宏基因二代測序技術(shù)在肺部感染病原學(xué)檢測中應(yīng)用的研究進(jìn)展

李 俏, 蘇振中, 許璐璐, 張 捷

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，吉林 長春 130041;2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 蘇州 215000）

肺部感染是呼吸系統(tǒng)常見疾病之一，病原學(xué)檢查結(jié)果的準(zhǔn)確與否直接決定肺部感染性疾病的臨床治療效果。傳統(tǒng)病原微生物檢測技術(shù)在臨床上應(yīng)用較廣泛，例如血清學(xué)檢測、病原體培養(yǎng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 等，但是仍有較多缺陷，如檢測所用時間長、易受廣譜抗菌藥物影響和與引物不匹配的微生物檢測受限等。傳統(tǒng)病原微生物檢測技術(shù)的諸多缺陷使其應(yīng)用受到限制，特別是對不常見的病原體和培養(yǎng)條件苛刻的致病菌，給肺部感染性疾病的精準(zhǔn)診斷及治療帶來挑戰(zhàn)。

近年來第二代測序技術(shù)不斷發(fā)展，宏基因二代測 序 （metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術(shù)已應(yīng)用于感染性疾病病原學(xué)檢測，如呼吸道感染、血液感染、關(guān)節(jié)腔感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和胃腸道感染等，能夠快速檢出致病病原體，指導(dǎo)靶向抗菌治療［1-4］。mNGS 技術(shù)有助于檢測傳統(tǒng)檢測方法難以檢出的致病菌，亦有助于提高新型病原體的檢測水平。mNGS 技術(shù)通過對從支氣管 肺 泡 灌 洗 液 （bronchoalveolar lavage fluid，BALF） 中提取的RNA 進(jìn)行測序，從而迅速鑒定了新型冠狀病毒［5］，mNGS 技術(shù)現(xiàn)已較普遍應(yīng)用于感染性疾病病原的檢測，如鉤端螺旋體［6］和鸚鵡熱衣原體［7］等。

mNGS 技術(shù)通過對病原體進(jìn)行無假設(shè)、無偏倚和可定量的檢測［8］，實現(xiàn)了高效及準(zhǔn)確的病原體檢測，在肺部感染性疾病中的應(yīng)用價值也逐漸顯現(xiàn)，為肺部感染性疾病的精準(zhǔn)診斷提供了新思路。目前mNGS 技術(shù)在國內(nèi)外也廣泛應(yīng)用于肺部感染性疾病病原體物種的鑒定和耐藥基因研究等。本文作者分析mNGS 技術(shù)在不同類型微生物所致肺部感染性疾病中的應(yīng)用及其在肺部感染性疾病不同類型樣本中的應(yīng)用，進(jìn)一步探討mNGS 技術(shù)的優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn)，為其在肺部感染性疾病的精準(zhǔn)診斷和治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 mNGS 技術(shù)的發(fā)展和原理

1977 年，SANGER 等［9］采用鏈終止抑制劑進(jìn)行DNA 測序（即為Sanger 測序法），開創(chuàng)了分子檢測的新方法，隨著對測序通量需求的增加，檢測技術(shù)和流程也得到了改進(jìn)。2004 年，研究者［10］采用Sanger 技術(shù)完成了人類基因組檢測，基于對人類基因組計劃研究的需求，檢測技術(shù)不斷成熟，推動了二代測序技術(shù)的產(chǎn)生［8，11］。mNGS 技術(shù)是一種大規(guī)模多程序并行的測序過程，可利用基因組學(xué)研究樣本中微生物的組成對病原體進(jìn)行無假設(shè)、無偏倚和可定量的檢測［1，8，12］。mNGS 技術(shù)原理包括合成法測序和連接法測序［8］，mNGS 技術(shù)分析檢測過程包括臨床樣品處理、文庫制備、測序和結(jié)果分析，最終結(jié)合臨床得出診斷。現(xiàn)使用的測序平臺有Illumina（中國）科學(xué)器材有限公司提供的一系列測 序 平 臺 （iSeq、 MiniSeq、 MiSeq、 HiSeq、NextSeq 和NovaSeq 平 臺）、美 國Thermo Fisher Scientific 公司提供的Ion Torrent 平臺、英國BGI 公司提供的BGISEQ 平臺、美國Oxford Nanopore Technologies 公司提供的便攜式測序儀（MinION、GridION 和 PromethION） 等［1］。 并 采 用 基 于“spike-in”的校準(zhǔn)來確定總微生物負(fù)荷［13］、采用捕獲探針進(jìn)行消減雜交、 基于核糖核酸酶（ribonuclease，RNase） 的去除方法以及靶向序列的CRISPR-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase 9）切割［1］等方法，盡量減少樣本中其他核酸（人類宿主核酸和定植菌核酸等）的影響，從而達(dá)到準(zhǔn)確鑒別病原體的目的。

