基于脂質組學探究健脾利濕方對NAFLD小鼠肝臟脂質的調控作用

金天姿,羅子宸,3,許偉辰,種瑩,時晨,單進軍

(1.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科學研究所,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學醫(yī)學代謝組學中心,江蘇 南京 210023;3.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術研究中心,江蘇 南京 210023)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)已成為21世紀以來嚴重威脅人類健康的代謝性疾病之一,截至2020年底,NAFLD患病率高達25%,且逐年增加[1]。臨床以除酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征作為NAFLD診斷標準,同時該病易惡化為非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化、肝癌等[2]。NAFLD為肝系疾病,多由脾失健運,痰濁阻滯所致[3-4]。治療多以健脾疏肝、散瘀化濁降脂為主[5],輔以利濕類藥物,可健運脾胃、疏泄肝氣,調整機體運化狀態(tài),抑制脂質積累[6]。

健脾利濕方為仝小林院士所創(chuàng),由山藥、茯苓、薏苡仁三味中藥組成,具有健脾、益氣、滲濕之功效。臨床研究表明,該方能夠調節(jié)糖脂代謝,抑制患者體內脂質積累,緩解患者虛胖表型,改善患者體內代謝狀態(tài)[7]。現(xiàn)采用高脂飲食誘導的NAFLD小鼠模型,進行健脾利濕方防治NAFLD的藥效學評估,并運用脂質組學技術手段,從脂質代謝角度分析其潛在作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL6/J小鼠18只,8周齡,體質量為18～20 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心。飼養(yǎng)條件:12 h晝夜循環(huán),相對濕度50%～60%,溫度(22±2)℃。適應性飼養(yǎng)1周后,給予高脂飲食進行造模12周。經南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準,倫理號:202103A009。

1.2 儀器

Vortex-Genie2渦旋震蕩儀(美國Scientific industries公司);RETSCH球磨儀(德國Retsch公司);5427R高速冷凍離心機、Bio Photometer蛋白核酸分析儀、Matercycler gradient PCR自動系列化分析儀(德國Eppendorf公司);SPD1010離心濃縮揮干機、QuantStudio 7 Flex熒光定量PCR儀、UHPLC-Q-ExactiveOrbitrap/MS(美國Thermo公司);Allegra超高速冷凍離心機(美國Beckman公司);FA1004N萬分之一分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。

1.3 藥物及試劑

山藥、茯苓、薏苡仁購自南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院;60%高脂飼料(D12492,美國Diet research公司);甲醇、乙腈、MTBE(美國Merck公司,質譜純);異丙醇、甲酸銨、乙酸銨、甲酸(美國ROE公司,質譜純)、TRIZOL(美國Thermo公司);甘油三酯(TG,A110-1-1)、總膽固醇(TC,A111-1-1)、高密度脂蛋白(HDL-C,A112-1-1)、低密度脂蛋白(LDL-C,A113-1-1)、谷草轉氨酶(AST,C010-2-1)、谷丙轉氨酶(ALT,C009-2-1)生化指標檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(R323-01)、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(Q712-03)PCR試劑(南京諾唯贊生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

取山藥15 g,茯苓15 g,薏苡仁30 g,浸泡過夜,分別加入10倍、8倍超純水各煎煮1 h,過濾,減壓濃縮至生藥量1.95 g·kg-1,將藥物分裝儲存于-20 ℃冰箱備用。

2.2 分組及給藥

將18只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為空白組(ND)、模型組(HFD)、健脾利濕方組(JPLS),每組6只?？瞻捉M小鼠給予正常飲食、自由飲水,其余2組給予高脂飲食誘導NAFLD模型。從造模第1天進行連續(xù)給藥12周,給藥方式采用自主飲藥,給藥劑量按臨床等效劑量折算,約為7.8 g·kg-1·d-1。每周記錄小鼠體質量與進食量。12周后處死小鼠進行樣本取材,包括摘眼球取血、摘取肝臟組織,取約200 mg肝臟放入4%多聚甲醛中固定,約200 mg肝臟液氮速凍,剩余組織保存于-80 ℃冰箱。

2.3 葡萄糖耐量(OGTT)實驗

于造模第11周進行OGTT實驗,小鼠禁食14 h后,空腹狀態(tài)下,測量小鼠血糖水平,作為基礎血糖,隨后灌胃2 g·kg-1的葡萄糖溶液,分別于15、30、60、120 min采用尾靜脈采血檢測小鼠血糖水平,全程禁食處理。

2.4 組織病理學分析

將固定于4%多聚甲醛中的肝臟組織進行石蠟包埋、切片、HE染色及封片保存。將液氮速凍的肝臟組織冷凍切片、油紅染色及封片保存。最后于光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學改變。

