經(jīng)典名方溫經(jīng)湯基準樣品HPLC-Q-TOF/MS分析與指紋圖譜研究

湯志鋒,張云羽,石德志,高武鋒,龔小文,嵇晶,黃仕文,程建明

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心,江蘇 南京 210023;3.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結(jié)合學院,江蘇 南京 210023)

經(jīng)典名方溫經(jīng)湯出自《婦人大全良方》,該方由酒當歸、川芎、芍藥、桂心、牡丹皮、醋莪術(shù)、人參、炒甘草、酒牛膝9味藥組成,為婦科調(diào)經(jīng)的常用方,主要用于沖任虛寒而有瘀滯的月經(jīng)不調(diào)[1]、痛經(jīng)[2-3]、崩漏、不孕[4]等?！豆糯?jīng)典名方關(guān)鍵信息表(7首方劑)》[5](以下簡稱關(guān)鍵信息表)對其用法用量有明確規(guī)定“粉碎成粗粒,每服20 g,加水450 mL,煎至240 mL,去滓溫服”。本團隊在關(guān)鍵信息表頒布后,完成了資源考察、產(chǎn)地優(yōu)選、藥材和飲片的質(zhì)量研究以及基準樣品的制備工藝研究,并在此基礎(chǔ)上對溫經(jīng)湯基準樣品進行質(zhì)量研究。

目前溫經(jīng)湯的研究主要集中在臨床應用方面,化學成分分析與指紋圖譜的相關(guān)研究較少,尚未有關(guān)于溫經(jīng)湯基準樣品化學成分分析與指紋圖譜同時測定的相關(guān)報道。本方成分復雜,僅對部分指標性成分進行含量測定,難以代表全方,指紋圖譜技術(shù)的運用能較為全面地表征復方復雜的化學成分信息[6-9],國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的第36號文件[10]明確指出“指紋/圖譜一般以相似度或特征峰相對保留時間、相對峰面積等為檢測指標,主要成分在指紋/特征圖譜中應盡可能得到指認,必要時應建立多張指紋/特征圖譜”。目前溫經(jīng)湯的圖譜研究尚未指認全方所用藥味,本研究通過HPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分析基準樣品的化學成分組成,并采用HPLC-UV和HPLC-ELSD法建立溫經(jīng)湯基準樣品的指紋圖譜,首次歸屬了全方所有藥味,為古代經(jīng)典名方溫經(jīng)湯基準樣品的質(zhì)量控制和新藥研發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司),Waters 2998 PDA檢測器(美國Waters公司),Triple TOF 5600型質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司),TD6002C型電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司),AUW120D型電子分析天平(日本島津公司),KH-300E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司),FTS-10A液體加熱器(潮州市一壺百飲電器實業(yè)有限公司),FW100型高速粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

甘草苷、甘草酸銨、芍藥苷、桂皮醛、丹皮酚、阿魏酸、沒食子酸、β-蛻皮甾酮、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:111610-201607、110731-201720、110736-201035、110710-201821、110708-201407、110773-201313、110831-201906、111638-201706、110703-202034、110704-202129,純度:93.1%、97.7%、97.7%、99.4%、99.9%、99.6%、91.5%、95.0%、94.0%、94.3%),人參皂苷Re、藁本內(nèi)酯對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號:B04D9S76499、R21J10F91128,純度均≥98%)。

甲醇、乙腈(美國Tedia公司,色譜純),超純水(Unique-R10多功能超純水系統(tǒng)制備),甲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,色譜純)。

1.2 藥材

溫經(jīng)湯所用飲片1批購自安徽省萬生中藥飲片有限公司,5批由實驗室炮制而成,10批組方對應飲片批次見表1,實驗室所用藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學嚴輝教授鑒定,按照2020版《中國藥典》方法檢測,所用批次飲片質(zhì)量均符合藥典規(guī)定。

表1 溫經(jīng)湯基準樣品飲片來源及批號信息Table 1 The origin and batch number of herbal pieces from WJT substance benchmarks

