PRKN 基因突變所致早發(fā)型帕金森病家系的臨床特征及基因檢測

廖書勝 ，陳 紅 ，劉 玫 ，潘成玉 ，羅璦滌 ，張 麗

（1）廣西醫(yī)科大學附屬柳州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 柳州 545006;2）遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，國外報道60 歲以上人群患病率大約1%，85 歲以上人群患病率大約4%～5%[1?2]。在我國65 歲以上人群的患病率為1700/10 萬，并隨年齡增長而升高。其中，早發(fā)型PD（early-onset Parkinson’s disease，EOPD）（45歲前發(fā)?。┘s占所有PD 病例的3.6 %。PD 的發(fā)病是因各種原因導致多巴胺能神經(jīng)元的進行性變性丟失而所致，臨床以肌強直、運動遲緩、靜止性震顫和姿勢不穩(wěn)等運動癥狀及非運動癥狀為特征。帕金森病的發(fā)病機制目前尚不明確，可能與遺傳因素、環(huán)境因素及衰老有關[3?5]。

研究發(fā)現(xiàn)[5?6]，在大約3%的帕金森綜合征患者中可檢測到遺傳變異，而在EOPD 和常見帕金森病患者中，這一比例可高達77 %。最近的研究已確定了20 余個PD（尤其是EOPD 病）相關的致病基因，如PRKN（PARK2）、PINK1（PARK6）、DJ-1（PARK7）、LRRK2（PARK8）等[7?8]。其中，由PRKN基因突變所致的PARK2 約占家族性常染色體隱性EOPD 病的50%[9?10]。

PRKN基因包含12 個外顯子，跨度1.3 Mb，編碼蛋白含465 個氨基酸殘基，具有泛素結合酶（E2s）Ubch7 或Ubch8 的特征結構域[11]。迄今為止，已報道了400 多種已知的PRKN基因突變形式，包括點突變、小插入/缺失、外顯子缺失、剪接位點突變和外顯子重排等。由PRKN基因突變所致的PD 患者臨床表現(xiàn)相對不典型，具有發(fā)病早、進展慢，對左旋多巴治療反應良好等特征，與散發(fā)性PD 相比，臨床易出現(xiàn)肌張力障礙等其他運動障礙癥狀[12]。因此，早期基因篩查和基因型-表型相關分析對這類患者的診斷和發(fā)病機制的研究具有重要意義。對于由PRKN突變引起的常染色體隱性青少年帕金森病，已經(jīng)在體外進行了一些基因治療的相關研究，有望在臨床治療中用于帕金森病的治療[13]。本研究通過對2 個AREP 家系的臨床資料分析，并應用下一代測序和MLPA 方法進行基因突變檢測，希望能進一步促進對AREP 的臨床表現(xiàn)及基因突變形式的認識與了解。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究中共納入2 個家系中的2 名EOPD 患者及3 名正常成員。詳細收集患者的臨床表現(xiàn)、病史、體格檢查、實驗室檢查和基因檢測結果。根據(jù)受試者的臨床表現(xiàn)和體格檢查，2 名患者符合2016 年版《中國帕金森病的診斷標準》的診斷標準[14]，診斷為臨床確診PD，而其他家庭成員無PD 的臨床表現(xiàn)。實驗室檢查包括甲狀腺功能檢查和血清銅藍蛋白檢查。臨床評估按照2016 年版《早發(fā)型帕金森病的診斷與治療中國專家共識》[15]用MDS-統(tǒng)一帕金森病評定量表（MDSUPDRS）、Hoehn 和Yahr 量表（H&Y）和帕金森病問卷-39（PDQ-39）進行。采用簡易精神狀態(tài)檢查（MMSE）評估認知功能。應用HAMD 和HAMA 測試患者是否存在情緒障礙。實驗室檢查包括血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺功能檢查和血清銅藍蛋白檢查等。應用3.0 T 磁共振成像的對患者進行了腦結構成像評估。外周血基因組DNA 的提取按照試劑盒說明書操作步驟進行。

本研究為回顧性病例報道，通過遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批[批準號：KLL-2022-691]。納入本研究的患者及其家庭成員均被告知本研究的目的，并獲得了知情的書面同意。