2.5 生化指標檢測

離心取小鼠血清,進行生化指標TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST的檢測,實驗方法根據試劑盒操作說明進行。

2.6 肝臟脂質代謝指標的檢測

稱取小鼠肝臟20 mg,采用Trizol法提取小鼠肝臟總RNA,而后將其反轉為cDNA,儲存于-20 ℃?zhèn)溆?。采用qPCR法進行脂質代謝相關基因檢測,運用2-ΔΔCT公式計算mRNA相對表達量,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.7 脂質組學檢測

2.7.1 脂質組學樣本前處理 以n=6進行實驗樣本取材,精密稱取(20±0.5) mg肝臟組織加入200 μL超純水于提前預冷的球磨儀進行勻漿,吸取20 μL勻漿液于1.5 mL的離心管中,加入含內標LysoPE(17∶0),SM(17∶0)和PE(17∶0/17∶0)的冰甲醇溶液,渦旋10 s,加入750 μL冰甲基叔丁基醚(MTBE),渦旋10 s后于4 ℃振蕩10 min后加入冰超純水188 μL,渦旋20 s,于4 ℃,18 000 r·min-1下離心2 min,吸取上清液350 μL至1.5 mL的離心管中,于離心濃縮揮干機中揮干。取揮干后的樣本加入110 μL 復溶液(甲醇∶甲苯=9∶1),渦旋10 min,超聲10 min,于4 ℃,18 000 r·min-1,離心10 min,吸取60 μL上清進樣分析[8]。

2.7.2 色譜條件 色譜柱:ACQUITY CSH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流速:0.6 mL·min-1,流動相:正離子模式A為乙腈-水(6∶4)+10 mmol·L-1甲酸銨+0.1%甲酸,B為異丙醇-乙腈(9∶1)+10 mmol·L-1甲酸銨+0.1%甲酸;負離子模式A為乙腈-水(6∶4)+10 mmol·L-1乙酸銨,B為異丙醇-乙腈(9∶1)+10 mmol·L-1乙酸銨。流動相梯度:0～2 min,15%→30%B;2～2.5 min,30%→48%B;2.5～11 min,48%→82%B;11～11.5 min,82%→99%B;11.5～12 min,99%B;12～12.1 min,99%→15%B;12.1～15 min,15%B。柱溫:65 ℃,進樣量4 μL。

2.7.3 質譜條件 Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀,電離源:HESI源。掃描模式:正(+)/負(-)離子模式。噴霧電壓為3.5 kV(+)和3.0 kV(-),離子源溫度為306 ℃(+)和325 ℃(-),毛細管溫度為300 ℃,鞘氣和輔助氣均為氮氣,鞘氣流為275 kPa,輔助氣流為104 kPa,S-lens為50,掃描范圍為m/z215～1 800[8]。

2.7.4 脂質組學數據處理 將正、負離子模式下質譜原始文件進行Abf格式轉化,于MS-DAIL4.24軟件中進行譜圖信息比對,完成脂質成分鑒定。數據上傳至metaboanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)網站進行數據可視化處理;根據Fold Change>1.5或<0.67、P<0.05條件篩選差異脂質。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠形態(tài)學比較

如圖1A所示,經高脂飲食誘導12周后,與空白組比較,模型組小鼠體質量明顯上升(P<0.001),經12周健脾利濕方干預后,小鼠體質量相較于模型組顯著下降(P<0.001),且進食量無明顯差異(圖1)。

注:A.體質量變化曲線圖;B.平均進食量曲線圖。與空白組比較,***P<0.001;與模型組比較,###P<0.001。ND.空白組;HFD.模型組;JPLS.健脾利濕方組圖1 各組小鼠體質量、進食量變化曲線Fig.1 Body weight and food intake curve of mice at different group

3.2 各組小鼠OGTT變化

OGTT實驗結果顯示(圖2),模型組血糖曲線高于空白組,糖耐量下降(P<0.001)。健脾利濕方干預后小鼠血糖明顯下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001),表明小鼠對葡萄糖調控能力恢復。

注:與空白組比較,*P<0.05,***P<0.001;與模型組比較,ND.空白組;HFD.模型組;JPLS.健脾利濕方組圖2 各組小鼠血糖變化比較Fig.2 The blood sugar in each group

3.3 NAFLD小鼠肝臟病理學分析

HE染色顯示(圖3),空白組小鼠肝臟細胞排列緊密,結構完整。高脂飲食組小鼠肝臟出現(xiàn)氣球樣病變,細胞邊界模糊;健脾利濕方給藥組肝臟中脂肪空泡較少,組織損傷程度較輕。油紅染色(圖3)結果表明,高脂飲食組脂滴數目多且形狀較大。與模型組比較,健脾利濕方組脂滴數目少,且形狀較小,甘油三酯沉積明顯改善。

