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    低交聯(lián)透明質酸與再生材料聯(lián)合應用的相容性評估

    2023-06-07 07:17:46費松吳偉東王瑛古佳升桃卓嫣方明星李丹
    醫(yī)學美學美容 2023年8期
    關鍵詞:透明質酸聚乳酸葡聚糖

    費松 吳偉東 王瑛 古佳升 桃卓嫣 方明星 李丹

    【摘 要】目的 評估小分子透明質酸與β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石聯(lián)合應用的組織相容性。方法Wistar大鼠18只隨機分為3期實驗各6只,于背部劃分4個部位,根據(jù)注射不同配方的試劑分為4組。對照組注射小分子透明質酸1.00 ml,葡聚糖組注射0.25 ml小分子透明質酸+0.75 mlβ-葡聚糖,聚乳酸組注射0.25 ml小分子透明質酸+0.75 ml聚乳酸,羥基磷灰石組注射0.25 ml小分子透明質酸+0.75 ml羥基磷灰石,分別于注射7、14、28 d后處死大鼠,取其注射部位組織制成切片,經(jīng)HE染色后觀察免疫反應,免疫印跡法檢測第三期實驗大鼠皮膚組織中白介素1的表達水平。結果 7 d實驗中聚乳酸及羥基磷灰石組表現(xiàn)出輕微的免疫反應,14 d實驗中各組的免疫反應均呈上升趨勢,28 d實驗中各組的免疫反應均消退;免疫印跡法結果顯示,28 d實驗中三組注射部位的IL-1均低表達,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 小分子透明質酸與β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石的聯(lián)合應用具有較好的組織相容性。

    【關鍵詞】透明質酸;β-葡聚糖;聚乳酸;羥基磷灰石

    中圖分類號:R318.08 文獻標識碼:A 文章編號:1004-4949(2023)08-0095-04

    Compatibility Evaluation of Low Cross-linked Hyaluronic Acid Combined with Recycled Materials

    FEI Song1, WU Wei-dong 1, WANG Ying2, GU Jia-sheng1, TAO Zhuo-yan1, FANG Ming-xing1, LI Dan1

    (1.Department of Cardiothoracic Surgery, Guangzhou Red Cross Hospital of Jinan University, Guangzhou 510000, Guangdong, China; 2.Guangzhou Xiao Man Yao Medical Equipment Co., Ltd., Guangzhou 510000, Guangdong, China)

    【Abstract】Objective To evaluate the histocompatibility of small molecular hyaluronic acid combined with β-glucan, polylactic acid and hydroxyapatite. Methods Eighteen Wistar rats were randomly divided into three phases of experiments, with 6 rats in each phase. Four parts were divided on the back and divided into 4 groups according to different formulations of reagents. The control group was injected with 1.00 ml of small molecular hyaluronic acid, the dextran group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of β-glucan, the polylactic acid group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of polylactic acid, and the hydroxyapatite group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of hydroxyapatite. The rats were sacrificed after 7, 14 and 28 days of injection, and the tissues at the injection site were taken and made into sections. The immune response was observed after HE staining, and the expression level of interleukin 1 in the skin tissue of the third phase of the experimental rats was detected by Western blotting. Results In the 7 d experiment, the polylactic acid and hydroxyapatite groups showed a slight immune response. In the 14 d experiment, the immune response of each group showed an upward trend, and the immune response of each group subsided in the 28 d experiment. The results of immunoblotting showed that the expression of IL-1 in the injection site of the three groups was low in the 28 d experiment, and the difference was not statistically significant (P>0.05). Conclusion The combination of small-molecule hyaluronic acid with β-glucan, polylactic acid and hydroxyapatite has good histocompatibility.

