癌源性細(xì)胞外囊泡在皮膚鱗狀細(xì)胞癌診療中的研究進(jìn)展

楊雪瀅 李東霞 廉琛

【摘 要】皮膚鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）是世界上最常見的癌癥之一，盡管CSCC通常預(yù)后良好，但部分患者表現(xiàn)為局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，故積極尋求CSCC新的診斷及治療方法具有重要意義。細(xì)胞外囊泡（EV）是富含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，通過介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，在機(jī)體的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。EV與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是皮膚鱗癌早期診斷、靶向治療的潛在標(biāo)志物。本文對CSCC源性EV生物發(fā)生及其在CSCC診斷、預(yù)后、治療中的研究進(jìn)展作一綜述，旨在探討EV在CSCC臨床診斷和治療中的潛在價值。

【關(guān)鍵詞】皮膚鱗狀細(xì)胞癌；細(xì)胞外囊泡；Dsg2；RNA；P38

中圖分類號：R739.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）08-0172-04

Research Progress of Cancer-derived Extracellular Vesicles in the Diagnosis and Treatment of Cutaneous Squamous Cell Carcinoma

YANG Xue-ying1，2， LI Dong-xia1， LIAN Chen1，2

（1.Department of Dermatology and Venereal Disease， Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， Inner Mongolia， China； 2.Graduate School of Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， Inner Mongolia， China）

【Abstract】Cutaneous squamous cell carcinoma （CSCC） is one of the most common cancers in the world. Although CSCC usually has a good prognosis， some patients show local recurrence， lymph node metastasis， distant metastasis， etc. Therefore， it is of great significance to actively seek new diagnosis and treatment methods for CSCC. Extracellular vesicles （EVs） are rich in proteins， nucleic acids， lipids and other bioactive substances， which play an important role in the physiological and pathological processes of the body by mediating intercellular communication. EV is closely related to the occurrence and development of skin squamous cell carcinoma， and is a potential marker for early diagnosis and targeted therapy of skin squamous cell carcinoma. This article reviews the research progress of CSCC-derived EV biogenesis and its role in the diagnosis， prognosis and treatment of CSCC， aiming to explore the potential value of EV in the clinical diagnosis and treatment of CSCC.

【Key words】Cutaneous squamous cell carcinoma； Extracellular vesicles； Dsg2； RNA； P38

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是臨床第二常見的非黑素性皮膚腫瘤，臨床發(fā)病率高。雖然通常通過及時手術(shù)切除可以治愈，但大多數(shù)患者在確診時往往已是癌癥晚期，治療效果不佳、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差[1-3]。CSCC的危險因素有長期紫外線輻射、慢性潰瘍、皮膚慢性炎癥等[4-6]。細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）[7]是細(xì)胞經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”等一系列調(diào)控過程而形成的膜性囊泡，腫瘤細(xì)胞是EVs的積極生產(chǎn)者，癌源性EVs通過自分泌或旁分泌方式攜帶蛋白質(zhì)、基因等轉(zhuǎn)運(yùn)維持腫瘤生長所需的因子，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與周圍基質(zhì)組織之間的通信，參與癌癥的發(fā)展、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移和耐藥。與循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）和無細(xì)胞DNA（cfDNA）相比，EV具有較好的微創(chuàng)性、穩(wěn)定性和組織相容性，使其在癌癥液體活檢中可作為新的生物標(biāo)志物[8]。研究顯示[9]，癌源性EVs在CSCC的早期診斷、預(yù)后和治療中具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。本文就癌源性細(xì)胞外囊泡在皮膚鱗狀細(xì)胞癌診療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為其臨床診療提供參考。

EV是直徑為30～150 nm且具有脂質(zhì)雙分子層的膜性囊泡，根據(jù)其來源和大小可分為微囊泡、凋亡小體、外泌體，其主要成分包含外泌體（exosomes）。EVs可由多種人體細(xì)胞（包括腫瘤細(xì)胞）分泌并且在血液、尿液、唾液和其他體液中均可檢測到[10]。EVs含有來自其母細(xì)胞的選擇性結(jié)合分子，包括CD9、RNA（例如mRNA、miRNA、circRNA）、DNA和脂質(zhì)[11]。Desmoglin 2（Dsg2）是橋粒體細(xì)胞-細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)的組成部分，存在于所有上皮來源細(xì)胞中，具有上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖和遷移等多種生物學(xué)功能[12]。已有研究表明[13，14]，Dsg2在EV的生物發(fā)生、調(diào)節(jié)和生物學(xué)功能中起著關(guān)鍵作用。Flemming JP等[15]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)棕櫚?；疍sg2的A431-Dsg2/GFP腫瘤細(xì)胞中EV的釋放量增加了2倍。50 μM-溴棕櫚酸鹽（一種不可逆的棕櫚酰?；D(zhuǎn)移酶抑制劑）和Dsg2cacs轉(zhuǎn)染減輕了Dsg2的影響，從而消除了Dsg2的棕櫚?；４送?，免疫受損小鼠的A431-Dsg2/GFP異種移植導(dǎo)致腫瘤生長顯著加快和血漿EV水平升高，單劑量20 μg Dsg2調(diào)制的EV能夠增強(qiáng)A431-GFP異種移植的致瘤潛力。Overmiller AM等[16]證實Dsg2過表達(dá)增加了細(xì)胞分泌EV和EV相關(guān)蛋白密度。此外，用靶向Dsg2的shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)A431-Dsg2/GFP細(xì)胞可減弱這種效應(yīng)。由此說明，Dsg2是EV生物發(fā)生有效的調(diào)節(jié)物質(zhì)。