注:ND.空白組;HFD.模型組;JPLS.健脾利濕方組圖3 HE、油紅染色結果比較(200×,n=3)Fig.3 HE and Oil red staining results (200×,n=3)

3.4 各組小鼠血清脂質水平比較

如表2所示,與空白組比較,模型組小鼠TG(P<0.05)、TC(P<0.001)、HDL-C(P<0.001)、LDL-C(P<0.01)含量顯著升高。與模型組比較,給予健脾利濕方干預的小鼠血清脂質相關生化指標含量均明顯下降(P<0.05,P<0.001),提示健脾利濕方顯著緩解了高脂飲食導致的脂質沉積。

表2 各組小鼠血清脂質水平變化比較Table 2 The serum lipid level in each group mmol·L-1, n=6)

3.5 各組小鼠肝臟損傷水平比較

如表3所示,與空白組比較,模型組血清中ALT、AST水平明顯升高(P<0.001);給予健脾利濕方干預后,血清中ALT、AST水平顯著降低(P<0.001),表明健脾利濕方可有效改善肝臟損傷。

表3 各組小鼠肝臟損傷水平比較Table 3 The liver injury in each group U·L-1, n=6)

3.6 各組小鼠肝臟脂質代謝相關基因表達水平比較

由圖4所示,與空白組比較,模型組小鼠肝臟脂質代謝相關基因Fasn、CD36、SCD1、Srebp1c mRNA表達均顯著增加(P<0.01,P<0.001),CPT1α mRNA水平明顯下降(P<0.001);與模型組小鼠比較,健脾利濕方組Fasn、CD36、SCD1、Srebp1c的mRNA低表達(P<0.05,P<0.01,P<0.001),CPT1α mRNA表達略增加,但不具有統(tǒng)計學意義。

注:與空白組比較,*P<0.05,***P<0.001;與模型組比較,ND.空白組;HFD.模型組;JPLS.健脾利濕方組圖4 各組小鼠肝臟脂質代謝相關基因表達水平比較Fig.4 Comparison of liver lipid metabolism-related gene expression levels in each group

3.7 脂質組學結果

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS對NAFLD小鼠肝臟脂質成分進行檢測,采集正、負離子模式下總離子流圖(圖5)。負離子模式下,3組在脂肪酸(FA)水平上存在差異;正離子模式下,模型組甘油三酯(TG)水平明顯上升,健脾利濕方組TG水平相對于模型組有所下降。

圖5 總離子流圖(TIC)Fig.5 Total ion flow diagram(TIC)

通過MS-Dail 4.24軟件對脂質成分進行鑒定,正、負離子模式下分別鑒定出429、213種脂質成分。主成分分析(PCA)結果顯示(圖6),正、負離子模式下空白組、模型組、健脾利濕方組3組置信區(qū)間均有較好區(qū)分,且健脾利濕方組置信區(qū)間趨于空白組,說明健脾利濕方可一定程度回調高脂飲食所致的脂質代謝紊亂。

注:A.正離子模式PCA圖;B.負離子模式PCA圖圖6 主成分分析(PCA)圖Fig.6 Principal component analysis (PCA)

根據Fold Change≥1.5或≤0.67,P<0.05對正、負離子差異脂質成分進行篩分。正離子模式下,模型組/空白組共有290個差異脂質(上調217個,下調73個),健脾利濕方組/模型組共有231個差異脂質(上調83個,下調148個),共同差異脂質184個,見表4。負離子模式下,模型組/空白組共有113個差異脂質(上調56個,下調57個),健脾利濕方組/模型組共有58個差異脂質(上調44個,下調14個),共同差異脂質43個,見表5。按脂質種類進行富集分析,氣泡圖顯示(圖7)模型組肝臟中TG水平顯著增加,FA、DG水平上調,提示NAFLD小鼠肝臟中脂肪酸攝取活動及脂肪合成活動增加,而PE、PI、PS等磷脂在高脂飲食誘導后降低。磷脂作為細胞膜主要成分之一,低細胞膜磷脂水平預示肝臟細胞膜發(fā)生損傷[9]。健脾利濕方干預后,小鼠肝臟中FA、DG、TG水平相較于模型組表達下降,提示其一定程度上抑制了中性脂肪的積聚;PC、PE、PI、PS等磷脂水平表達上升,表明健脾利濕方具有調控磷脂代謝水平的作用。

