抗菌聲動力療法的作用機制及其抗菌效果影響因素的研究進展

李 芳, 李紅艷, 潘啟源, 郭晶瑩, 劉 敏

（吉林大學口腔醫(yī)院牙周科，吉林 長春 130021）

細菌感染是全球醫(yī)學領域重點關注的問題，雖然抗生素在對抗感染性疾病方面頗有成效，但隨著耐藥菌株，特別是多重耐藥菌的不斷增加，抗生素的治療效果明顯降低，因此尋找能夠替代抗生素的新型抗菌方法成為治療細菌感染性疾病的迫切要求［1］?？咕晞恿Ο煼ǎ╝ntibacterial sonodynamic therapy，aSDT） 是在聲動力療法（sonodynamic therapy，SDT） 的基礎上發(fā)展起來的一種應用前景較好的抗菌方式，aSDT 是利用超聲激發(fā)聲敏劑，產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）來 實 現 對 細 菌 的 殺 傷 作 用［2］。2011 年，LIU 等［3］首次發(fā)現：聲動力對細菌具有殺傷作用，其測定了氟喹諾酮類藥物（fluoroquinolones，FQS）在施加40 kHz 超聲刺激和無超聲刺激的情況下對大腸桿菌的抑菌效果，發(fā)現超聲能激活FQS 產生ROS，降低細菌的存活率，明顯提高FQS 的抗菌效果。aSDT 因其獨特的作用機制，對細菌不產生耐藥性，為解決抗生素導致的細菌耐藥性的問題提供了一種新思路，另外超聲波具有優(yōu)越的組織穿透性，在軟組織中的穿透深度可以達到10 cm 以上［4］，能夠瞄準位于生物體深處的細菌，在治療深層感染方面具有較大優(yōu)勢和前景［5］。近年來， aSDT 在抗菌領域的研究已取得許多進展，但關于其作用機制和影響因素的系統(tǒng)綜述仍較少見。本文作者結合近些年國內外相關研究，從aSDT 的作用機制及影響其抗菌效果的相關因素方面進行綜述。

1 aSDT 的作用機制

aSDT 的具體作用機制尚未完全闡明。目前公認的aSDT 作用機制是以超聲空化效應為基礎的理論，包括基于ROS 的聲化學效應以及基于超聲的聲力學效應。超聲空化效應是指超聲與液體環(huán)境相互作用導致的一種獨特的物理現象，分為穩(wěn)定空化和慣性空化兩大類［6］。穩(wěn)定空化是指微小氣泡發(fā)生振蕩引起液體流動發(fā)生周圍介質的混合；慣性空化是指在超聲的作用下液體中產生的氣泡迅速增長、急劇收縮和破裂的過程，氣泡破裂的瞬間產生剪切應力和沖擊波等聲力學效應以及局部高溫高壓等聲化學效應［7］。

1.1 基于ROS 的聲化學效應

研 究 者［8］認 為：ROS 為aSDT 的 主 要 殺 傷 因子，主要參與細胞的氧化應激反應。ROS 由超聲激活聲敏劑產生，即聲敏劑在吸收超聲的能量后可被激活產生單線態(tài)氧（1O2）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（·O2-） 或過氧化氫（H2O2） 等活性氧。1O2可以引起細胞膜的氧化和降解，對細菌產生不可逆性的損害；·OH 是一種強且非選擇性的氧化劑，幾乎可以破壞所有類型的有機生物分子，包括碳水化合物、核酸、脂質、蛋白質、DNA 和氨基酸；雖然·O2－不是強氧化劑，但是作為1O2和·OH 的前體，其亦具有重要的生物學意義［9］。

1.1.1 ROS 的產生機制 目前，超聲激活聲敏劑產生ROS 存在2 種機制：聲致發(fā)光和熱解效應。聲致發(fā)光指US 空化過程中，氣泡內爆快速釋放能量時可以短暫地發(fā)出光的現象，聲敏劑被光從基態(tài)激發(fā)到高能三線態(tài)，與氧氣（O2）分子或生物底物相互作用產生活性自由基或直接將能量傳遞給O2生成1O2，1O2作為主要效應器，誘導細胞成分的光氧化，最 終 導 致 細 胞 死 亡［10］。RAHMAN 等［11］采 用二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）作為聲敏劑應用于超聲殺菌消毒領域，認為其殺菌機制主要是在超聲作用下氣泡內爆瞬間發(fā)出的紫外光激發(fā)TiO2產生ROS，ROS 對細菌產生殺傷作用。最近，BEGUIN 等［12］也提供了在SDT 過程中聲致發(fā)光的直接證據，在超聲作用下，氣泡空化過程中發(fā)生聲致發(fā)光作用，產生的光激活了光/聲敏劑，從而產生更多的ROS，也證實了光強度與氣泡聲發(fā)射的寬帶能量呈正相關關系。