近年來EV作為液體活檢的一種無創(chuàng)診斷工具活躍于腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域，將基于EV的液體活檢用于某些高危患者的篩查和鑒別可能有助于早期發(fā)現(xiàn)并避免不必要的組織活檢。一項涉及139例早期胰腺癌、卵巢癌或膀胱癌癌癥患者的研究顯示[11]，使用基于細(xì)胞外囊泡蛋白的診斷性血液測試，曲線下的面積為0.95（敏感性71.2%，特異性99.5%）。EV RNA還可以檢測非小細(xì)胞肺癌并與小細(xì)胞肺癌相鑒別[17]。根據(jù)已有的研究結(jié)果，本文選擇CSCC中具有診斷潛力的兩種RNA分子（Ct-SLCO1B3和circ-CYP24A1）展開討論。

2.1 Ct-SLCO1B3 由于皮膚反復(fù)損傷，隱性遺傳營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥（RDEB）患者更容易發(fā)生侵襲性CSCC。Sun Y等[18]分析了體外培養(yǎng)的RDEB腫瘤和非RDEB腫瘤EV中腫瘤標(biāo)志物基因Ct-SLCO1B3的表達(dá)，結(jié)果顯示CtSLCO1B3僅在RDEB-SCC源性EV中表達(dá)，而在非癌性RDEB角質(zhì)形成細(xì)胞源性EV中不表達(dá)。由此說明，檢測EVs中的Ct-SLCO1B3的表達(dá)是臨床診斷RDEB患者是否發(fā)生侵襲性CSCC的一個很有前景的診斷生物標(biāo)志物。同時，有必要對CtSLCO1B3在患有CSCC的非RDEB患者的EV中的普遍性進(jìn)行更多的研究。

2.2 Circ-CYP24A1 Zhang Z等[19]使用RNA測序（RNA-seq）對CSCC患者血清中的外泌體環(huán)狀RNA（circRNA）進(jìn)行分析。與健康受試者相比，共檢測到7577種circRNA，其中25個表達(dá)上調(diào)，76個下調(diào)。這些circRNA構(gòu)成了2個獨特的RNA簇：介導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的基因和MHC蛋白復(fù)合物增強(qiáng)，而調(diào)節(jié)中心碳代謝、細(xì)胞成分組織和細(xì)胞周期的基因減少。而在第1簇中，circ-CYP24A1的增加程度最大。同時由于環(huán)狀結(jié)構(gòu)賦予RNase抗性使其在介導(dǎo)細(xì)胞通訊時能夠穩(wěn)定存在，所以circ-CYP24A1被認(rèn)為是CSCC的理想生物標(biāo)志物[19]，有望為CSCC治療提供新靶點。

隨著外泌體分離技術(shù)的敏感性提高，了解CSCC源性EV中特定存在的蛋白質(zhì)和基因有望成為腫瘤預(yù)防中有價值的生物標(biāo)志物。已有研究表明[20]，黑色素瘤源性EV上的PD1和PD-L1表達(dá)可預(yù)測檢查點抑制劑的耐藥性；EV mRNA可預(yù)測非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的生存期及不同治療方式的療效[17]。此外，EV DNA同時反映了原發(fā)腫瘤的染色體和線粒體DNA，可作為評估腫瘤基因組和預(yù)測預(yù)后的有力工具。

3.1 p38抑制的CSCC相關(guān)長基因間非編碼RNA（linc-PICSAR） Wang D等[21]探討了lnc PICSAR在順鉑耐藥CSCC和HSC-5細(xì)胞患者中的作用。與健康個體和順鉑敏感HSC-5細(xì)胞相比，觀察到從順鉑耐藥的CSCC患者和細(xì)胞系的中提取的EV中l(wèi)nc-PICSAR的數(shù)量顯著增加。lnc PICSAR通過抑制miR-485-5p直接參與順鉑耐藥性，進(jìn)而促進(jìn)REV3L基因表達(dá)。因此，CSCC患者血清源性EV中l(wèi)nc PICSAR的濃度可指導(dǎo)化療方案的選擇。

