探討半夏瀉心湯聯(lián)合鹽酸伊立替康治療對大鼠腸道菌群的影響

鄒媛媛 裴靜波 周文英 王亞坤

[摘要]?目的?探討半夏瀉心湯對鹽酸伊立替康（irinotecan?hydrochloride，CPT-11）相關(guān)的大鼠腸道菌群的影響。方法?選取70只雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、半夏瀉心湯低劑量組、半夏瀉心湯中劑量組、半夏瀉心湯高劑量組、5-氨基水楊酸組，以及半夏瀉心湯+5-氨基水楊酸組，每組10只。所有大鼠腹腔注射CPT-11溶液造模，根據(jù)組別和劑量分別對各組灌胃半夏瀉心湯和5-氨基水楊酸。10d后麻醉處死大鼠取材，測量大鼠胃殘留率、小腸推進(jìn)率。采用16S?rDNA測序分析大鼠腸道糞便中的菌群種類，采用香濃–威納（Shannon-wiener）指數(shù)計(jì)算各組大鼠糞便樣品中菌群的多樣性。采用索雷森（Sorenson）指數(shù)比較各組大鼠腸道菌群16S?rDNA-PCR-DGGE圖譜的相似性。結(jié)果?相比于空白對照組，模型組大鼠增重緩慢，胃殘留率升高，腸推進(jìn)率降低，菌群多樣性指數(shù)和相似性指數(shù)降低，腸桿菌數(shù)量增多，擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型對照組相比，半夏瀉心湯低、中、高劑量組大鼠的胃殘留率降低，腸推進(jìn)率提高，腸桿菌數(shù)量減少，擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與半夏瀉心湯中劑量組比較，半夏瀉心湯與5-氨基水楊酸聯(lián)合治療后，大鼠的腸推進(jìn)率提高，擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療后第10天，半夏瀉心湯各劑量組、5-氨基水楊酸組、半夏瀉心湯+5-氨基水楊酸組的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性指數(shù)均顯著高于模型對照組（P<0.05），且半夏瀉心湯中劑量組的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性指數(shù)顯著高于半夏瀉心湯低、高劑量組（P<0.05）；半夏瀉心湯+5-氨基水楊酸組的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性指數(shù)均顯著高于5-氨基水楊酸組（P<0.05），結(jié)論?半夏瀉心湯能夠顯著改善大鼠由CPT-11導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象，緩解大鼠體質(zhì)量下降的癥狀，使得模型大鼠胃殘留率降低、腸推進(jìn)率增加。

[關(guān)鍵詞]?半夏瀉心湯；鹽酸伊立替康；腸道菌群；菌群多樣性指數(shù)；菌群相似性指數(shù)

[中圖分類號]?R574??????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.14.016

To?investigate?the?effect?of?Banxia?Xiexin?decoction?combined?with?irinotecan?on?intestinal?flora?of?experimental?rats