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-Q-TOF/MS成分分析

2.1.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A為乙腈,B為0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫(0～56.0 min,3.0%～61.2%A;56.0～56.1 min,61.2%～80%A;56.1～57.0 min,80%～90%A;57.0～65.0 min,90%A);檢測波長254 nm;進樣量為10 μL;流速0.8 mL·min-1;柱溫30 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),采用正負離子掃描檢測,質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500;噴霧電壓45 kV;霧化氣壓力60 psi;輔助氣壓力60 psi;氣簾氣壓力40 psi;離子源溫度600 ℃;錐孔電壓為100 V;碰撞室射出電壓40 eV。

2.1.3 供試品溶液的制備 按關(guān)鍵信息表中溫經(jīng)湯的用法用量,稱取每服處方量(各單味藥批次隨機組合成10批,編號為S1～S10),粉碎成最粗粉,加水450 mL(22.5倍量),浸泡30 min后武火至沸,轉(zhuǎn)至文火,煎煮30 min(至240 mL),100目雙層紗布趁熱過濾,取濾液1 mL,加2 mL甲醇,混勻,1 000 r·min-1離心,取上清液過0.45 μm微孔濾膜,即得。

2.1.4 溫經(jīng)湯基準樣品化學成分分析 使用上述色譜、質(zhì)譜條件對供試品溶液進行正、負離子全掃描,獲得正、負離子模式下的總離子流圖(Total ion chromatogram,TIC圖),見圖1。將數(shù)據(jù)導入PeakView軟件,從溫經(jīng)湯基準樣品中共鑒別了122個化合物[11-16],具體見表2。

圖1 溫經(jīng)湯正(A)、負(B)離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of WJT in positive (A) and negative (B) ion modes

表2 溫經(jīng)湯基準樣品HPLC-Q-TOF-MS分析Table 2 HPLC-Q-TOF-MS analysis results of WJT substance benchmarks

通過HPLC-Q-TOF/MS分析鑒別出122個化合物,包括有機酸、黃酮類、苷類、萜類、甾體、鞣質(zhì)類等,對其藥味來源進行歸屬,其中45個源自甘草,6個源自白芍,15個源自牡丹皮,13個源自川芎,10個源自當歸,11個源自人參,1個源自牛膝,5個源自肉桂,9個源自莪術(shù),化合物16、19、27、44、45為白芍、牡丹皮共有成分,化合物46和114為川芎、當歸共有成分。

2.2 溫經(jīng)湯指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項下色譜條件。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項下供試品溶液的制備。

2.2.3 對照品溶液的制備 取沒食子酸、芍藥苷、β-蛻皮甾酮、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、藁本內(nèi)酯對照品適量,精密稱定,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為123.53、7.05、4.19、10.48、13.75、17.19、3.73、71.21、10.14 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.4 各單味藥及陰性供試品的制備 分別稱取處方中每服劑量所需相應飲片的量(S1中各批次單味藥),按照“2.1.2”項下方法制備,得單味藥供試品溶液。

分別稱取處方中每服劑量所需相應的缺當歸、缺肉桂、缺白芍、缺牡丹皮、缺牛膝、缺川芎、缺甘草、缺莪術(shù)、缺人參9個缺單味藥和缺當歸、肉桂,缺白芍、牡丹皮2個雙缺藥(S1中各批次單味藥),按照“2.1.2”項下方法制備,得陰性對照供試品溶液。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 精密度試驗 取“2.1.3”項下制備供試品溶液,色譜條件同“2.1.1”,連續(xù)進樣6針,以阿魏酸色譜峰為參照峰(S),計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值,各共有峰相對保留時間RSD小于1%,相對峰面積RSD小于5%,表明儀器精密度良好。

2.2.5.2 重復性試驗 取每服飲片量,按照“2.1.3”項下制備得6份供試品溶液,按照“2.1.1”項下色譜條件進樣分析,以阿魏酸色譜峰為參照峰(S),計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值,各共有峰相對保留時間RSD小于1%,相對峰面積RSD小于5%,表明重復性良好。