熱解效應是指局部溫度和壓力因慣性空化過程而升高，促使聲敏劑和（或）水分子在氣液界面或坍塌的氣泡內部發(fā)生熱解生成自由基［13］，在此過程中形成的自由基可以與氧氣反應生成過氧基和烷氧基，誘導細胞毒性損傷。相關研究［14］顯示：熱解水分子產生的·OH 反應活性較高、半衰期較短且擴散距離短，因此關于其在細菌破壞中的作用尚未闡明［15］。熱解聲敏劑過程中產生的H2O2反應活性較低、半衰期長且擴散距離較長，可以攻擊細菌的關鍵位點。因此選擇合適的聲敏劑對于最大限度地發(fā)揮SDT 的熱解效應至關重要。

1.1.2 ROS 作用于細菌的靶點 ROS 可以與細菌的不同成分相互作用誘導細菌死亡，目前存在3 個細菌靶點：細胞膜磷脂、膜蛋白和核酸。ROS 通過破壞上述靶點可以誘導細菌發(fā)生形態(tài)損傷和功能變化：形態(tài)損傷主要指細菌結構的改變，ROS 直接破壞細菌細胞壁和內膜從而破壞細胞膜的完整性，造成細菌胞內內容物泄漏，進而導致膜運輸系統(tǒng)失活；功能改變則通常由膜電位紊亂、蛋白質和酶活性喪失及代謝過程（如DNA 復制和葡萄糖轉運）的抑制［16］引起；通常上述2 種類型的變化同時發(fā)生。PANG 等［17］構建了1 個智能納米脂質體平臺，命名為MLP18，通過掃描電鏡觀察到由MLP18 介導的aSDT 處理后的細菌形態(tài)發(fā)生了顯著變化，細胞壁起皺和裂解，細菌胞內內容物明顯泄漏。為進一步研究細菌破壞的機制，PANG 等［17］定量檢測了MLP18 在超聲過程中產生的ROS 水平，發(fā)現MLP18 和超聲聯(lián)合作用時ROS 水平明顯高于MLP18 或超聲單獨作用時。上述結果說明MLP18 介導的aSDT 的抗菌活性與ROS 的形成有關，ROS 誘導的細菌形態(tài)和功能損傷是aSDT 的潛在殺菌機制。

1.2 基于超聲的聲力學效應

超聲本身會產生機械剪切力和沖擊波等聲力學效應，對細胞膜造成物理性損傷［18］。有學者將細胞毒效應歸因為單純的聲力學效應。WORTHINGTON 等［7］通過評估細胞外產生自由基的量，發(fā)現自由基產量過少無法解釋其導致的細胞死亡，其將細胞死亡歸因于超聲空化產生的機械剪切力。另外，超聲還可以改變細胞膜的通透性、增加聲敏劑和藥物的吸收及積累［19-20］。RUNYAN等［21］證實：超聲可以增加銅綠假單胞菌細胞膜對大分子蛋白的通透性，其認為這種現象可能是由于超聲的機械剪切力作用于細胞膜形成聲孔造成細胞膜通透性變大。添加膜不穩(wěn)定化合物如抗生素和聲敏劑等可以放大機械剪切力，與超聲起到協(xié)同作用，造成細胞膜破壞。COSTLEY 等［22］制備了孟加拉玫瑰-抗菌肽結合物作為聲敏劑，采用超聲處理金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌后，聲敏劑擴散速度提高了2.6 倍，提示超聲增加了細胞膜的通透性，加速了細菌對聲敏劑的攝入。

2 aSDT 作用效果的影響因素

aSDT 包括超聲波、氧氣和聲敏劑這3 個基本要素［23］，通過對上述因素進行不同程度調控可以調節(jié)aSDT 抗菌的作用效果，超聲波通常最易控制，氧氣最難確定，不同聲敏劑對aSDT 的有效性和安全性有不同影響。有研究者［24］認為細菌類型和結構亦會影響aSDT 的作用效果。