ZOU?Yuanyuan1，?PEI?Jingbo1，?ZHOU?Wenying1，?WANG?Yakun2

1.Department?of?Gastroenterology，?Xiaoshan?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Hangzhou?311201，?Zhejiang，?China;?2.?Department?of?Critical?Care?Medicine，?Hangzhou?Traditional?Chinese?Medicine?Hospital?Affiliated?to?Zhejiang?Chinese?Medicine?University，?Hangzhou?310044，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?effect?of?Banxia?Xiexin?decoction?on?intestinal?flora?of?rats?related?to?irinotecan?hydrochloride?（CPT-11）.?Method?Seventy?male?rats?were?selected?and?fed?for?1?week?after?acclimatization，?and?were?divided?into?blank?control?group，?model?control?group，?low?dose?group?of?Banxia?Xiexin?decoction，?medium?dose?group?of?Banxia?Xiexin?decoction，?high?dose?group?of?Banxia?Xiexin?decoction，?5-aminosalicylic?acid?group，?and?Banxia?Xiexin?decoction?+?5-aminosalicylic?acid?group?according?to?the?random?number?table?method，?with?10?rats?in?each?group.?All?rats?were?injected?intraperitoneally?with?CPT-11?solution，?and?each?group?was?given?gavage?of?Banxia?Xiexin?decoction?and?5-aminosalicylic?acid?according?to?the?group?and?dose.?10?days?later，?the?rats?were?anesthetized?and?executed?for?sampling，?and?the?gastric?residual?rate?and?small?intestinal?advancement?rate?were?measured.?The?16S?rDNA?sequencing?was?used?to?analyze?the?species?of?flora?in?rat?intestinal?feces，?and?Shannon-wiener?index?was?used?to?calculate?the?diversity?of?flora?in?each?group?of?rat?fecal?samples.?The?similarity?of?16S?rDNA-PCR-DGGE?profiles?of?rat?intestinal?flora?in?each?group?was?compared?using?Sorenson?index.?Results?Compared?with?the?blank?control?group，?the?rats?in?the?model?control?group?gained?more?weight?slowly，?had?higher?gastric?residual?rate，?increased?the?number?of?enterobacter，?decreased?the?number?of?bacteroide，?bifidobacterium，?enterococcus?and?lactobacillus，?all?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?Compared?with?the?model?control?group，?the?rats?in?the?low，?medium?and?high?dose?groups?of?Banxia?Xiexin?decoction?showed?lower?gastric?residual?rate，?higher?intestinal?advancement?rate，?lower?numbers?of?enterobacteriaceae?and?higher?numbers?of?bacteroide，?bifidobacterium，?enterococcus?and?lactobacillus，?all?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?Compared?with?the?medium?dose?group?of?Banxia?Xiexin?decoction，?the?combination?treatment?of?Banxia?Xiexin?decoction?and?5-aminosalicylic?acid?resulted?in?increased?intestinal?propulsion?rate，?and?increased?the?numbers?of?bacteroide，?bifidobacterium，?enterococcus?and?lactobacillus?in?rats，?all?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?On?the?10th?day?after?treatment，?the?flora?diversity?index?and?flora?similarity?index?of?each?dose?group，?the?5-aminosalicylic?acid?group?and?the?group?of?Banxia?Xiexin?decoction?+?5-aminosalicylic?acid?were?significantly?higher?than?those?of?the?model?control?group?（P<0.05），?and?the?flora?diversity?index?and?flora?similarity?index?of?the?middle?dose?group?of?Banxia?Xiexin?decoction?were?significantly?higher?than?those?of?the?low?and?high?dose?groups?of?Banxia?Xiexin?decoction?（P<0.05）.?The?diversity?index?and?similarity?index?of?bacterial?flora?in?the?group?ofBanxia?Xiexin?decoction?+?5-aminosalicylic?acid?were?significantly?higher?than?those?in?the?group?of?5-aminosalicylic?acid?（P<0.05）.?Conclusion?Banxia?Xiexin?decoction?can?significantly?improve?the?intestinal?microflora?disorder?caused?by?CPT-11?in?rats，?alleviate?the?symptoms?of?weight?loss?in?rats，?and?reduce?the?gastric?residual?rate?and?increase?the?intestinal?thrust?rate?of?model?rats.

[Key?words]?Banxia?Xiexin?decoction;?Irinotecan?hydrochloride;?Intestinal?flora;?Microbial?diversity?index;?Bacterial?community?similarity?index

鹽酸伊立替康（irinotecan?hydrochloride，CPT-11）是常用化療藥物之一，對于腫瘤的復(fù)發(fā)和惡化具有良好的抑制效果，目前已被認(rèn)定為治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線藥物[1-2]。該藥物后易導(dǎo)致腹瀉，有研究顯示單獨(dú)使用CPT-11時的腹瀉發(fā)生率明顯低于多種化療藥物聯(lián)合治療[3]，但通常多種化療藥物聯(lián)合治療效果相比單藥化療效果更佳，因此降低CPT-11聯(lián)合治療導(dǎo)致的不良反應(yīng)是當(dāng)下臨床研究的重點(diǎn)。中醫(yī)藥在CPT-11所致的腹瀉中具有一定的緩解作用，現(xiàn)有較多研究采用中藥單體或復(fù)方藥與CPT-11聯(lián)合治療腫瘤，取得了較好的臨床療效[4-5]。基于此，本研究擬制了半夏瀉心湯組方藥，通過檢測CPT-11治療的大鼠腸道菌群變化，探究該組方在CPT-11治療導(dǎo)致腹瀉中的作用。