1.2 基因檢測

用EDTA 抗凝管抽取2 名患者及家系一中的父母、姐姐共5 名受試者2 mL 靜脈血。血樣送至北京康旭醫(yī)學檢驗中心，使用DNA 血液微型試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）提取DNA，建立全基因組文庫。對先證者樣品利用探針捕獲富集目標序列和二代測序的方法檢測141 個已知的與PD、震顫、肌張力障礙和其他運動障礙相關的基因；應用多重連接依賴探針擴增（MLPA）法檢測SNCA、LRRK2、PARK2、PINK1、PARK7、ATP13A2、UCHL1、GCH1等基因外顯子的重排和大缺失突變，根據(jù)荷蘭MRC Holland company 提供的標準方案，使用SALSA MLPA probe mix 試劑盒進行缺失分析。檢測到突變后設計特定引物利用Sanger測序或MLPA 法進一步證實并進行家系分析。查詢HGMDpro 數(shù)據(jù)庫的報道情況并參考ACMG 指南對突變的致病性進行評級。對于內(nèi)含子變異進一步運用罕見病數(shù)據(jù)庫中心在線生物信息學預測工具（rddc.tsinghua-gd.org/search-middle?to=Patho-PredicModel）進行剪接型分析預測。

2 結果

2.1 臨床特點

本研究共調(diào)查了2 家系共2 名患者。表1 匯總了2 名患者的詳細臨床特征和量表評估。家系2 患者除存在PRKN 基因突變（3～4 號外顯子純合缺失變異）外，還存在LRRK2基因c.4827+6T>A雜合變異及PINK1 基因c.1474C>T/p.Arg492* 雜合變異。2 名患者的臨床表現(xiàn)顯示出一些相似性，例如早發(fā)、進展緩慢，對小劑量左旋多巴反應良好。但這2 例患者的表型也存在一定差異。首先是首發(fā)癥狀不同：家系1 患者以右上肢靜止性震顫起病，家系2 患者表現(xiàn)為僵硬和運動遲緩起病。其次是：家系2 患者病程早期出現(xiàn)下肢肌張力障礙和姿勢不穩(wěn)，家系1 的患者整個病程中未出現(xiàn)類似癥狀；家系2 患者的自主神經(jīng)功能障礙癥狀多且更為明顯，相比而言，家系1 的患者自主神經(jīng)功能癥狀不明顯。最后，家系2 患者的生活質(zhì)量較家系1 的患者差，PDQ-39 評分為18 分，家系2 患者的UPDRS-III、HAMD 評分均較高（表1）。2 名患者的血常規(guī)、肝功能、腎功能、甲狀腺功能、血清銅藍蛋白等血液檢查均正常。

2.2 基因檢測結果

基因檢測結果發(fā)現(xiàn)家系1 的患者（圖1A，II-2）存在PRKN基因2 號外顯子雜合缺失變異和c.619G>T/p.Glu207Ter*雜合變異2 種突變（圖1B，C），患者的父親及姐姐攜帶c.619G>T/p.Glu207Ter*雜合變異（圖1D，E），不攜帶PRKN基因2 號外顯子雜合缺失（圖1F，G）；患者的母親攜帶PRKN基因2 號外顯子雜合缺失（圖1H），而不攜帶c.619G>T/p.Glu207Ter*變異（圖1I），提示該復合雜合變異與疾病存在家系共分離。家系2 只采集有患者的血樣品，發(fā)現(xiàn)患者（圖2A，II-2）存在PRKN基因3～4 號外顯子純合缺失變異（圖2B），另外發(fā)現(xiàn)患者存在LRRK2基因c.4827+6T>A 雜合變異（圖2C）及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492*雜合無義變異（圖2D）；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)LRRK2基因的c.4827+6T>A 變異可能導致剪切改變，插入332 bp 堿基造成移碼提前終止翻譯成截短蛋白（圖3）。2 名患者未檢測到與PD、震顫、肌張力異常和其他運動障礙相關的一些基因的其他突變。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會指南的相關內(nèi)容，PRKN基因的2 號外顯子缺失、3～4 號外顯子缺失、c.619G>T/p.Glu207Ter*變異，LRRK2基因的c.4827+6T>A 變異及PINK1基因的c.1474C>T/p.Arg492* 變異均被評級為致病變異，文獻復習發(fā)現(xiàn)這些突變在國內(nèi)外人群中有雜合形式的報道，但家系1 患者的PRKN基因復合雜合突變形式及家系2 患者同時攜帶3 個PD 致病基因突變的突變形式均未見報道。

圖1 家系1 的系譜圖及基因測序圖Fig.1 Pedigree and gene sequencing of family 1

圖2 家系2 的系譜圖及基因測序圖Fig.2 Pedigree and gene sequencing of family 2

圖3 LRRK2 基因c.4827+6T>A 變異的剪接預測（https://rddc.tsinghua-gd.org/tools/patho-predic/result?uuid=005c2fe7-8ebf-4489-a3b0-802b42aeabfb）Fig.3 Splicing prediction of LRRK2 gene c.4827+6T>A mutation