2.1 超聲參數

超聲波是一種由頻率高于人類聽覺極限的聲波產生的振動能量。頻率小于1 MHz 的超聲定義為低頻超聲，強度小于3 W·cm－2的超聲定義為低能超聲［25］。目前，大部分研究采用的是低頻低能超聲來探討aSDT 的抗菌效果。

隨著超聲波頻率的增加，超聲空化作用時氣泡的振蕩半徑變小，因此，超聲波頻率是決定氣泡動力學的重要因素。研究［26］顯示：大多數聲敏劑可以 被0.2～3.0 MHz 的 超 聲 波 激 發(fā)。HAO 等［27］通過對C6 膠質瘤細胞施加不同頻率超聲，研究了超聲頻率對聲動力作用的影響的實驗結果顯示：細胞活力和超聲頻率的增加成正比，采用0.5、0.8和1.0 MHz 超聲處理，細胞存活率分別為43%、57%和60%，隨著超聲頻率降低，細胞毒性增加，但是頻率本身并非決定SDT 效果的關鍵，將頻率與適當類型和濃度的聲敏劑相結合，對于觸發(fā)控制細胞死亡所需的生物反應是至關重要的。分別采用光卟啉［28］和二磺基二鄰苯二甲酰亞胺甲基酞菁［29］作為聲敏劑，采用0.5 W·cm－2、1 MHz 的超聲波處理U251 細胞后，二磺基二鄰苯二甲酰亞胺甲基酞菁處理后細胞死亡率高于80%，而光卟啉處理使細胞死亡率不足50%。在這種情況下，聲致發(fā)光可能在聲動力效應中起重要作用，由超聲波和聲敏劑相互作用產生的降解產物也可能在細胞死亡中起一定作用，具體作用機制有待更深層次的探討。

通常采用的超聲強度為0.5～10.0 W·cm－2［30］，低強度超聲可以激發(fā)聲敏劑產生適量的ROS，改變細胞膜的通透性，細胞結構仍保持相對完整。SHEVCHENKO 等［31］制備了負載多糖（右旋糖酐）涂層的硅納米粒子作為聲敏劑，采用1 和3 W·cm－2超聲分別處理大腸桿菌10 min 后，抑菌率分別為35%和100%，表明隨著超聲強度的增高，殺菌效率也相應提升。雖然高強度超聲產生了更多的ROS，對細菌結構的破壞程度更為嚴重，但其亦對周圍正常的組織或細胞造成一定的損傷。REDISKE 等［32］的研究將帶有大腸桿菌生物膜的圓盤植入新西蘭白兔背部皮下，分別采用相同頻率（28.48 kHz）、不同強度（100 和300 mW·cm－2）超聲連續(xù)治療24 h，取出圓盤并測定圓盤上的活細菌數量，結果顯示：100 mW·cm－2超聲對細菌的殺傷作用并不明顯，300 mW·cm－2超聲可明顯降低細菌活性，且可明顯地觀察到兔的皮膚組織受到損傷。因此，為了保護正常的組織和細胞，在aSDT 的研究中廣泛采用的是低強度超聲。

2.2 O2

O2對于ROS 的產生至關重要，然而，大多數細菌感染部位為缺氧的微環(huán)境，再加之aSDT 過程中會消耗大量O2，進一步加重了其缺氧狀態(tài)，使治療效果降低。一些學者通過整合無機納米酶建立了治療效果顯著的聲動力學平臺，通過酶催化的方式將內源性H2O2轉化為O2，使感染微環(huán)境的缺氧狀態(tài)得到明顯緩解，有利于ROS 的產生，增強治療效果。SUN 等［33］提出了一種可切換的納米酶系統(tǒng)Pd@Pt-T790，T790 可以阻斷Pd@Pt 的過氧化氫酶樣活性，但在超聲激活下，Pd@Pt 的酶活性得到恢復，催化內源性H2O2分解為O2，從而減輕缺氧情況，提高aSDT 的療效，并將其成功應用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌所致的深部細菌感染性疾病。