    【Key words】Hyaluronic acid; β-glucan; Polylactic acid; Hydroxyapatite

    皮膚的彈性和水分會隨著年齡的增長或受周圍環(huán)境的影響引起水分和膠原的流失[1],為解決這一問題,醫(yī)學上多采用皮下注射填充物來保障水分的保持或促進組織膠原的生成。目前醫(yī)學上使用較多的皮下填充產(chǎn)品有透明質酸、β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石鈣等。各種材料都有其特點,也有不足之處,材料與材料間的聯(lián)合應用或聯(lián)合微針等方式可獲得更好的治療效果。透明質酸已經(jīng)廣泛用于皮膚美容[2],通過與其他材料聯(lián)合應用或聯(lián)合其他療法,可提高療效[3],同時也可能引起一系列的不良反應,如血管栓塞、感染、組織壞死等。因此,為評價不同皮下填充材料的生物安全性,本實驗將以小分子透明質酸為對照組,小分子透明質酸聯(lián)合β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石等已經(jīng)在市面上廣泛使用的填充材料為實驗組,于大鼠皮下注射,觀察不良反應和微觀下免疫反應,通過各組注射材料的結果互相比較,以評估聯(lián)合應用材料的安全性。

    1.1 實驗動物 SPF級 Wistar 大鼠18只(購自南方醫(yī)科大學實驗動物管理中心),周齡6周,體重(200±20)g,動物實驗按照《國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理與使用指南》進行,倫理號HTSW211103。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境:室溫(25±2)℃,相對濕度(50±5)%,12 h明暗交替,分籠飼養(yǎng),自由攝食飲水,飼養(yǎng)7 d。

    1.2 試劑與儀器 小分子透明質酸(廣州小蠻腰醫(yī)療器械有限公司);β-葡聚糖(廣州小蠻腰醫(yī)療器械有限公司);聚乳酸;羥基磷灰石;白介素1(IL-1)和GADPH兔一抗抗體(博奧森),IL-1和GADPH羊抗兔二抗抗體(博奧森);無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司);二甲苯(天津市富宇精細化工有限公司);伊紅染液、蘇木素染液、中性樹膠(谷歌生物科技有限公司);顯微鏡(上海通灝光電科技有限公司);攤烤片機(湖北安立信醫(yī)療實業(yè)有限公司);脫水機(武漢俊杰電子有限公司);包埋機(武漢俊杰電子有限公司)。

    1.3 實驗分組 18只大鼠編號后采用隨機數(shù)字表法分為3期實驗,每期各6只,分別為7 d一期實驗、 14 d二期實驗和28 d三期實驗,大鼠背部各選取4個注射點,注射間隔1 cm以上,注射劑量均為1 ml,根據(jù)注射材料不同分為4組。對照組注射小分子透明質酸1 ml;葡聚糖組注射小分子透明質酸0.25 ml+β-葡聚糖0.75 ml;聚乳酸組注射小分子透明質酸0.25 ml+聚乳酸0.75 ml;羥基磷灰石組注射小分子透明質酸0.25 ml+羥基磷灰石0.75 ml。

    1.4 實驗方法 18只大鼠禁食12 h、禁水4 h后,稱重,采用7%水合氯醛(劑量:0.03 ml/kg)進行腹腔注射麻醉。麻醉成功后對大鼠背部皮膚進行備皮,選取脊柱旁兩側約2 cm 皮下組織為注射中心點,以注射點中心劃分1.5 cm寬度的正方形區(qū)域使用記號筆標注,一只大鼠背部脊柱兩側分別標注4個區(qū)域。經(jīng)75%醫(yī)用酒精擦拭皮膚表面消毒;利用30 G注射針頭斜面向上刺入表皮至皮下組織層,回抽無回血后進行注射,每個部位注射對應的劑量為1 ml,射后予以輕度按摩使材料分布更均勻。注射完成后常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)飼養(yǎng),于7、14、28 d后,分別采用脊髓脫臼法處死對應實驗組的大鼠,去除大鼠背部毛發(fā),對標記筆標注的注射區(qū)域用手術刀切開皮膚全層,拍照記錄,使用蚊式鉗鈍性分離剩余的注射材料及周圍組織,保持包膜完整。