2.2.5.3 穩(wěn)定性考察 取同一批供試品溶液,同“2.1.1”項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、24 h進樣測定,以阿魏酸色譜峰為參照峰(S),計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值,各共有峰相對保留時間RSD小于1%,相對峰面積RSD小于5%,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 溫經(jīng)湯基準樣品指紋圖譜相似度評價 按照“2.1.1”項的指紋圖譜條件,按照“2.1.3”項的方法制備S1～S10供試品溶液,并進行HPLC-UV測定,得到10批溫經(jīng)湯HPLC-UV指紋圖譜。將10批溫經(jīng)湯指紋圖譜依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》軟件,以S5為參照圖譜,采用中位數(shù)法,時間窗寬度為0.1,進行多點校正,標注19個共有峰,并進行Mark峰匹配,生成對照圖譜并計算相似度,10批溫經(jīng)湯基準樣品指紋圖譜的相似度均>0.910,具體數(shù)據(jù)見表3。溫經(jīng)湯對照指紋圖譜(R)和10批溫經(jīng)湯疊加圖譜(S1～S10)見圖2。

圖2 溫經(jīng)湯對照指紋圖譜(R)及10批溫經(jīng)湯疊加圖譜(S1～S10)Fig.2 Reference fingerprint (R) and fingerprint of 10 batches of WJT (S1-S10)

表3 10批溫經(jīng)湯基準樣品HPLC-UV指紋圖譜相似度Table 3 Similarity of fingerprint of 10 batches of WJT substance benchmarks

2.2.7 溫經(jīng)湯指紋圖譜峰指認及峰歸屬 將溫經(jīng)湯指紋圖譜與混合對照品溶液、單味藥材供試品溶液及各藥材陰性對照供試品溶液進行比對,指認出其中9個色譜峰(圖3),并對19個共有峰進行歸屬(圖4),其中10個峰來源于甘草(5、6、8、9、10、11、12、14、16、17),4個峰來源于牡丹皮(1、2、3、15),1個峰來源于白芍(3),1個峰來源于牛膝(4),2個峰來源于當歸(7、19),2個峰來源于川芎(7、19),1個峰來源于肉桂(13),1個峰來源于莪術(shù)(18)。峰3是白芍和牡丹皮的共有成分,峰7和峰19是川芎和當歸的共有成分,除人參藥味尚無共有峰歸屬,其余藥味均有歸屬。

注:1.沒食子酸;3.芍藥苷;4.β-蛻皮甾酮;6.甘草苷;7.阿魏酸;13.桂皮醛;15.丹皮酚;16.甘草酸;19.藁本內(nèi)酯圖3 HPLC-UV混合對照品圖(C)及溫經(jīng)湯對照指紋圖譜(S1)對比圖Fig.3 Comparison diagram of HPLC-UV mixed reference (C) and WJT reference fingerprint (S1)

注:S1.全方;S2.牛膝;S3.莪術(shù);S4.肉桂;S5.甘草;S6.川芎;S7.當歸;S8.川芎和當歸;S9.白芍;S10.牡丹皮;S11.白芍和牡丹皮;S12.人參圖4 單味藥材共有峰歸屬Fig.4 Common peak attribution of single medicine materials

2.2.8 溫經(jīng)湯參照峰的選擇及相對保留時間的計算 綜合10批溫經(jīng)湯基準樣品保留時間結(jié)果,詳見表4 ,確定了溫經(jīng)湯基準樣品的鑒別標準,建議煎液指紋圖譜中應有19個共有峰,并以保留時間及峰面積相對適中且相對穩(wěn)定的阿魏酸(7號峰)作為參照峰(S峰),計算各共有峰與S峰的相對保留時間,其相對保留時間偏差應在規(guī)定值的±10%之內(nèi)。規(guī)定值為:0.387(峰1)、0.655(峰2)、0.849(峰3)、0.927(峰4)、0.940(峰5)、0.962(峰6)、1.000(峰7)、1.150(峰8)、1.198(峰9)、1.381(峰10)、1.465(峰11)、1.478(峰12)、1.538(峰13)、1.591(峰14)、1.648(峰15)、1.675(峰16)、1.762(峰17)、1.980(峰18)、2.223(峰19)。本方揮發(fā)性成分較多,不同批次和來源飲片之間存在較大差異,相對峰面積RSD值相對偏高,除峰13(桂皮醛)、峰18(莪術(shù))兩峰相對峰面積>30%外,其他峰的相對峰面積均<30%。確定藥材產(chǎn)地、批次以及具體炮制方法后,可全面把控全方的整體質(zhì)量,縮小批次間差異。

