喉痛靈顆粒HPLC特征圖譜及多指標(biāo)成分含量測(cè)定研究

劉利輝 盧向紅 陸才洋

【摘 要】 目的：建立喉痛靈顆粒HPLC特征圖譜并測(cè)定尿苷、鳥(niǎo)苷（R，S）-告依春、腺苷四個(gè)指標(biāo)性成分的含量，為喉痛靈顆粒的質(zhì)量控制提供參考。方法：采用Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫：30 ℃；流速：0.9 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量10 μL；通過(guò)相似度評(píng)價(jià)結(jié)合聚類(lèi)分析對(duì)10批喉痛靈顆粒特征圖譜進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，并對(duì)其中的4個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定研究。結(jié)果：建立了喉痛靈顆粒的特征圖譜，共標(biāo)定了10個(gè)共有峰，10批樣品的指紋圖譜相似度在0.810～0.943；尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷分別在2.78～27.15 μg·mL-1、2.25～19.07 μg·mL-1、2.93～30.42 μg·mL-1、2.02～20.97 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 8），平均加樣回收率為95.26%～103.79%，RSD為0.90%～1.72%。通過(guò)聚類(lèi)分析，10批樣品聚成二類(lèi)。結(jié)論：建立的喉痛靈顆粒特征圖譜及4個(gè)指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、可靠、重復(fù)性好，可為綜合評(píng)價(jià)喉痛靈顆粒的質(zhì)量提供參考。

【關(guān)鍵詞】 喉痛靈顆粒；特征圖譜；尿苷；鳥(niǎo)苷；（R，S）-告依春；腺苷

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? ? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）08-0039-06

Abstract：Objective To establish a method for characteristic chromatogram of Hutongling granules and to detetmine the contents of four index components， uridine， guanosine， （R，S）-goitrin and adenosine，and provide reference its quality control.Methods Shim-pack VP-ODS （4.6mm×250mm， 5 μm） column was used，the mobile -phase was methanol（A）-water（B）with gradient elution.The flow rate was 0.9mL·min-1，the column temperature was 30 degrers， the detection wavelengths was 254 nm，and the injection volume was 10 μL. The similarity evaluation combined with cluster analysis was used to analyze and evaluate the characteristic map of 10 batches of Houtongling granules， and the contents of 4 index components were determined. Results The characteristic spectrum of Houtongling granules was established， and 10 common peaks were calibrated. The similarity of common peaks of 10 batches of samples ranged from 0.810 to 0.943.Uridine， guanosine， （R，S）-goitrin and adenosine had good linear relationship in the ranges of 2.78-27.15 μg·mL-1， 2.25-19.07 μg·mL-1， 2.93-30.42 μg·mL-1 and 2.02-20.97 μg·mL-1， respectively. The correlation coefficients were all more than 0.9998.The average recoveries varied from 95.26% to103.79%with the RSDs of 0.90%-1.72%.All the 10 batches of samples could be classified into two clusters.Conclusion The established characteristic chromatograms of Hutongling granule and the method for the determination of 4 index components are simple， reliable and reproducible， which can provide a reference for the comprehensive evaluation of the quality of Hutongling granules.

Key words：Houtongling Granules；Characteristic Chromatograms；Uridine；Guanosine；（R，S）-goitrin；Adenosine

喉痛靈顆粒是回春堂藥業(yè)股份有限公司的拳頭產(chǎn)品，由水牛角濃縮粉、板藍(lán)根、野菊花、荊芥穗四味中藥組成，具有清熱解毒，消炎利咽止痛的功效，臨床上主要用于咽喉炎、急性化膿性扁桃體炎、感冒發(fā)熱、上呼吸道感染等［1］。水牛角濃縮粉為君藥，其有效成分為蛋白質(zhì)、多肽、生物堿類(lèi)等，有清熱解毒、涼血、定驚等功效［2-3］。板藍(lán)根為臣藥且是處方中投料量最大的藥物，其主要活性成分為尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷核苷類(lèi)和表告依春生物堿類(lèi)，具有抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、增強(qiáng)免疫和解熱等藥理作用［4］。喉痛靈顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第五冊(cè)WS3-B-1041-91）》，標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀和3個(gè)理化鑒別項(xiàng)目，無(wú)含量測(cè)定方法?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在以HPLC法測(cè)定喉痛靈顆粒中腺苷、蒙花苷、迷迭香酸、綠原酸等單一成分或幾個(gè)成分的含量以及對(duì)板藍(lán)根和荊芥穗的薄層鑒別方面［5-7］。喉痛靈顆粒為中藥復(fù)方制劑，成分組成復(fù)雜，單一成分或幾個(gè)成分的含量測(cè)定難以全面真實(shí)地控制產(chǎn)品質(zhì)量，而中藥特征圖譜技術(shù)結(jié)合含量測(cè)定的方法具有整體、多元質(zhì)控的特點(diǎn)，能夠更全面反映中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量［9-10］。因此本實(shí)驗(yàn)建立喉痛靈顆粒HPLC特征圖譜及多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，為其整體質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2659（Empower3色譜數(shù)據(jù)工作站，美國(guó) Waters 公司），XSE205型電子分析天平（METTLER公司）， AUY120型電子天平（SHIMADZU），超聲波清洗器（型號(hào)KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司，200w，40kHz）。