2 mNGS 技術(shù)在肺部感染性疾病中的應(yīng)用

2.1 mNGS 在肺部感染性疾病不同類型病原微生物鑒定中的應(yīng)用

2.1.1 細(xì)菌檢測 細(xì)菌是肺部感染性疾病最常見的病原體，目前臨床仍以培養(yǎng)法作為細(xì)菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是檢測的種類受限并且培養(yǎng)需時長。mNGS 對細(xì)菌檢測的總體檢測效能整體優(yōu)于傳統(tǒng)檢測，且檢測用時短。相關(guān)研究［14-16］顯示：mNGS技術(shù)的檢測陽性率高于常規(guī)檢測，并對罕見菌有較高的診斷效能，如單核細(xì)胞增多性李斯特菌和痤瘡丙 酸 桿 菌 等［17-18］。研 究［19-21］顯 示：mNGS 技 術(shù) 和傳統(tǒng)病原檢測技術(shù)對常見病原細(xì)菌的檢測敏感度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但mNGS 技術(shù)對罕見菌和體外培養(yǎng)條件要求苛刻細(xì)菌的檢測效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)病原檢測技術(shù)，可作為傳統(tǒng)病原檢測法的有效補(bǔ)充。

2.1.2 真菌檢測 在肺部感染性疾病的常見病原體中，真菌感染較細(xì)菌感染少。MIAO 等［19］研究顯示：mNGS 技術(shù)在檢測真菌方面較傳統(tǒng)檢測方法更具有優(yōu)勢，GU 等［16］采用Illumina 測序?qū)Χ喾N體液（胸腔積液、腹腔積液和尿液等） 行mNGS 技術(shù)檢測，結(jié)果顯示：與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測比較，mNGS 技術(shù)對真菌檢測具有較高的靈敏度和特異度。LI 等［21］對肺組織標(biāo)本進(jìn)行mNGS 技術(shù)檢測結(jié)果顯示：mNGS 技術(shù)的應(yīng)用提高了肺部侵襲性真菌感染的診斷效率，但也有研究［14，22］顯示：雖然mNGS 技術(shù)對于病原檢測的總體陽性率高于傳統(tǒng)檢測方法，但其在真菌檢測方面無明顯優(yōu)勢，特別是對于曲霉菌，這可能是由于真菌細(xì)胞壁的存在增加了檢驗的難度［22］。隨著技術(shù)的進(jìn)步和基因庫的完善，mNGS 技術(shù)的檢測效能優(yōu)勢將會逐漸突顯。

2.1.3 結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌檢測 結(jié)核病是我國常見的傳染病之一，結(jié)核病的早期診斷有助于降低結(jié)核病的傳播風(fēng)險和患者的死亡率［23］，mNGS 技術(shù)可作為結(jié)核病傳統(tǒng)病原檢測技術(shù)的有效補(bǔ)充，有助于提高結(jié)核病的早期診斷率。研究［19，21，24］顯示：mNGS技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體檢測效能較高。ZHOU 等［23］研 究 顯 示：在 結(jié) 核 菌 診 斷 方 面，mNGS 技術(shù)總體檢測效能不亞于基因Xpert 利福平耐 藥 量 核 酸 擴(kuò) 增 （Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF） 檢 測 技術(shù)，并且可以同時對并發(fā)感染的其他致病菌及耐藥基因進(jìn)行檢測。SHI 等［25］研究顯示：mNGS 技術(shù)對肺結(jié)核的診斷靈敏度遠(yuǎn)高于痰抗酸染色法，但與Xpert MTB/RIF 檢測和體外培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計 學(xué) 意 義。ZHOU 等［23］研 究 顯 示：mNGS 檢 測 與Xpert MTB/RIF 檢測對活動性肺結(jié)核的診斷靈敏度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（44%vs42%，P>0.05），但高于傳統(tǒng)方法（29%），上述研究結(jié)果的差異考慮與存在產(chǎn)生細(xì)胞外核酸較少的胞內(nèi)菌有關(guān)，盡管mNGS 技術(shù)可以識別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，協(xié)助非結(jié)核分枝桿菌種類的鑒定［25］，但是由于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)部同源性高，基因相似性很高，在覆蓋不足的情況下難以確定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的物種，因此在應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特定種類的鑒定時可能會造成一定誤差［21］，如有必要，應(yīng)進(jìn)行靶向 PCR 法檢測以進(jìn)一步識別特定的結(jié)核菌株［23］，mNGS 技術(shù)與Xpert MTB/RIF 檢測聯(lián)合應(yīng)用可提高結(jié)核病的診斷效能［24］。mNGS技術(shù)在結(jié)核病的診斷中具有潛在優(yōu)勢，隨著技術(shù)的進(jìn)步和相關(guān)數(shù)據(jù)庫的建立，對特定結(jié)核菌株和耐藥基因的鑒定效能也將不斷提升。