1??材料與方法

1.1??動物與材料

70只雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，6～8周齡，購自杭州醫(yī)學(xué)院[實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（浙）2022-0002]。CPT-11（生產(chǎn)廠商：Pfizer?（Perth）Pty?Limited，注冊證號：國藥準(zhǔn)字HJ20160577，規(guī)格：5ml/0.1g）按照200mg/ml溶解于乙醇（美國Sigma-Aldrich公司），用含有2%吐溫-80的無菌磷酸鹽緩沖液稀釋至注射所需濃度（150mg/kg）；檢測菌群qPCR試劑盒購自美國BioRad公司；高速智能梯度PCR儀購自美國Agilent?Technologies公司；高通量實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)為Roche?LightCycler?480?Ⅱ（瑞士Roche?Life?Science公司）。半夏瀉心湯組成：半夏15g、甘草15g、黃芩15g、人參15g、干姜15g、黃連5g、大棗4枚，中藥材均購買自杭州華東中藥飲片有限公司。精密稱取30副中藥，加8倍量水，煎煮2次，濾過成為流浸膏，水浴繼續(xù)濃縮至稠浸膏，真空干燥得干浸膏。本研究經(jīng)浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審批通過（倫理審批號：ZJCLA-IACUC-20040025）。

1.2??方法

1.2.1??動物分組??所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、半夏瀉心湯低劑量組、半夏瀉心湯中劑量組、半夏瀉心湯高劑量組、5-氨基水楊酸組，以及半夏瀉心湯+5-氨基水楊酸組，每組10只，實(shí)驗(yàn)周期共10d。半夏瀉心湯劑量按成人口服劑量7倍計(jì)算，低劑量、中劑量、高劑量組給藥劑量分別為5g/kg，10g/kg，15g/kg，將中藥分別濃縮至1g/ml，2g/ml，3g/ml（半夏瀉心湯濃度代表每毫升藥液中生藥的干重），半夏瀉心湯+5-氨基水楊酸組中的半夏瀉心湯以中劑量折算。

1.2.2??造模與給藥??大鼠腹腔注射150mg/kg的CPT-11溶液，1次/d，連續(xù)2d[6]，建立遲發(fā)性腹瀉模型。各組給藥方法如下。①空白對照組：以10ml/kg對大鼠進(jìn)行生理鹽水灌胃，2次/d，共9d；其中第4天和第5天同一時間給予腹腔注射1次150mg/kg的生理鹽水。②模型對照組：以10ml/kg對大鼠進(jìn)行生理鹽水灌胃，2次/d，共9d。其中第4天和第5天同一時間給予腹腔注射1次150mg/kg的CPT-11溶液。③半夏瀉心湯（低劑量、中劑量、高劑量）組：以10ml/kg分別對大鼠進(jìn)行低劑量、中劑量、高劑量半夏瀉心湯溶液灌胃，2次/d，共9d。其中第4天和第5天同一時間給予各組腹腔注射1次150mg/kg的CPT-11溶液。④5-氨基水楊酸組：以10ml/kg對大鼠進(jìn)行5-氨基水楊酸溶液灌胃，2次/d，共9d。其中第4天和第5天同一時間給予腹腔注射1次150mg/kg的CPT-11溶液。⑤半夏瀉心湯+5-氨基水楊酸組：以10ml/kg對大鼠進(jìn)行半夏瀉心湯中劑量溶液+5-氨基水楊酸灌胃，2次/d，共9d。其中第4天和第5天同一時間給予腹腔注射1次150mg/kg的CPT-11溶液。所有組別大鼠在末次的CPT-11注射5d（實(shí)驗(yàn)第10天）后處死，取材。

1.3??觀察指標(biāo)

1.3.1??胃殘留率??于實(shí)驗(yàn)第10天，各組大鼠禁食不禁水12h后，給予混有炭末的半固體糊10ml/kg灌胃，30min后處死大鼠。剖開大鼠腹部，結(jié)扎胃賁門和幽門，取出胃用濾紙吸干胃表面水分后稱量胃總重，將胃內(nèi)容物洗凈后稱量胃凈重，胃殘留重量=胃總重–胃凈重。胃殘留率=胃殘留物/所灌半固體米糊重量×100%。