2.3 聲敏劑

聲敏劑被認為是影響抗菌效果最重要的因素。近年來聲敏劑得到了迅速發(fā)展，一般分為有機聲敏劑和無機聲敏劑，具有很大的應用潛力，設計高效的聲敏劑是aSDT 研究中的重要課題。

2.3.1 有機聲敏劑 早期使用的聲敏劑是有機小分子，卟啉類衍生物是第一代也是目前研究最多的聲敏劑，主要包括血卟啉單甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether，HMME）、原卟啉Ⅸ和光卟啉等。ZHUANG 等［34］研究了HMME 介導的aSDT對金黃色葡萄球菌的滅活效果， 50 mg·L－1HMME、6 W·cm－2超聲處理可以殺滅超過95%的金黃色葡萄球菌，且隨著HMME 濃度和超聲強度的升高，殺菌效率也相應提高。此外，還有一些有機分子例如葉綠素、竹紅菌素B、孟加拉玫瑰和姜黃素等也可以被US 激活，并且取得了較好的滅菌效果。WANG 等［35］采用竹紅菌素B 作為聲敏劑對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進行超聲處理，與對照組比較，US 組細菌死亡數明顯增多，細胞膜完整性 明 顯 受 損。POURHAJIBAGHER 等［36］制 備 了納米姜黃素探討其對變形鏈球菌的殺傷效果，納米姜黃素治療1 min 可以達到99.9%的抑菌率，與姜黃素比較，納米姜黃素介導的aSDT 細胞毒性較小，ROS 水平和抗菌活性最高，能有效抑制變形鏈球菌的生長。盡管許多有機小分子被發(fā)現具有潛在的聲動力效應，但因其生物利用度和穩(wěn)定性較低、體內清除較快，從而阻礙了其在臨床上的應用。因此，需要對有機小分子進行修飾或引入佐劑，克服上述缺點，從而提高其實際應用效果。

2.3.2 無機聲敏劑 無機納米材料具有相對優(yōu)異的物理化學性質和較高的穩(wěn)定性，在生物醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。近年來，基于無機納米顆粒的聲敏劑在aSDT 中得到了廣泛應用。TiO2是一種傳統(tǒng)的無機納米聲敏劑，DADJOUR 等［37］采用超聲處理系統(tǒng)對嗜肺軍團菌進行消毒的結果顯示：在無TiO2、0.2 g·mL－1TiO2和1.0 g·mL－1TiO2條件下，采用超聲作用30 min 后，細菌數量分別下降了18%、94%和103，這表明增加TiO2用量可以在一定程度上提高消毒效果。SU 等［38］通過在鈦（Ti）種植體上摻雜硫（S）產生氧空位（Ti-S-TiO2-X）的方式，使種植體具有了很強的聲動力效應和光熱效應，超聲和近紅外光聯(lián)合作用15 min 后，對金黃色葡萄球菌的抗菌率達到99.995%。除了傳統(tǒng)的TiO2，一些其他無機納米材料例如硅（Si）［39］、四氧化三鐵（Fe3O4）［40］和黑磷（BP）［41］等也被證明具有聲動力的潛能，貴金屬如金（Au）、銀（Ag）和鉑（Pt）可以與納米材料結合，通過阻止電子-空穴復合和增加活性氧的數量來提高aSDT 的效率。WU 等［42］開發(fā)了一種負載Au NPS的鈦酸鋇納米復合壓電材料Au@BTO。超聲波觸發(fā)Au@BTO的壓電效應，促進電子-空穴對的分離，增加ROS的產生，對典型的革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均顯示出較高的抗菌效果。聲動力學過程還可促進成纖維細胞遷移，有助于小鼠皮膚傷口愈合。

2.4 細菌類型和結構

不同種類的細菌在細胞結構和組織結構上表現出較大的差異，影響了聲敏劑與細菌之間的相互作用。革蘭陽性菌的細胞壁結構簡單，細胞壁與細胞膜結合并不緊密，有利于聲敏劑的進入。而革蘭陰性菌具有復雜的細胞壁多層結構，由細胞內膜和細胞外膜構成，細胞外膜是由脂質雙分子層和多糖-脂多糖組成［43］。雖然革蘭陰性菌的細胞壁厚度很?。?～5 nm），但是脂多糖的存在保證了菌體結構不易被破壞，同時還能阻擋聲敏劑、溶菌酶和抗生素等較大分子進入細菌內部［44］。因此，相較于革蘭陰性菌，革蘭陽性菌更對 aSDT 更敏感。XU 等［45］對比了同樣US 頻率和強度下采用二氫卟吩e6 （chlorin e6，Ce6）作為聲敏劑對革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭陰性菌（大腸桿菌）的殺傷效果，檢測菌落形成單位（colony forming unit，CFU）結果顯示：在1.0 MHz、1.56 W/cm－2的條件下，大腸桿菌的CFU 下降2－log，金黃色葡萄球菌降低7－log，證明了Ce6 的聲動力作用對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抗菌作用，且對革蘭陽性菌的抗菌作用更強。