2.1.4 病毒檢測 目前臨床使用的病毒檢測方法中，免疫學(xué)檢測和PCR 法檢測應(yīng)用較多，但檢測需對病原體進(jìn)行預(yù)判，限制了未知病毒的檢測。近年來，mNGS 技術(shù)在各系統(tǒng)中病毒檢測方面應(yīng)用較多，MIAO 等［19］研究顯示：mNGS 技術(shù)在病毒檢測方面具有優(yōu)勢。VANRIJN 等［26］對慢性阻塞性肺疾病急性加重期呼吸道病毒的研究顯示：mNGS技術(shù)診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值較高，鼻病毒在病毒病原體中的發(fā)病率最高，其次是流感病毒、冠狀病毒及副流感病毒。GUAN等［27］對疑似病毒性腦膜炎患者行mNGS 檢測，成功分離出皰疹病毒，并采用PCR 法加以驗證，證實了其準(zhǔn)確性。SOMASEKAR 等［28］對204 例急性肝衰竭患者的血清樣本行mNGS 檢測，共檢測出8 例先前未被識別的病毒病原體感染。mNGS 技術(shù)還可以對未知病毒進(jìn)行檢測［7］，同時檢測對抗病毒藥物的耐藥基因［29］，其已經(jīng)為新型冠狀病毒的鑒定、突變菌株的監(jiān)測和流行病學(xué)研究提供了思路［5］，并為新型冠狀病毒的疫苗設(shè)計、藥物發(fā)現(xiàn)和診斷開發(fā)提供了分子基礎(chǔ)［30］。

2.1.5 其他病原體 GU 等［7］發(fā)現(xiàn)：采用mNGS技術(shù)對未能明確病原體的肺部感染患者進(jìn)行檢測時診斷出5 例鸚鵡熱衣原體肺炎患者。侯婕等［31］在診斷1 例發(fā)熱和呼吸困難的患者時，發(fā)現(xiàn)患者傳統(tǒng)培養(yǎng)和外斐試驗結(jié)果均呈陰性，最終采用mNGS技術(shù)檢測明確診斷患者患有恙蟲病立克次體肺炎。因此在傳統(tǒng)病原檢測診斷困難時，可以利用mNGS技術(shù)檢測快速和靈敏的特點，檢測潛在的致病病原體，其具有較大的臨床應(yīng)用價值。

2.2 mNGS 技術(shù)在肺部感染性疾病不同臨床標(biāo)本中的應(yīng)用

2.2.1 痰液和支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）標(biāo)本 痰液是臨床工作中常用的病原學(xué)檢測標(biāo)本，但易受污染及上呼吸道致病菌干擾，且很難獲得深部下呼吸道標(biāo)本，只有合格的痰標(biāo)本才能用于痰培養(yǎng)，因此不是最佳標(biāo)本［32］。痰標(biāo)本聯(lián)合侵入性技術(shù)在全球下呼吸道感染監(jiān)測項目中被接受［33］，BALF 受口腔菌群影響小，但難以采集最深部標(biāo)本，BALF 可在內(nèi)窺鏡下獲得，因此具有侵入性［34］，建議患者治療后，在影像學(xué)吸收欠佳且病情允許時，通過纖維支氣管鏡留 取BALF 標(biāo) 本［35］，BALF 可 作 為 肺 部 感 染 患 者病原檢測的有效補(bǔ)充。

