無齒E3泛素蛋白連接酶同源物在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系△

楊彥娥，任佳欣，程彩霞#

山西醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院，2第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 048000

食管癌（esophageal cancer，ESCA）是常見的惡性腫瘤之一，2020年全球癌癥統(tǒng)計結(jié)果顯示，全球ESCA 新發(fā)病例達(dá)60.4 萬，死亡病例達(dá)54.4萬[1]。中國是ESCA 的高發(fā)國家，占全球一半以上，且以食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主[2]。目前，多數(shù)ESCA患者確診時已是晚期，且其發(fā)生發(fā)展伴隨著復(fù)雜的分子機(jī)制，使得多數(shù)患者的治療效果不容樂觀，術(shù)后5年總生存率不足15%[3-4]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和靶向治療的發(fā)展，靶向免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的新療法為ESCA 患者帶來了希望。但由于ESCA 的分子分型仍不明確，缺乏特異性預(yù)后標(biāo)志物，故可應(yīng)用于臨床的靶向藥物極少。迄今為止，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）僅批準(zhǔn)了3 種針對ESCA 的靶向治療藥物[5]。雖然靶向藥物改善了治療效果，但其缺點仍然需要解決。例如，靶向治療不僅比傳統(tǒng)的放療和化療昂貴，且易引起耐藥反應(yīng)[6]。因此，挖掘新的ESCA 靶向治療分子標(biāo)志物，優(yōu)化ESCA 的治療仍是當(dāng)務(wù)之急，尤其為晚期患者的治療增加新的選擇。無齒E3 泛素蛋白連接酶同源物（denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog，DTL，又稱CDT2）包含多個WD40 重復(fù)結(jié)構(gòu)域，在調(diào)控DNA 復(fù)制和損傷中起著至關(guān)重要的作用[7]。此外，有學(xué)者報道，泛素特異性肽酶46（ubiquitin specific peptidase 46，USP46）蛋白可介導(dǎo)DTL 的穩(wěn)定性，促進(jìn)人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陽性腫瘤的生長，提示DTL 在腫瘤生長中具有潛在作用[8]。在ESCA 的研究中，Li 等[9]整合多個ESCA 數(shù)據(jù)集的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，DTL 在ESCA 中表達(dá)上調(diào)，但沒有進(jìn)一步實驗驗證且沒有對DTL 表達(dá)對ESCA 患者預(yù)后的影響進(jìn)行分析。故本研究通過分析在線數(shù)據(jù)庫和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色結(jié)果，探討DTL在ESCC 組織和正常食管組織中的差異表達(dá)及其對患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 資料收集

TIMER2 數(shù)據(jù)庫（http://timer.cistrome.org/）是一個可系統(tǒng)分析不同腫瘤類型中基因表達(dá)水平和免疫浸潤水平的數(shù)據(jù)庫[10]。從TIMER2 數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)用來分析ESCA 組織和正常食管組織中DTLmRNA 表達(dá)的差異。

1.2 研究對象

選取2013年1月至2016年9月在山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院接受手術(shù)治療的95 例ESCC 患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未接受過放化療；②臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并臟器功能異常；③失訪。95 例ESCC患者中，男性57 例，女性38 例；年齡＜60 歲45例，≥60 歲50 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期54 例，Ⅲ～Ⅳ期41 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.3 免疫組化方法及評價標(biāo)準(zhǔn)

按照標(biāo)準(zhǔn)免疫組化實驗步驟檢測DTL 蛋白表達(dá)情況。先將ESCC 組織和癌旁正常組織制備成3 mm 石蠟切片，并與稀釋濃度為1∶200 的兔多克隆抗體DTL 在37 ℃暖箱中孵育1 h。接著在37 ℃下與酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物二級抗體偶聯(lián)20 min，然后將每個切片用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑染色，最后用蘇木精復(fù)染。免疫組化結(jié)果由兩位高年資病理科醫(yī)師分別判定，當(dāng)存在異議時由第三位高年資醫(yī)師判讀，并由三者商議后決定最終結(jié)果。于40 倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5 個視野，每個視野至少計數(shù)100 個細(xì)胞。陽性細(xì)胞百分比評分：≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，＞75%為4 分。染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淡黃色顆粒為1 分，黃色顆粒為2 分，棕黃色顆粒為3 分。陽性細(xì)胞百分比評分與染色強(qiáng)度評分的乘積為最終結(jié)果，其中＜5 分為陰性表達(dá)，≥5 分為陽性表達(dá)。