1.3.2??小腸推進(jìn)率??大鼠處死后，開腹取腸，測量幽門至回盲腸部全長及幽門至半固體糊黑染的距離。小腸推進(jìn)率=幽門至半固體糊黑染的距離/幽門至回盲部全長×100%。

1.3.3??菌群16S?rDNA測序分析??在治療結(jié)束后，采集大鼠新鮮糞便，置于無菌管離心管中，–80℃凍存?zhèn)溆?。采用QIAamp??DNA?Stool?Mini?Kit試劑盒（德國QIAGEN公司）提取大鼠糞便DNA，采用通用引物（F：5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，R：5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）對16S?rDNA?V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。采用Illumina?MiSeq測序平臺對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，整個測序服務(wù)由微基生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.3.4??PCR-DGGE分析??采用DCodeTM型突變檢測系統(tǒng)分離16S?rDNA擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物。設(shè)置電泳條件為8%丙烯酰胺凝膠、35%～60%的變性劑、1×TAE緩沖液、120V、60℃電泳8h，采用硝酸銀染色15min，加入顯色液，在凝膠成像儀上檢測結(jié)果。通過16S?rDNA-PCR-DGGE指紋圖譜，采用香濃–威納（Shannon-?wiener）指數(shù)評估各組大鼠糞便樣品中菌群的多樣性，采用索雷森（Sorenson）指數(shù)比較各組大鼠腸道菌群16S?rDNA-PCR-DGGE圖譜的相似性。

1.3.5??腸道菌qPCR檢測??參照Zeng等[7]研究方法進(jìn)行各細(xì)菌序列擴(kuò)增，由羅寧生物公司合成引物序列。各樣本糞便DNA?提取嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，qPCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，54℃退火15s，72℃延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)，72℃延伸5min。

1.4??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??體質(zhì)量和胃腸動力比較

給藥后，與空白對照組比較，模型對照組大鼠增重緩慢、胃殘留率高、腸推進(jìn)率低（P<0.05）。與模型對照組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組和5-氨基水楊酸組大鼠的胃殘留率顯著降低（P<0.05），腸推進(jìn)率顯著提高（P<0.05）；治療后的半夏瀉心湯中劑量組和5-氨基水楊酸組大鼠顯著重于模型對照組（P<0.05）。半夏瀉心湯與5-氨基水楊酸組大鼠的腸推進(jìn)率顯著高于半夏瀉心湯中劑量組（P<0.05）；半夏瀉心湯與5-氨基水楊酸組大鼠的胃殘留率顯著低于5-氨基水楊酸組（P<0.05），腸推進(jìn)率顯著高于5-氨基水楊酸組（P<0.05），見表1。

2.2??腸道菌群多樣性指數(shù)及相似性指數(shù)比較

治療第5天和第10天后，模型對照組大鼠的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性指數(shù)均顯著低于空白對照組大鼠（P<0.05）。治療后第10天，半夏瀉心湯各劑量組、5-氨基水楊酸組、半夏瀉心湯+5-氨基水楊酸組的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性指數(shù)均顯著高于模型對照組（P<0.05）；且半夏瀉心湯中劑量組的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性指數(shù)顯著高于半夏瀉心湯低、高劑量組（P<0.05）；半夏瀉心湯+5-氨基水楊酸組的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性指數(shù)均顯著高于5-氨基水楊酸組（P<0.05），見表2。

2.3??腸道菌群數(shù)量比較

與空白對照組大鼠相比，模型對照組大鼠的腸桿菌數(shù)量顯著增多，擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著減少（P<0.05）。半夏瀉心湯低、中、高劑量組大鼠的腸桿菌顯著低于模型對照組（P<0.05），擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著高于模型對照組（P<0.05）。治療后，半夏瀉心湯低、高劑量組大鼠的腸桿菌數(shù)量顯著多于半夏瀉心湯中劑量組（P<0.05），半夏瀉心湯低、高劑量組的擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著低于半夏瀉心湯中劑量組（P<0.05）。半夏瀉心湯與5-氨基水楊酸組的擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量均顯著高于5-氨基水楊酸組（P<0.05），見表3。