注:紅色表示上調,藍色表示下調;圖中對應脂質為:磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、溶血性磷脂酰膽堿(LPC)、溶血性磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰膽堿醚(Ether PC)、磷脂酰乙醇胺醚(EtherPE)、脂肪酸(FA)、神經酰胺(CerHexCer)、己糖神經酰胺(HexCer)、鞘磷脂(SM)、雙(單?；视?磷酸酯(BMP)、N-?；掖及?NAE)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG)、膽汁酸(Bile Acids)、甘油三酯醚(Ether TG)、心磷脂(CL)。A.模型組(HFD)與空白組(ND)相比的差異脂質;B.健脾利濕方組(JPLS)與模型組(HFD)相比的差異脂質圖7 差異脂質富集分析Fig.7 Differential lipid enrichment analysis

表4 正離子模式肝臟差異脂質Table 4 Liver differential lipids in positive ion mode

表5 負離子模式肝臟差異脂質Table 5 Liver differential lipids in negative ion mode

4 討論

健脾利濕方為仝小林院士所創(chuàng),由山藥、茯苓、薏苡仁三味藥物組成,山藥和茯苓配伍增加健脾益氣,佐以薏苡仁兼能化濕,全方具有健脾、益氣、滲濕之功效[10-12]。本研究結果顯示健脾利濕方能夠有效改善高脂飲食誘導的小鼠肥胖表型,降低血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT水平,有效調節(jié)機體脂質代謝,減輕肝臟細胞脂質沉積與損傷。qPCR檢測結果表明,健脾利濕方可有效抑制肝臟脂質代謝相關基因Fasn、CD36、SCD1、Srebp1c mRNA表達水平。提示健脾利濕方可能通過促進Fasn泛素化及蛋白酶體降解,有效防止肝細胞脂質沉積[13]。Srebp1c為胰島素激活的關鍵脂質性轉錄因子,調控肝臟糖異生[14],同時,Srebp1c可受NF-κB P50亞基調控,從而減輕肝臟脂肪變性[15]。

脂質種類及含量變化與疾病的發(fā)生存在密切的關系,脂質組學為代謝組學重要分支之一[16]。本次肝臟脂質組學研究結果表明健脾利濕方干預后小鼠TG、TC、FA水平下降,磷脂水平(PC、PE、PI、PG等)升高。肝臟中飽和脂肪酸的積聚可通過激活Fasn/Srebp1c/HMG-CoA信號,誘導膽固醇合成增加,進一步導致TG、LDL-C的升高[17]。文獻研究表明飽和脂肪酸可通過模仿LPS的作用促進機體釋放大量致炎性細胞因子[18],如棕櫚酸(FA 16∶0)通過激活肝臟細胞死亡受體5(DR5),促進肝臟細胞釋放細胞外囊泡,誘導巨噬細胞炎癥表型[19]。細胞磷脂水平與細胞膜完整性有關,適當提高磷脂水平有助于維護磷脂雙分子層水油平衡,提高細胞膜穩(wěn)定性。文獻研究表明,過高或過低的磷脂水平都會導致TG水平的增多,低水平的PC可能會誘導肝臟中TG水平的增高,高水平的PC會升高DG含量促進TG合成。臨床上,通過補充多烯磷脂酰膽堿促進肝組織再生,治療肝臟損傷類疾病[20-21]。S-腺苷甲硫胺酸(SAM)與NAFLD、NASH的發(fā)生密切相關。SAM作為PC合成的關鍵甲基供體,為肝臟輸出VLDL所必需的,同時SAM可以通過磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶途徑參與脂質合成,該酶缺乏會導致SAM積累,導致組蛋白和主要磷酸酶PP2A甲基化,促進機體活性氧ROS積聚,誘發(fā)機體氧化應激反應[22]。磷脂組成多樣,并非所有磷脂均可發(fā)揮抗非酒精性脂肪肝作用,如L-α-溶血性磷脂酰肌醇(LPI)可作為G蛋白偶聯(lián)受體GPR55內源性配體,在NASH患者肝臟中表達上升,促進肝臟脂肪酸從頭合成,降低脂肪酸β氧化,誘導乙酰輔酶A羧化酶(ACC)表達上升,促進肝星狀細胞的激活并提高肝臟脂質含量[23]。氧化應激而產生的氧化磷脂(OxPLs)可促進ROS積累誘發(fā)肝細胞線粒體功能障礙,具有促炎和促動脈粥樣硬化作用。通過靶向抑制OxPLs可改善NASH肝臟脂肪變性、炎癥,纖維化、肝細胞死亡特征,抑制其進展為肝細胞癌[24]。

綜上所述,健脾利濕方有助于調控脂質代謝紊亂,從而達到防治NAFLD的作用。脂質組學可全面描繪機體脂質代謝狀態(tài),為疾病的治療提供了一定的思路。