喉痛靈顆粒均由回春堂藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)分別為20210113（S1）、20210403（S2）、20210503（S3）、20210505（S4）、20210903（S5）、20210907（S6）、20210911（S7）、20211002（S8）、20211003（S9）、20220304（S10）；尿苷（批號(hào)110887-202104，99.6%）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)111977-201501，93.6%）、腺苷（批號(hào)110879-201703，99.7%）、橙皮苷（批號(hào)110721-202019，95.3%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，（R，S）-告依春（批號(hào)B20104，98%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；甲醇（TEDIA，色譜純）；屈臣氏蒸餾水。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B）梯度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：0.9 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量10μL。梯度洗脫條件：0～20 min，3%～10%A；20～30 min，10%～30% A；30～35 min，30%～35%A；35～56 min，35%～70%A；56～65 min，70%～72%A。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷、橙皮苷適量，分別置各50mL棕色容量瓶中，加入30%甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，分別制成尿苷0.1392 mg·mL-1、鳥(niǎo)苷 0.0978 mg·mL-1、（R，S）-告依春0.1950 mg·mL-1、腺苷0.1344 mg·mL-1、橙皮苷0.1001 mg·mL-1單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存，備用。再分別精密吸取尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.80 mL、0.90 mL、0.60 mL、0.60 mL置同一10 mL量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備? 取喉痛靈顆粒（批號(hào)20211002）研細(xì)，混勻，精密稱定1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲0.5 h（200 w，40 kHz），放置室溫，再稱定重量，用30%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)慮，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 由于尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷是四味藥中的共有成分，（R，S）-告依春是板藍(lán)根和水牛角濃縮粉的共有成分，因此按喉痛靈顆粒的制備工藝分別制備（R，S）-告依春陰性樣品（缺板藍(lán)根、水牛角濃縮粉），尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷陰性樣品（缺板藍(lán)根、野菊花、荊芥穗、水牛角濃縮粉），并按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法處理，得到相應(yīng)的陰性樣品溶液。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取喉痛靈顆粒（批號(hào)20211002）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄圖譜的保留時(shí)間和峰面積，以8號(hào)峰腺苷作為參照峰（S），計(jì)算10個(gè)共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積及相似度。結(jié)果精密度試驗(yàn)圖譜的相似度結(jié)果均為1.0，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.32% ，共有峰相對(duì)峰面積的RSD均小于2.71%，說(shuō)明儀器精密度良好，符合特征圖譜要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取喉痛靈顆粒（批號(hào)20211002）供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，分別記錄圖譜的保留時(shí)間和峰面積，以8號(hào)峰腺苷作為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積與相對(duì)保留時(shí)間及相似度。結(jié)果共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于2.10%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.38%，相似度大于0.999，說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取喉痛靈顆粒（批號(hào)20211002）供試品，按照“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以8號(hào)峰腺苷作為參照峰（S），計(jì)算各色譜峰的相對(duì)峰面積與相對(duì)保留時(shí)間及相似度。樣品色譜圖的相似度達(dá)0.997以上，相對(duì)峰面積RSD均小于2.82%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.70%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 共有模式建立及相似度評(píng)價(jià) 10批喉痛靈顆粒樣品，編號(hào)為S1～S10。分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣并記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012年版）對(duì)10批樣品的色譜分析，以S1樣品（批號(hào)20210113）為參考圖譜，時(shí)間寬度設(shè)為0.5 min，采用多點(diǎn)校正自動(dòng)匹配模式，以中位數(shù)生產(chǎn)法得到對(duì)照?qǐng)D譜（圖1），并建立10批喉痛靈顆粒的共有模式圖（圖2）。S1～S10樣品與對(duì)照特征圖譜的相似度結(jié)果分別為0.810、0.871、0.889、0.897、0.888、0.902、0.929、0.815、0.854、0.944。

2.3.5 共有峰的指認(rèn)及相對(duì)峰面積的計(jì)算 通過(guò)相似度軟件對(duì)10批喉痛靈顆粒的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析共標(biāo)定有10個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出5個(gè)共有峰，分別為尿苷（4號(hào)峰）、鳥(niǎo)苷（6號(hào)峰）、（R，S）-告依春（7號(hào)峰）、腺苷（8號(hào)峰）、橙皮苷（10號(hào)峰），選擇峰型較好，與相鄰色譜峰分離完全、穩(wěn)定性較好的腺苷作為參照峰，計(jì)算10個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.6 喉痛靈顆粒指紋圖譜聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析是將樣本個(gè)體或指標(biāo)變量按其具有的特性進(jìn)行分類(lèi)的統(tǒng)計(jì)方法。利用spss22.0軟件，將10批樣品共有峰峰相對(duì)面積為變量，以Euclidean距離平方為測(cè)度，Z標(biāo)準(zhǔn)化，采用組間連接法進(jìn)行Q型聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖3。在類(lèi)間距為15時(shí)10批樣品分成2類(lèi)：S1、S2、S3、S10聚為一類(lèi)，S4、S5、S6、S7、S8、S9聚為另一類(lèi)，說(shuō)明不同批次間的樣品整體質(zhì)量有一定的差異性。