研究［36-37］顯示：采用BALF 進(jìn)行病原學(xué)檢測可以提高診斷效能，指導(dǎo)臨床治療。XIE 等［14］研究顯示：采用mNGS 技術(shù)行痰液和BALF 病原學(xué)檢測的靈敏度均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)。PENG 等［32］研究顯示：合格的痰標(biāo)本和BALF 標(biāo)本的培養(yǎng)結(jié)果及抗菌藥物靈敏度結(jié)果存在較大差異。BALF 可通過纖維支氣管鏡獲得，可以代表下呼吸道感染的狀態(tài)，BALF 在間質(zhì)性肺炎、肺部感染和肺癌等多種肺部疾 病 的 診 斷 檢 查 中 發(fā) 揮 重 要 作 用［38］。CHEN 等［36］采用mNGS 技術(shù)對BALF 進(jìn)行病原檢測，檢測陽性率為85%，優(yōu)于傳統(tǒng)檢測。特別是在免疫功能缺陷患者的診斷中，mNGS 技術(shù)對于BALF 樣本的檢測具有潛在優(yōu)勢，同時提高了重癥社區(qū)獲得性肺炎微生物的檢出率［37］。mNGS 技術(shù)對肺部真菌感染、寄生蟲感染、病毒感染和痰涂片/培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核BALF 樣本具有較高的診斷價值，但其對于結(jié)核病的診斷尚存一定爭議，有研究［25］顯示：mNGS 技術(shù)和體外培養(yǎng)技術(shù)的檢測效能比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。BALF 不僅可以應(yīng)用于肺部感染的診斷，而且可以幫助鑒別潛在惡性腫瘤導(dǎo)致的肺部病變和肺泡出血等［38］。

2.2.2 肺組織標(biāo)本 肺組織的微生物培養(yǎng)和病理學(xué)檢查可以作為侵襲性真菌感染的輔助診斷，研究［21，39-40］顯示：mNGS 技術(shù)檢測患者肺部病原體時可以通過肺活檢組織進(jìn)行，這種方法在檢測速度和靈敏度方面具有潛在優(yōu)勢。LI 等［21］對肺活檢組織行mNGS 技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：mNGS 技術(shù)對細(xì)菌和真菌檢測的靈敏度分別為100.0% 和57.1%，特異度分別為76.5% 和61.5%。與組織病理學(xué)方法比較，mNGS 技術(shù)在真菌（特別是侵襲性真菌）和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的評估中，特異度（100.0%和 94.1%）和陽性預(yù)測值（100.0%和75.0%）較高［21］。有學(xué)者［41］認(rèn)為：目前關(guān)于肺部感染中對肺活檢組織標(biāo)本采用mNGS技術(shù)的研究較少，與無細(xì)胞體液比較，組織標(biāo)本中人類宿主核酸比例增加，使微生物核酸比例減少，可能導(dǎo)致mNGS 技術(shù)靈敏度降低，mNGS 技術(shù)可用于組織樣本的病原學(xué)檢查，但受宿主因素（背景核酸）的影響，現(xiàn)階段已有多項技術(shù)致力于減少宿主因素的干擾。

2.2.3 血液標(biāo)本 血液系統(tǒng)屬于無菌微環(huán)境，血液系統(tǒng)感染可導(dǎo)致敗血癥甚至感染性休克的發(fā)生，這是住院患者死亡的重要原因之一。敗血癥不僅是重癥肺炎患者常見并發(fā)癥，同時也是導(dǎo)致重癥肺炎患者預(yù)后不良的重要危險因素，因此對于血液系統(tǒng)感染的檢測和早期診治十分重要［36］。研究［35］顯示：社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）患者并發(fā)菌血癥的概率為5%～25%，因此建議所有需住院治療的CAP 患者行血培養(yǎng)檢測。但傳統(tǒng)血培養(yǎng)易受抗生素使用的影響，并且檢測周期長，容易延誤病情，第二代測序技術(shù)檢測周期短，可以快速檢測血漿致病菌DNA 片段，并可對其耐藥性進(jìn)行分析［42］。由于致病菌會隨著時間推移發(fā)生變化［43］，常規(guī)培養(yǎng)耗時長，可能會延誤病情，建議可在早期采用mNGS 技術(shù)對重癥CAP 患者行病原體檢測。

研究［4］顯示：健康人的血液中可檢測到細(xì)菌DNA，其分類組成與膿毒血癥不同，在膿毒癥患者中，需氧或微需氧微生物 （75.1%） 占主導(dǎo)地位，而健康志愿者的血液中以厭氧雙歧桿菌目的細(xì)菌DNA 為主（73.0%）。因此，雖然mNGS 技術(shù)可以快速且準(zhǔn)確地檢測出病原體，并且已有較多的輔助技術(shù)區(qū)分定植菌，但在采用mNGS 技術(shù)對血液行病原學(xué)檢測時，仍需密切結(jié)合臨床資料對檢測結(jié)果進(jìn)行綜合分析以確定致病菌。