3.2 circ-CYP24A1 Zhang Z等[19]假設(shè)異常表達(dá)的EV circ-CYP24A1在CSCC中具有致瘤作用，通過觀察到A431和SCL-1細(xì)胞攝取circ-CYP24A1與pkh67標(biāo)記的EV共培養(yǎng)支持這一假設(shè)。發(fā)現(xiàn)circCYP24A1除具有診斷價值外，與腫瘤厚度呈微正相關(guān)（r=0.8689，P=0.0558），此外，轉(zhuǎn)染sicirc-CYP24A1的EV可敲除circ-CYP24A1，從而抑制CSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.3 DNA拷貝數(shù)改變（CNA） Nguyen B等[22]對2例轉(zhuǎn)移性CSCC患者和3例轉(zhuǎn)移性舌基SCC患者進(jìn)行了低覆蓋全基因組測序（FFPE）和血清EV DNA檢測。與粘膜SCC相比CSCC顯示更多的CNAs（25 vs 11.3個區(qū)域；1.225×109對4.433×108基對）和更多的FFPE CNAs重疊（16vs3個區(qū)域；3.25×108 vs 3.267×108基對）。盡管大多數(shù)CNA是缺失的，但EV-DNA中的重復(fù)區(qū)域可能更能反映FFPE-DNA中的突變。在兩個樣本中都發(fā)現(xiàn)了Chr 7p、8q和20q的重復(fù)，并且與已發(fā)表的侵襲性CSCC突變圖譜一致[24]。但是，由于EV-DNA來源于腫瘤和非腫瘤DNA，不同患者之間FFPE和EV-DNA相關(guān)性存在相當(dāng)大的異質(zhì)性。因此，是否可以使用EV的CNA譜來準(zhǔn)確檢測轉(zhuǎn)移性SCC，還需要更多的研究來驗證。

EV膜分子的共價和非共價修飾可以增強(qiáng)與靶細(xì)胞的特異性結(jié)合。這些外部修飾的EV已被用于在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等模型中輸送治療藥物[24，25]。在Overmiller AM等[16]研究中，當(dāng)人成纖維細(xì)胞與A431-Dsg2/GFP細(xì)胞共培養(yǎng)時，成纖維細(xì)胞GFP陽性比A431-GFP細(xì)胞多55%，這表明Dsg2可能促進(jìn)EV的攝取。因此，EV Dsg2修飾可以改善對CSCC微環(huán)境的治療效果。鑒于Dsg2在CSCC源性EV生物發(fā)生和功能中的重要性，靶向Dsg2翻譯的miRNA可能成為新的CSCC治療靶點，對藥物開發(fā)具有重要意義。

腫瘤源性EV中的生物標(biāo)志物包括DNA、RNA和表面相關(guān)蛋白，這些生物標(biāo)志物可促進(jìn)準(zhǔn)確的臨床診斷并提示癌癥預(yù)后。本文提到的研究已證實了CSCC源性EV Ct-OATP1B3 mRNA、circ-CYP24A1、linc-PICSAR和DNA CNA等靶分子的診斷和治療潛力，由于實驗數(shù)據(jù)有限，需要進(jìn)一步研究EV在CSCC病理生理中的作用以及CSCC源性EV的臨床相關(guān)性，以確立EV在CSCC診斷和治療中的臨床應(yīng)用價值。

[1] Que SKT，Zwald FO，Schmults CD.Cutaneous squamous cell carcinoma：Incidence，risk factors，diagnosis，and staging[J].J Am Acad Dermatol，2018，78（2）：237-247.

[2] Fremlin GA，Bray AP，de Berker DA.Clinical triage of cutaneous squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma to avoid treatment delay：value of an electronic booking system[J].Clin Exp Dermatol，2014，39（6）：689-695.

[3] Stratigos A，Garbe C，Lebbe C，et al.Diagnosis and treatment of invasive squamous cell carcinoma of the skin：European consensus-based interdisciplinary guideline[J].Eur J Cancer，2015，51（14）：1989-2007.

[4] Thompson AK，Kelley BF，Prokop LJ，et al.Risk Factors for Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Recurrence，Metastasis，and Disease-Specific Death：A Systematic Review and Meta-analysis[J].JAMA Dermatol，2016，152（4）：419-428.

[5] Hogue L，Harvey VM.Basal Cell Carcinoma，Squamous Cell Carcinoma，and Cutaneous Melanoma in Skin of Color Patients[J].Dermatol Clin，2019，37（4）：519-526.