1.4 隨訪

隨訪截止日期為2022年6月，對患者本人或家屬進(jìn)行電話隨訪，詢問患者的生存狀態(tài)，記錄生存時間。本研究中的總生存期（overall survival，OS）定義為首次手術(shù)到因任何原因死亡或隨訪結(jié)束的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗；影響因素分析采用單因素及多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DTL mRNA 表達(dá)水平的比較

TIMER2 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，ESCA 組織中DTLmRNA 表達(dá)水平高于正常食管組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 ESCA組織和正常食管組織中DTL mRNA表達(dá)水平的比較

2.2 DTL 蛋白表達(dá)情況的比較

為了驗證上述數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本研究采用IHC 檢測95 例ESCC 組織和癌旁正常組織中DTL蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，DTL 蛋白在ESCC 組織和癌旁正常組織的細(xì)胞核中表達(dá)，表現(xiàn)為彌漫性或散在的黃色或棕黃色顆粒。ESCC 組織中DTL 陽性表達(dá)率為56.8%（54/95），明顯高于癌旁正常組織的35.8%（34/95），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.467，P=0.004）。

2.3 不同臨床特征ESCC 患者的ESCC 組織中DTL 表達(dá)情況的比較

不同病灶數(shù)目及組織學(xué)分級ESCC患者的ESCC組織中DTL 表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征ESCC 患者的ESCC 組織中DTL 表達(dá)情況的比較

2.4 生存情況的比較

DTL 陽性表達(dá)的ESCC 患者中位OS 明顯短于DTL 陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（圖2）

圖2 DTL陽性表達(dá)（n=54）和陰性表達(dá)（n=41）ESCC患者的生存曲線

2.5 ESCC 患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素分析

采用Cox 比例風(fēng)險模型對ESCC 患者預(yù)后的影響因素進(jìn)行分析。單因素分析結(jié)果顯示，DTL表達(dá)可能為ESCC 患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05）。由于樣本量少，導(dǎo)致其他因素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），故以P＜0.1 為界限，將單因素分析結(jié)果中DTL 表達(dá)和TNM 分期納入多因素分析，結(jié)果顯示，DTL 陽性表達(dá)是ESCC 患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.01）。（表2）

表2 ESCC 患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素分析

3 討論

DTL 可調(diào)節(jié)DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞周期和凋亡，還可引起染色體分離和細(xì)胞分裂缺陷，是細(xì)胞周期進(jìn)展和基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]。此外，DTL 與腫瘤的關(guān)系已有研究報道。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌和肺癌中敲除DTL可抑制腫瘤細(xì)胞的生長[12]，且DTL 在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)具有致癌功能，如宮頸腺癌、肝細(xì)胞癌和胃癌[13-15]。同時，有研究報道，DTL在ESCA 組織中高表達(dá)[9]，但其在ESCA發(fā)生發(fā)展過程中的具體臨床意義尚不明確。因此，本研究通過生物信息學(xué)和臨床試驗研究，探討DTL 是否能成為提示ESCA 進(jìn)程和靶向治療的分子標(biāo)志物。

本研究通過對TIMER2 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，DTL在ESCA 組織中表達(dá)顯著升高。同時，使用IHC 進(jìn)行初步驗證發(fā)現(xiàn)，DTL 蛋白在ESCC 組織中表達(dá)升高，且其高表達(dá)與病灶數(shù)目、組織學(xué)分級有關(guān)，使ESCC 患者的總生存期變短。通過Cox 比例風(fēng)險模型分析發(fā)現(xiàn)，DTL 陽性表達(dá)是ESCC 患者預(yù)后的獨立危險因素。綜合上述結(jié)果可知，DTL 可能參與了ESCC 的發(fā)生、發(fā)展并與不良預(yù)后相關(guān)。由此推測，DTL可能是與ESCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的致癌基因。

綜上所述，本研究揭示了DTL 表達(dá)水平與ESCC 患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，表明其可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展且是預(yù)后的影響因素，有望成為ESCC 患者預(yù)后的潛在預(yù)測因子。然而，DTL 在ESCC 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步的研究加以驗證，這正是課題組后期準(zhǔn)備開展的工作。