3 討論

PRKN基因（NM_004562.2）定位于染色體6q25.2q27，其突變導致編碼的parkin 蛋白功能喪失在常染色體隱性遺傳青少年帕金森綜合征（ARJP）的發(fā)病機制中起重要作用。Kitada[16]于1998年首次報道了導致常染色體隱性帕金森綜合征的PRKN基因的缺失突變。隨后，發(fā)現(xiàn)了該基因的多種突變，包括錯義突變、無義突變、截段、缺失、重復和移碼。目前已經(jīng)報道了400 多種已知的PRKN基因變異。這些突變可以以純合、雜合和復合雜合狀態(tài)存在，外顯子重排，包括缺失和重復，占致病變異的50%以上，比點突變或小的插入/缺失更有可能是致病變異，導致癥狀更早出現(xiàn)。

在這項研究中，筆者篩選了2 個患者中141個先前報道的與帕金森病、震顫、肌張力障礙和其他運動障礙相關的基因的點突變和缺失突變，在家系1 的先證者中發(fā)現(xiàn)了PRKN基因的無義突變與2 號外顯子缺失突變的新的復合雜合突變，家系共分離分析提示這2 種變異分別來自父母親，與疾病存在共分離。這些證實了新的復合雜合突變的PRKN基因是此EOPD 家庭的致病突變。家系2 的先證者存在的PRKN基因3～4 號外顯子純合缺失變異，推測可能來自于父母親，是一已知突變形式。與其他報道的攜帶此類突變的患者相比，本研究家系2 的患者臨床發(fā)病年齡更早，癥狀更重，病情進展更快?？赡芘c該患者存在LRRK2基因c.4827+6T>A 雜合變異及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492* 雜合無義變異有關。筆者運用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)LRRK2 基因的c.4827+6T>A 變異可能導致其剪切改變（圖3）。

由PRKN基因編碼的parkin 蛋白由465 個氨基酸組成，包括N 端的一個Ub 樣（Ubl）結構域和4 個環(huán)樣結構域。作為E3 泛素（Ub）連接酶，parkin 與E1（Ub 激活）和E2（Ub 結合）共同參與蛋白酶體降解蛋白異常積累的泛素化。parkin 功能障礙會損害線粒體的生物合成，導致線粒體功能降低，而受損線粒體的積累導致多巴胺能神經(jīng)元變性[17]，Parkin 可與PINK1 及LRRK2 蛋白相互作用，在線粒體自噬及囊泡運輸?shù)燃毎δ芷鹬匾饔?，一種蛋白的功能障礙會影響與其互作的蛋白質(zhì)功能[18]。本研究家系2 的患者比其他報道的攜帶此類突變的患者的臨床發(fā)病年齡更早，癥狀更重，病情進展更快，推測可能是因為同時存在Parkin、PINK1 及LRRK2 突變，對細胞功能影響更大有關。這有待于進一步的蛋白質(zhì)功能研究。

本研究的主要局限是樣本量小。因此，表型分析的結果可能會有一定的偏差，需要進行更大樣本量的進一步研究或多中心研究來驗證報告的發(fā)現(xiàn)。其次，研究突變的蛋白質(zhì)功能改變是從預測軟件中獲得的。雖然預測軟件可以幫助筆者了解這些變異的功能，但最終需要具體的功能研究來驗證它們在PRKN基因相關PD 中的作用。本研究首次報道了1 個EOPD 家系存在PRKN基因2 號外顯子缺失變異和c.619G>T/p.Glu207Ter*變異的復合雜合變異。在另外1 個EOPD 家系首次發(fā)現(xiàn)了PRKN基因3～4 號外顯子純合缺失合并LRRK2基因c.4827+6T>A 雜合變異及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492* 雜合變異。然而，這項研究有一些局限性，筆者在一個家系中無法從先證者的父親、母親及其他家庭成員那里采集血樣。后續(xù)將繼續(xù)隨訪這個家庭的所有成員。

綜上，筆者在2 例EOPD 病患者中發(fā)現(xiàn)了PRKN基因新的復合雜合變異。比較2 例患者的臨床癥狀還發(fā)現(xiàn)，存在PRKN基因突變合并PD其他致病基因變異患者的臨床發(fā)病年齡更早，癥狀更重更復雜，病情進展更快。提示EOPD患者具有典型的臨床異質(zhì)性及遺傳異質(zhì)性。