[6] Tokez S，Venables ZC，Hollestein LM，et al.Risk factors for metastatic cutaneous squamous cell carcinoma：Refinement and replication based on 2 nationwide nested case-control studies[J].J Am Acad Dermatol，2022，87（1）：64-71.

[7] Doyle LM，Wang MZ.Overview of Extracellular Vesicles，Their Origin，Composition，Purpose，and Methods for Exosome Isolation and Analysis[J]. Cells，2019，8（7）：727.

[8] Wu JY，Li YJ，Hu XB，et al.Preservation of small extracellular vesicles for functional analysis and therapeutic applications a comparative evaluation of storage conditions[J].Drug Deliv，2021，28（1）：162-170.

[9] Lee IT，Shen CH，Tsai FC，et al.Cancer-Derived Extracellular Vesicles as Biomarkers for Cutaneous Squamous Cell Carcinoma：A Systematic Review[J]. Cancers （Basel），2022，14（20）：5098.

[10] Kumeda N，Ogawa Y，Akimoto Y，et al.Characterization of Membrane Integrity and Morphological Stability of Human Salivary Exosomes[J].Biol Pharm Bull，2017，40（8）：1183-1191.

[11] Hinestrosa JP，Kurzrock R，Lewis JM，et al.Earlystage multi-cancer detection using an extracellular vesicle protein-based blood test[J].Commun Med（Lond），2022，2：29.

[12] Sch？fer S，Koch PJ，F(xiàn)ranke WW.Identification of the ubiquitous human desmoglein，Dsg2，and the expression catalogue of the desmoglein subfamily of desmosomal cadherins[J].Exp Cell Res，1994，211（2）：391-399.

[13] Brennan-Crispi DM，Overmiller AM，TamayoOrrego L，et al.Overexpression of Desmoglein 2 in a Mouse Model of Gorlin Syndrome Enhances Spontaneous Basal Cell Carcinoma Formation through STAT3-Mediated Gli1 Expression[J].J Invest Dermatol，2019，139（2）：300-307.

[14] Overmiller AM，McGuinn KP，Roberts BJ，et al.c-Src/ Cav1-dependent activation of the EGFR by Dsg2[J].On cotarget，2016，7（25）：37536-37555.

[15] Flemming JP，Hill BL，Haque MW，et al.miRNAand cytokine-associated extracellular vesicles mediate squamous cell carcinomas[J].J Extracell Vesicles，2020，9（1）：1790159.

[16] Overmiller AM，Pierluissi JA，Wermuth PJ，et al.Desmoglein 2 modulates extracellular vesicle release from squamous cell carcinoma keratinocytes[J].FASEB J，2017；31（8）：3412-3424.

[17] Duréndez-Sáez E，Torres-Martinez S，Calabuig-Fari？as S，et al.Exosomal microRNAs in non-small cell lung cancer[J].Transl Cancer Res，2021，10（6）：3128-3139.

[18] Sun Y，Woess K，Kienzl M，et al.Extracellular Vesicles as Biomarkers for the Detection of a Tumor Marker Gene in Epidermolysis Bullosa-Associated Squamous Cell Carcinoma[J].J Invest Dermatol，2018，138（5）：1197-1200.

[19] Zhang Z，Guo H，Yang W，et al.Exosomal Circular RNA RNA-seq Profiling and the Carcinogenic Role of Exosomal circ-CYP24A1 in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma[J].Front Med （Lausanne），2021，8：675842.

[20] Serratì S，Guida M，Di Fonte R，et al.Circulating extracellular vesicles expressing PD1 and PD-L1 predict response and mediate resistance to checkpoint inhibitors immunotherapy in metastatic melanoma[J]. Mol Cancer，2022，21（1）：20.

[21] Wang D，Zhou X，Yin J，et al.Lnc-PICSAR contributes to cisplatin resistance by miR-485-5p/REV3L axis in cutaneous squamous cell carcinoma[J].Open Life Sci，2020，15（1）：488-500.

[22] Nguyen B，Wong NC，Semple T，et al.Low-coverage whole-genome sequencing of extracellular vesicleassociated DNA in patients with metastatic cancer[J]. Sci Rep，2021，11（1）：4016.

[23] Pickering CR，Zhou JH，Lee JJ，et al.Mutational landscape of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res，2014，20（24）：6582-6592.

[24] Li Y，Gao Y，Gong C，et al.A33 antibody-functionalized exosomes for targeted delivery of doxorubicin against colorectal cancer[J].Nanomedicine，2018，14（7）：1973-1985.

[25] Li S，Wu Y，Ding F，et al.Engineering macrophage-derived exosomes for targeted chemotherapy of triple-negative breast cancer[J].Nanoscale，2020，12（19）：10854-10862.

編輯 張孟麗