表4 10批溫經(jīng)湯基準樣品共有峰相對保留時間Table 4 Relative shift of retention time of characteristic peaks in transfer among 10 batches of WJT

2.3 皂苷類成分的指紋圖譜研究

在HPLC-UV法建立的溫經(jīng)湯基準樣品指紋圖譜中,因人參皂苷類成分具有末端吸收,與其他成分吸收波長有較大差異,尚未有人參共有峰的歸屬,為全面表征基準樣品的整體特征,進一步對基準樣品進行萃取純化,通過HPLC-ELSD法,建立了1張能夠表征人參的皂苷類成分指紋圖譜[17-20],彌補HPLC-UV圖譜中無法體現(xiàn)全方整體藥味的不足。

2.3.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A為乙腈,B為水,梯度洗脫(0～30.0 min,15.0%～23.0%A;30.0～60.0 min,23.0%～40.0%A;60.0～70.0 min,40%A);漂移管溫度90 ℃;載氣體積流量1.6 L·min-1;進樣量10 μL;流速1.0 mL·min-1;柱溫25 ℃。

2.3.2 供試品溶液的制備 按“2.1.3”項下,稱取溫經(jīng)湯每服處方量(S1～S10),粉碎,制備10批煎液基準樣品,冷凍干燥,得基準樣品凍干粉。精密稱定凍干粉各5 g,精密加水50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲30 min,冷卻至室溫,補足失質(zhì)量,過濾。濾液用水飽和正丁醇萃取3次,每次50 mL,合并正丁醇萃取液,用2%NaOH洗2次,每次50 mL,再用蒸餾水50 mL洗2次,棄去水液,正丁醇層置水浴鍋上蒸干,殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,即得。

2.3.3 對照品溶液的制備 取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對照品適量,精密稱定,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.012、0.258、1.035 mg·mL-1的對照品溶液。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 精密度試驗 取“2.3.2”項下制備供試品溶液,色譜條件同“2.3.1”,連續(xù)進樣6針,以人參皂苷Rg1色譜峰為參照峰(S),計算各特征峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值,各共有峰相對保留時間RSD小于1%,相對峰面積RSD小于5%,表明儀器精密度良好。

2.3.4.2 重復性試驗 取每服飲片量,按照“2.3.2”項下制備得6份供試品溶液,按照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析,以人參皂苷Rg1色譜峰為參照峰(S),計算各特征峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值,各共有峰相對保留時間RSD<1%,相對峰面積RSD<5%,表明重復性良好。

2.3.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一批供試品溶液,同“2.3.1”項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、24 h進樣測定,以人參皂苷Rg1色譜峰為參照峰(S),計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值,各特征峰相對保留時間RSD<1%,相對峰面積RSD<5%,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 皂苷類成分指紋圖譜的建立 按照“2.3.2”項的方法制備S1～S10供試品溶液,按照“2.3.1”項下色譜條件,進行HPLC-ELSD測定,得到10批溫經(jīng)湯HPLC-ELSD指紋圖譜。將10批溫經(jīng)湯基準樣品HPLC-ELSD指紋圖譜依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》軟件,以S5為參照圖譜,采用中位數(shù)法,時間窗寬度為0.1,進行多點校正,標注8個共有峰,并進行Mark峰匹配,生成對照圖譜并計算相似度,10批HPLC-ELSD圖譜的相似度均>0.950,對照指紋圖譜(R)、10批溫經(jīng)湯HPLC-ELSD疊加圖譜(S1～S10)及對照品圖譜見圖5～6。

