血[20]。構(gòu)建靶向CD47 與其他腫瘤抗原的雙特異性抗體，從而提高其對(duì)癌細(xì)胞的靶向性，是解決這一局限性的途徑之一?？筆D-1/PD-L1 免疫療法已經(jīng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)移NSCLC 的臨床治療，而PD-L1 表達(dá)是免疫療法的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。本研究中從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中研究CD47 與PD-L1 在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示CD47 和PD-L1 在非小細(xì)胞肺癌中呈正相關(guān)表達(dá)，說明當(dāng)CD47 在NSCLC 中出現(xiàn)過度的表達(dá)時(shí)，PD-L1 也出現(xiàn)了表達(dá)的上調(diào)，這為CD47 和PD-L1 雙靶向免疫治療提供了思路。Casey SC等[21]在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高水平的MYC 致癌轉(zhuǎn)錄因子致使CD47 和PD-L1 的表達(dá)增加，提示了CD47 和PD-L1 雙靶向免疫治療在理論上是可行的。因此，未來檢測(cè)CD47 和PD-L1 在NSCLC 患者中共表達(dá)狀態(tài)能為更精準(zhǔn)的聯(lián)合免疫療法提供依據(jù)，提高臨床癌癥患者的獲益率。

綜上所述，CD47 在NSCLC 組織中的表達(dá)高于癌旁組織，其高表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CD47 陽性表達(dá)是NSCLC 患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，CD47 蛋白有望成為預(yù)測(cè)NSCLC 患者預(yù)后的重要生物分子標(biāo)志物。另外，CD47 的表達(dá)與PD-L1 呈正相關(guān)，PD-L1/CD47 共表達(dá)可做為未來聯(lián)合免疫療法的標(biāo)志物。本研究尚存不足之處，比如樣本量較少、僅基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息分析CD47 和PD-L1 間的關(guān)聯(lián)等，需擴(kuò)大樣本量、使用免疫組化實(shí)驗(yàn)的方法更準(zhǔn)確的驗(yàn)證CD47 和PDL1 的相關(guān)性。