抗生素濫用導致的耐藥菌株的出現是目前治療細菌感染性疾病面臨的重大挑戰(zhàn)。常見的耐藥菌株包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等。aSDT 是通過聲敏劑響應超聲產生ROS 來實現位點特異性細胞毒性，對細菌不產生耐藥性。β-內酰胺類抗生素（如甲氧西林）的過度使用導致耐甲氧西林金黃色葡萄球菌出現并在全球傳播，成為醫(yī)療保健和社區(qū)環(huán)境中細菌感染的主要原因。YU 等［46］制備了1 種超聲激活的單原子催化劑，該催化劑由金納米棒驅動的單原子摻雜卟啉金屬有機骨架（HNTM-Pt@Au） 和紅細胞膜組成，經超聲處理1 5 min 后，其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌效率為 99.9%。鮑曼不動桿菌作為一種耐多藥和侵襲性病原體，已被公認為是肺炎、敗血癥、腦膜炎、泌尿道和傷口感染的病原體［47］。POURHAJIBAGHER 等［48］合成了姜黃素-乳鏈菌肽基聚（L-乳酸） 納米顆粒（CurNisNp），發(fā)現鮑曼不動桿菌的細菌活力與CurNisNp 的濃度、光照時間和超聲強度呈負相關關系。LIU 等［49］研究顯示：低頻超聲可以增強黏菌素-萬古霉素對鮑曼不動桿菌耐藥生物膜的抗菌活性。也有研究［4，22］顯 示aSDT 對 銅 綠 假 單 胞 菌 具 有 明 顯 的 抑制效果。

自然界中細菌多數以生物膜的形式存在，生物膜是結構復雜的細菌群落，細菌附著并嵌入至由胞外多糖、DNA 和蛋白質組成的細胞外基質中［50］。人體中約80%的慢性和復發(fā)性細菌感染是由細菌生物膜引起的，與浮游細菌比較，生物膜中的細菌對抗生素的抵抗力增強［51］，因此，aSDT 作用于生物膜的研究對于指導臨床治療細菌感染性疾病更具意義，aSDT 聯(lián)合其他療法對生物膜的清除效果較為 顯 著。ALVES 等［52］采 用aSDT 和aPDT 分 別 處理白色念珠菌的浮游細菌和生物膜，并測定細菌的存活率結果顯示：aSDT 或aPDT 單獨應用對浮游菌的殺傷效果明顯，但是其對生物膜的清除作用并不顯著。當aSDT 和aPDT 聯(lián)合使用時，生物膜的活力和總生物量降低，其采用熒光顯微鏡評估生物膜的形態(tài)和結構發(fā)現：aSDT 聯(lián)合aPDT 處理后，生物膜密度明顯降低，且主要由死細胞構成，原因可能為超聲促進了生物膜基質中聲孔的產生，促進了聲敏劑向生物膜的擴散，提高了aSDT 的療效。

3 總結和展望

aSDT 作為一種新興的抗菌治療方法，安全性較高，抗菌效果顯著，為臨床上治療細菌感染性疾病提供了新思路。了解其具體作用機制對進行臨床試驗必不可少。以往的研究缺乏對超聲領域的全面表征，聲學參數和實驗設置參數的不同使得數據的定量比較較難實現，在相同的條件下進行大量實驗才能確定最佳的頻率強度等參數。近年來，盡管在開發(fā)具有良好生物相容性和靶向能力的新型納米聲敏劑方面的研究進步較大，但仍存在一些復雜的制備方法、正常組織的不良反應及靶向性欠佳等問題有待解決。進一步的研究應集中于通過優(yōu)化其結構和聲動力學能力來探索具有良好靶向特異性和治療效果的新型聲敏劑。