2.2.4 其他臨床標(biāo)本 mNGS 技術(shù)在其他標(biāo)本中也有應(yīng)用，目前已被應(yīng)用于胸腔積液、腦脊液、膿液、間質(zhì)液、骨髓、鼻拭子、關(guān)節(jié)液、超聲處理液和尿液等標(biāo)本的病原學(xué)檢測［39，44-45］，但相關(guān)研究尚較少。WANG 等［44］研究顯示：mNGS 技術(shù)提高了皮膚和軟組織感染病原檢測的敏感性，但在組織、膿液、拭子和間質(zhì)液各樣本中檢測陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HUANG 等［45］采用mNGS 技術(shù)對關(guān)節(jié)液、超聲處理液和組織標(biāo)本對骨關(guān)節(jié)感染進(jìn)行診斷時發(fā)現(xiàn)：mNGS技術(shù)總體陽性率高于傳統(tǒng)檢測，并且在關(guān)節(jié)液和超聲處理液中mNGS 技術(shù)總體陽性率亦高于傳統(tǒng)培養(yǎng)。

3 mNGS 技術(shù)在耐藥性分析中的應(yīng)用

我國是抗生素消耗量最大的國家之一，抗生素的過度使用會導(dǎo)致耐藥菌和耐藥基因的產(chǎn)生，給臨床治療帶來一定難度，成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的挑戰(zhàn)之一［43］。了解抗生素耐藥基因譜與抗菌藥物結(jié)果之間的相關(guān)性，建立公共抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫將有助于個體化抗感染方案的實施。近年來，研究［42］證明：基于mNGS 技術(shù)診斷可以快速檢測不同致病菌抗生素耐藥基因及毒力因子，發(fā)現(xiàn)了許多種類的抗生素耐藥基因，較傳統(tǒng)藥敏檢測節(jié)約了大量時間，特別是傳代周期長的微生物，如結(jié)核分枝桿菌。但由于缺乏傳統(tǒng)耐藥檢測的驗證，mNGS 技術(shù)在耐藥性檢測方面仍存在挑戰(zhàn)，在準(zhǔn)確性（需要穩(wěn)健的質(zhì)量控制）和耐藥表型-基因型相關(guān)性方面仍然存在局限性，無法準(zhǔn)確判定病原體對抗生素的耐藥性［37］。技術(shù)層面，mNGS 技術(shù)可以快速檢測耐藥基因型，從而預(yù)測抗生素耐藥表型，但其在耐藥表型-基因型相關(guān)性檢測方面仍然存在局限性［33］。因此，耐藥表型和基因型方法互補(bǔ)，需協(xié)同檢測以提高檢測的靈敏度和特異度。

4 mNGS 技術(shù)在臨床應(yīng)用中的不足之處

雖然mNGS 技術(shù)有較高診斷效能，但仍存在一定的不足：①盡管已采用多種方法去除人類背景DNA/RNA，人類宿主核酸背景仍然會影響樣本中的微生物核酸；②在取樣、送檢和檢測過程中，均存在微生物污染可能，需要嚴(yán)格遵守操作流程的質(zhì)量控制程序，以保持無菌和無核酸的測試環(huán)境［1，23］；③樣本中微生物的濃度低于正常檢測線或病原微生物未在檢測范圍會出現(xiàn)假陰性結(jié)果；④受病原體基因庫的影響，對新物種的檢測有一定限制；⑤對胞內(nèi)菌、RNA 病毒和有細(xì)胞壁的病原體檢測相對受限；⑥缺乏統(tǒng)一的報告解讀標(biāo)準(zhǔn)［13］，需結(jié)合臨床資料進(jìn)行解讀；⑦能對耐藥基因進(jìn)行檢測，但無法準(zhǔn)確判定病原體對抗生素的耐藥性［37］。

5 結(jié)語和展望

肺部感染性疾病仍是臨床工作的一大重點，mNGS 技術(shù)因其檢測效率高、檢測周期短、受抗生素應(yīng)用的影響小及檢測致病菌廣泛等優(yōu)點，已從實驗室檢測逐步應(yīng)用于臨床檢測，指導(dǎo)臨床用藥，但仍存在一定局限性，建議將mNGS 技術(shù)作為傳統(tǒng)病原學(xué)檢測技術(shù)的補(bǔ)充，并深入探討其臨床應(yīng)用價值，實現(xiàn)感染性疾病的精準(zhǔn)診斷和治療。