    1.4.1蘇木精-伊紅染色法 用組織剪剪取殘余的皮下組織,于10%甲醛溶液中固定48 h。流水緩慢沖洗4~8 h以洗去甲醛;將包埋塊裝在一個網(wǎng)兜里,放入70%乙醇過夜。第2天,依次放入80%、90%、100% A、100% B乙醇浸泡各1 h,二甲苯A、二甲苯B各浸泡30 min,至組織塊呈現(xiàn)棕黃色或暗紅色透明狀,放入水浴機石蠟缸A、B、C各1.5 h(60 ℃),包埋塊和包埋模具放入包埋儀至少30 min,包埋后關閉水浴箱,使用萊卡切片機切片,厚度為4 μm,45 ℃攤片,烤片機75 ℃烤片60 min。將石蠟切片放入染色盒,用二甲苯A、B、C各脫蠟5 min。依次100%、95%、80%、70%的酒精,入蒸餾水2次,5 min/次。蘇木素染核1 min,流水沖洗干凈,0.1%鹽酸酒精分化10 s,入蒸餾水放置10 min。0.5%伊紅染色1 min,流水沖洗干凈,入蒸餾水3 min,取出玻片放在通風櫥里晾干。用中性樹膠對晾干的組織切片進行封片。在光學顯微鏡下找到目標部位,拍照。

    1.4.2免疫印跡法 將用組織剪剪取皮下組織后提取組織總蛋白,采用BCA法進行蛋白定量后將蛋白樣品調至等濃度,SDS-PAGE電泳,轉膜后,4 ℃冰箱孵育IL-1和GADPH-抗過夜,與相應二抗室溫下孵育2 h,ECL顯影,拍照,進行圖像分析。以Image J 軟件分析蛋白條帶得到的灰度值表示IL-1蛋白的相對表達水平,以GADPH為內參,實驗重復 3 次以上,取平均值。

    1.5 組織學評價 皮膚對材料的免疫反應的程度按照2015國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗中心,醫(yī)療器械生物學評價第6部分:植入后局部反應試驗半定量評分系統(tǒng)中的生物學反應評價標準,根據(jù)細胞類型/反應、新血管生成、纖維化、脂肪浸潤等情況進行評價,實驗組評分減去對照組的評分,得到的差值作為判斷材料對組織的刺激等級,具體判定標準為:無刺激:0~2.9分;輕度刺激:3.0~8.9分;中度刺激:9.0~15.0分;重度刺激:>15.0分。

    1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以(x-±s)表示,多組間比較行F檢驗;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    術后大鼠進食,活動均正常,術后背部局部無明顯腫脹,所有實驗動物均存活。

    2.1 皮膚組織大體觀 皮膚外可見注射材料所在部位有輕微凸起,無明顯紅腫、壞死、化膿。皮下解剖可見清晰的血管形狀,注射材料所在部位的周圍組織與其他部位組織無明顯改變,無血管栓塞、組織壞死等表現(xiàn),見圖1。

    2.2 生物反應評價 每期實驗6只大鼠相同材料部位的評分取平均值,刺激平均評分=實驗組平均評分-對照組平均評分,結果見表2。7 d實驗中,各組刺激性分級情況均低;14 d實驗中,與對照組相比,葡聚糖組、聚乳酸組及羥基磷灰石組刺激分級均表現(xiàn)出一定的刺激性;28 d實驗中,各組的刺激性分級情況均偏低,且呈下降趨勢,見表1。

    2.3 術后三期實驗各組材料注射部位宿主反應 7 d實驗中,對照組僅有少量炎細胞浸潤;葡聚糖組除少量炎細胞外,還有一些纖維形成;聚乳酸組出現(xiàn)大量的炎細胞,纖維囊壁形成廣泛且排列紊亂,羥基磷灰石中的炎細胞程度輕微,可見少許血管。14 d實驗中,對照組的炎細胞較前減輕,且開始出現(xiàn)纖維層;葡聚糖組的炎細胞繼續(xù)增加,且纖維層較前明顯增多增厚,排列整齊,出現(xiàn)少許新生血管;聚乳酸組的炎細胞更為明顯,且纖維層較前整齊,出現(xiàn)大量的新生血管;羥基磷灰石的炎細胞反應較前減退,且纖維較前增厚,且紊亂。28 d實驗中,對照組的纖維層繼續(xù)增厚增多,炎細胞沒有繼續(xù)上升的趨勢;葡聚糖組的炎性反應明顯下降,且纖維層繼續(xù)增多增粗,排列整齊;此外,可見大量小血管生成;聚乳酸組炎細胞較前輕微,纖維層繼續(xù)增粗但排列紊亂,未見14 d時豐富的新生小血管;羥基磷灰石組幾乎不可見血管生成,炎細胞消退,纖維層較對照組明顯薄弱。HE染色實驗切片見圖2。