3??討論

CPT-11可引起機(jī)體腸道功能失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體消化吸收能力下降，因此在臨床上常表現(xiàn)為日益消瘦[8]。本研究通過給予大鼠CPT-11腹腔注射，建立CPT-11遲發(fā)性腹瀉大鼠模型，結(jié)果顯示模型組大鼠臨床表現(xiàn)為增重緩慢、胃殘留率高、腸推進(jìn)率低，說明CPT-11大鼠模型構(gòu)建成功。中醫(yī)認(rèn)為，化療藥物乃實(shí)毒侵襲機(jī)體損害腸道，病位在腸道，涉及肝、腎、脾等多個器官，故應(yīng)以調(diào)和中焦脾胃、增強(qiáng)免疫為主，配合采用清熱化濕、疏肝理氣治療。本研究使用半夏瀉心湯，半夏具有降膩止嘔、溫胃消痞的作用；黃芩性清寒、具有清瀉里熱的功效；人參主治氣虛欲脫、脾氣不足；干姜溫和散寒，可助半夏溫胃消痞；黃連主治濕熱痞滿，惡心嘔吐；大棗可補(bǔ)氣血，補(bǔ)脾益氣；甘草具有補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥的功效。有研究顯示，半夏瀉心湯可促進(jìn)生長因子的表達(dá)，降低舒血管腸肽的分泌，進(jìn)而促進(jìn)胃潰瘍愈合、促進(jìn)胃排空[9]。有研究顯示，CPT-11可與多種中藥聯(lián)合且發(fā)揮良好的功效，如與穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合可調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[10]，其與人參健脾丸聯(lián)合治療可致遲發(fā)性腹瀉以及調(diào)控腸道菌群和血清炎癥因子[11]。本研究結(jié)果顯示，給予CPT-11模型大鼠半夏瀉心湯治療后，模型大鼠癥狀得到緩解，表現(xiàn)為體重增加、胃殘留率降低、腸推進(jìn)率增加，說明在臨床療效方面半夏瀉心湯具有改善CPT-11對機(jī)體腸道損傷的作用。

腸道黏膜屏障遭到損壞后，腸道菌群的穩(wěn)態(tài)將會打破，主要表現(xiàn)在腸道菌群數(shù)量、豐度和結(jié)構(gòu)組成上出現(xiàn)變化。本研究對給藥大鼠糞便菌群進(jìn)行動態(tài)跟蹤觀測，模型組大鼠的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性指數(shù)均顯著低于健康狀態(tài)下的大鼠，而半夏瀉心湯治療模型大鼠后，大鼠的菌群多樣性指數(shù)、菌群相似性明顯升高。此外，與健康狀態(tài)下大鼠相比，模型組大鼠的腸桿菌明顯增多、擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯減少。半夏瀉心湯治療模型大鼠后，大鼠的腸桿菌明顯減少、擬桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量回升。腸桿菌是條件致病菌，擬桿菌主要生產(chǎn)乙酸、丙酸、琥珀酸，雙歧桿菌主要生產(chǎn)乙酸和乳酸，乳酸桿菌主要生產(chǎn)乙酸和乳酸，乙酸和丙酸的含量與腸道益生菌具有正相關(guān)性，其水平變化可反映腸道菌群的健康狀況[12]。由此可知，半夏瀉心湯可改善CPT-11導(dǎo)致的大鼠腸道菌群豐富度和數(shù)量的降低，促進(jìn)益生菌的增殖，抑制條件致病菌的生長。有研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯治療可減輕化療相關(guān)性腹瀉的產(chǎn)生，且其調(diào)控機(jī)制與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)[13]。此外，目前多項(xiàng)研究顯示半夏瀉心湯可以調(diào)節(jié)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)平衡[14-15]，這與本研究結(jié)果一致，推測半夏瀉心湯組方中各中藥成分具有抗菌消炎的作用，并可在保護(hù)腸道損傷的同時維持菌群生態(tài)，由此說明半夏瀉心湯能改善腸道菌群比例、調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，半夏瀉心湯能夠顯著改善大鼠由CPT-11導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象，緩解大鼠體重下降的癥狀，使得模型大鼠胃殘留率降低、腸推進(jìn)率增加。

[參考文獻(xiàn)][1] 姚強(qiáng)，?徐萍，?金俊，等.?益氣健脾方輔助伊立替康聯(lián)合替吉奧一線治療晚期結(jié)直腸癌52例[J].?臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，?2020，?7（7）：?155–156.