圖5 溫經(jīng)湯對照指紋圖譜(R)及10批溫經(jīng)湯ELSD疊加圖譜(S1～S10)Fig.5 HPLC reference fingerprint (R) and ELSD fingerprint of 10 batches of WJT (S1-S10)

注:2.人參皂苷Rg1;3.人參皂苷Re;5.人參皂苷Rb1圖6 HPLC-ELSD對照品(Rg1、Re、Rb1)圖及溫經(jīng)湯對照指紋圖譜對比圖Fig.6 Comparison diagram of HPLC-ELSD of reference (Rg1, Re, Rb1) and WJT reference fingerprint

2.3.6 溫經(jīng)湯參照峰的選擇及相對保留時間的計算 綜合10批溫經(jīng)湯基準樣品保留時間結(jié)果,確定了溫經(jīng)湯基準樣品的鑒別標準,建議煎液指紋圖譜中應有8個共有峰,并以保留時間及峰面積相對適中且相對穩(wěn)定的人參皂苷Rg1(2號峰)作為參照峰(S峰),計算各共有峰與S峰的相對保留時間,結(jié)果10批溫經(jīng)湯8個共有峰相對保留時間RSD值<5%,相對峰面積RSD值均<10%。

3 討論

本研究對建立的HPLC-UV指紋圖譜色譜條件進行優(yōu)化,單因素考察了不同柱溫(25、30、35 ℃),不同流速(0.6、0.8、1.0 mL·min-1),不同進樣量(10、20、30、40、50 μL),不同流動相(乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸),不同色譜柱[Agilent 5 TC-C18(2)、Agilent SB-C18、Kromasil 100-5-C18、Hedera ODS-2]對洗脫效果的影響,發(fā)現(xiàn)不同溫度、不同進樣量對圖譜無較大影響,流速為0.6 mL·min-1,色譜峰較寬,隨著流速的增大,各共有峰保留時間前移,流速為1.0 mL·min-1,部分色譜峰出現(xiàn)交叉,分離度較差。不同色譜柱對圖譜的出峰數(shù)目以及分離度有較大影響,本研究所用Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱出峰數(shù)目多,分離度好;Agilent SB-C18色譜柱有較好的分離度,但出峰數(shù)目較少;Kromasil 100-5-C18色譜柱,出峰數(shù)目少,且部分峰出現(xiàn)拖尾;Hedera ODS-2色譜柱中峰19(藁本內(nèi)酯)分離度較其他色譜柱好,但甘草的相關(guān)共有峰出現(xiàn)交叉。根據(jù)出峰數(shù)目及分離效果,色譜最佳條件:色譜柱為Agilent 5 TC-C18(2),乙腈-甲酸為流動相,進行梯度洗脫,柱溫30 ℃,流速0.8 mL·min-1,進樣量10 μL。

通過單味藥和缺陰性藥供試品與復方供試品成分比對,將HPLC-UV指紋圖譜中19個共有峰進行歸屬,共歸屬了除人參外的8味藥材。因人參皂苷類成分與其它成分吸收波長存在較大差異,無法在HPLC-UV指紋圖譜得到歸屬,針對人參皂苷類成分的末端吸收現(xiàn)象,對基準樣品進行萃取純化,建立HPLC-ELSD指紋圖譜,通過對照品指認出人參的主要成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1。當前有關(guān)經(jīng)典名方溫經(jīng)湯基準樣品的相關(guān)研究[7-8,21-22]中,尚未有通過指紋圖譜指認出全方所有藥味的明確報道。本研究建立的HPLC-UV和HPLC-ELSD指紋圖譜,首次歸屬了全方所有藥味,彌補了當前研究的空缺,為后續(xù)溫經(jīng)湯基準樣品、制劑的質(zhì)量控制及量值傳遞研究提供參考。