2.6? 喉痛靈顆粒中4個(gè)指標(biāo)性成分含量測(cè)定

2.6.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、喉痛靈顆粒供試品溶液及各陰性樣品溶液各10 μL，注入色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖（圖4）。結(jié)果表明，在此色譜條件下，尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷的理論塔板數(shù)分別為 11 147、20 440、24 156、11 362；各所測(cè)成分分離度分別為3.2、2.1、6.2、16.6；陰性無(wú)干擾。

2.6.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成含尿苷2.78、5.57、11.14、16.71、20.89、27.15 μg·mL-1；鳥(niǎo)苷2.25、4.40、8.80、11.74、14.67、19.07 μg·mL-1；（R，S）-告依春2.93、5.85、11.70、18.72、23.40、30.42 μg·mL-1；腺苷2.02、4.03、8.06、12.90、16.13、20.97 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸收上述混合標(biāo)溶液各10μL，注入HPLC測(cè)定，以進(jìn)樣濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程（如表2），結(jié)果表明4個(gè)成分進(jìn)樣濃度在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)同一混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷峰面積的RSD分別為1.9%、1.7%、1.5%、1.5%，表明儀器的精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份喉痛靈顆粒供試品液（批號(hào)20211002），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷峰面積的RSD分別為0.9%、1.6%、2.0%、0.3%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批喉痛靈顆粒（批號(hào)20211002）供試品，按照“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。測(cè)得尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷平均含量分別為0.2813 mg·g-1、0.1545 mg·g-1、0.2948 mg·g-1、0.2516 mg·g-1，RSD分別為1.53%、1.17%、0.76%、1.27%，表明儀器的方法的重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的喉痛靈顆粒粉末（批號(hào)20211002）0.5 g，共6份，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告依春、腺苷儲(chǔ)備液的體積為0.95 mL、0.90 mL、0.75 mL、0.90 mL，按上述“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析進(jìn)樣，記錄色譜圖。計(jì)算得到尿苷、鳥(niǎo)苷、（R，S）-告伊春、腺苷的平均回收率分別為95.26%、96.27%、100.70%、103.79%；RSD分別為1.72%、1.23%、0.90%、1.43%（n=6）。

2.6.7 樣品含量測(cè)定 取10個(gè)批次的喉痛靈顆粒各3份，每份1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得各批樣品的平均含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明：各批次喉痛靈顆粒各相關(guān)成分含量都有一定差異，尤其是（R，S）-告依春，而告依春又是發(fā)揮抗病毒藥理活性的關(guān)鍵成分，因此非常有必要建立可靠的質(zhì)量控制方法控制有效成分的含量。

3 討論

實(shí)驗(yàn)中分別比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.02%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水等不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)對(duì)各種色譜圖的比較，最后確定甲醇-水為流動(dòng)相；同時(shí)考察了不同流速、柱溫、色譜柱以及不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)圖譜的影響，最終確定了本文所述的色譜條件。通過(guò)優(yōu)選，采用30%甲醇為提取溶劑、超聲0.5 h為供試品溶液的制備方法。該制備方法既控制了雜質(zhì)成分的量又保證有效成分的提取效果。

本實(shí)驗(yàn)中由于喉痛靈顆粒藥味多、制備工藝為傳統(tǒng)的水提醇沉的方式，化學(xué)成分多且復(fù)雜，主要為核苷、氨基酸、多糖、生物堿等一些水溶性成分，而告依春卻是硫代葡萄糖酸鹽的水解產(chǎn)物，與尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷水溶性核苷類(lèi)成分化學(xué)性質(zhì)差異大，因此需采用梯度洗脫的方式來(lái)優(yōu)化色譜條件。特征圖譜技術(shù)是一種可以綜合評(píng)價(jià)復(fù)雜多組分化學(xué)成分的質(zhì)量控制方法。實(shí)驗(yàn)中建立的特征圖譜結(jié)合含量測(cè)定的方法具備定性和定量雙重作用，能更好地把控喉痛靈顆粒的整體質(zhì)量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，喉痛靈顆粒雖為同一生產(chǎn)廠家，但各批次間的圖譜和各指標(biāo)性成分的含量都有一定的差別，一方面可能跟每個(gè)批次的制劑不是來(lái)自同一批次的藥材有關(guān)，另一方面可能是在工藝制備過(guò)程中造成了有效成分損失，因此為提高喉痛靈顆粒的整體質(zhì)量，需嚴(yán)控中藥飲片質(zhì)量，同時(shí)還需進(jìn)一步優(yōu)化最佳的生產(chǎn)工藝參數(shù)。

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（收稿日期：2022-08-18 編輯：劉 斌）