    2.4 IL-1的表達水平 免疫印跡法結果顯示,28 d實驗中三組注射部位的IL-1均呈低表達,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,F(xiàn)=2.101),見圖3。

    透明質酸是一種細胞外基質的天然糖胺聚糖,具有良好的保濕功能,能夠改善皮膚干燥粗糙、毛孔粗大等問題[4]。β-葡聚糖是一種以糖苷鍵連接的同型多糖,不僅能作為血漿替代物,還能增強免疫細胞活性,促進傷口愈合,同時可延緩皮膚老化,是一種良好的皮膚填充材料。聚乳酸是從可再生植物中提取發(fā)酵而來的聚合物,對人體無毒無害,且生物相容性良好,可降解,作為一種醫(yī)學高分子材料,常用于組織修復。

    本次三期實驗中發(fā)現(xiàn),所有實驗組均表現(xiàn)出一定的炎細胞及組織反應,但在28 d時均逐漸消退,各組均未表現(xiàn)出明顯的纖維化、組織紊亂、壞死,注射材料引起的免疫反應最后都基本消退,表現(xiàn)出良好的組織相容性。在生物反應性評價平均評分上看,葡聚糖組及聚乳酸組的評分在后兩期實驗中,特別是第二期的表現(xiàn)是要稍微高于其他兩組的,造成這種現(xiàn)象的原因主要是β-葡聚糖由于被免疫活性細胞膜上的受體識別,激活了包括巨噬細胞在內的免疫細胞等,促進細胞釋放白介素,因此白介素的表達水平較高。而聚乳酸在代謝過程中產(chǎn)生乳酸,刺激成纖維母細胞的增殖和膠原蛋白再生,在這個過程中產(chǎn)生了一定的免疫反應。透明質酸會在透明質酸酶及透明質酸降解蛋白(HYAL1和HYAL2)的參與下被降解,但這個過程并不會引起明顯的組織反應。透明質酸注射后能刺激轉化生長因子,結締組織生長因子等細胞因子的產(chǎn)生,促進膠原等細胞外基質的合成,表現(xiàn)出一定的纖維增生。β-葡聚糖在7、14 d實驗中引起免疫反應,一方面激活成纖維細胞,不斷分泌前膠原蛋白,并形成膠原纖維,另一方面使組織中的巨噬細胞數(shù)量增加,巨噬細胞促進組織成EGFR表皮生長因子和VEGF血管生成因子的分泌,兩者共同作用于內皮細胞,促進新生血管的形成。同時,28 d實驗中三組注射部位的IL-1均呈低表達,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),證實了透明質酸聯(lián)合其他材料注射的安全性良好。

    綜上所述,小分子透明質酸與β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石的聯(lián)合應用具有較好的組織相容性。

    [1] 杜克斯,李澤巧,張寶江,等.面部皮膚衰老的外觀變化及形成因素[J].日用化學工業(yè),2022,52(2):199-206.

    [2] 周劼,陳媛,宋長緒,等.透明質酸注射填充改善中面部輪廓低平的臨床研究[J].中國醫(yī)療美容,2022,12(7):16-19.

    [3] 王露茗,張杰,殷凌覽.590 nm和830 nm低能量光療聯(lián)合透明質酸在面部年輕化治療中的療效觀察[J]. 中國醫(yī)療美容,2022,12(9):15-18.

    [4] 雷曦,張蕊,黃遵錫,等.透明質酸酶的研究進展[J].微生物學通報,2021,48(3):882-895.

    [5] Wang S,F(xiàn)ontana F,Shahbazi MA,et al.Acetalated dextran based nano-and microparticles:synthesis,fabricat ion,and therapeutic applications[J].Chem Commun(Ca mb),2021,57(35):4212-4229.

    編輯 扶田

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