參芍消瘤方含藥血清對人肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

丁曉明 張賢梅 柯亭 昝俊杰 孫勤國

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是全球第六大常見惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第四大原因[1-2]，具有高發(fā)病率和高死亡率，患者常規(guī)治療后存在預(yù)后不良和容易復(fù)發(fā)等臨床問題[3-4]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、凋亡和代謝的重要信號機(jī)制，針對該通路研發(fā)的抑制劑在治療肝癌方面具有較大臨床應(yīng)用價(jià)值[5-7]。中藥以低毒、多因素、多途徑靶向等優(yōu)點(diǎn)長期應(yīng)用于臨床，具有開發(fā)抗肝癌天然新藥的巨大潛力[8]。靶向抑制PI3K/Akt 途徑的天然藥物被認(rèn)為是很有前途的抗肝癌藥物[9]。麝黃消瘤方是成肇仁教授治療肝癌的臨床經(jīng)驗(yàn)方，可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)行為[10-11]。參芍消瘤方由麝黃消瘤方改進(jìn)而來，是武漢市第三醫(yī)院應(yīng)用多年的治療PLC 協(xié)定方。前期臨床數(shù)據(jù)顯示，參芍消瘤方可改善乏力、腹脹、脅痛等癥狀，改善PLC 患者因介入治療、放療等導(dǎo)致的不良反應(yīng)，延長患者生存時(shí)間，提高生活質(zhì)量[12]。但參芍消瘤方對人PLC 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為的影響尚不明確。本研究采用含參芍消瘤方的血清作用于人PLC 細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，與常用抗癌藥物順鉑聯(lián)合使用，探討中西藥物結(jié)合使用對人PLC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為PLC藥物研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞 SPF級SD大鼠5只，雄性，7～8周齡，體質(zhì)量250～280 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物合格證：No.430727221100343247。于SPF 級環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人肝癌細(xì)胞Bel-7402 購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。RPMI 1640（批號：SH30809.01B）購自美國Hyclone 公司，凍存；使用時(shí)37 ℃水浴解凍，加入10%FBS和1%青霉素、鏈霉素雙抗。細(xì)胞在5%CO2、70%濕度、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 FBS（批號：c11095500bt）購自美國Gibco 公司。5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號：C10310-1）購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。碘化丙啶（propidine iodide，PI）/Rnase 染色緩沖液、AnnexinVFITC/PI 凋亡檢測試劑盒（批號：556547）購自美國BD公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell-counting kit-8，CCK-8）（批號：CA1210）、結(jié)晶紫（批號：C8470）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）購自北京索萊寶科技有限公司。兔抗PI3K 抗體（批號：PAB30084）、兔抗Akt抗體（批號：PAB30596）、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate protease 3，Caspase-3）抗體（批號：PAB30047）和兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號：PAB36269）均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。兔抗磷酸化PI3K（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗體（批號：ab278545）購自英國Abcam 公司。兔抗磷酸化Akt（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體（批號：4060T）購自美國CST公司。

1.3 參芍消瘤方制備 該方包含丹參15.0 g，白芍15.0 g，黃芪15.0 g，白術(shù)10.0 g，茯苓10.0 g，白花蛇舌草15.0 g，黨參12.0 g，莪術(shù)10.0 g，八月札10.0 g，郁金10.0 g，焦山楂20.0 g，麝香0.1 g，牛黃0.3 g，柴胡6.0 g，炮甲6.0 g，鱉甲15.0 g。所有藥物均購自武漢市第三醫(yī)院藥房。麝香、牛黃研磨至細(xì)末，待用；余藥加水1 000 ml 浸泡1 h，煎煮30 min，去渣再加入麝香、牛黃細(xì)末，再煎煮25 min，使湯藥溶液濃縮至48.00 ml。密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 含藥血清制備 取28.57 ml 湯藥液加入71.43 ml 0.9%氯化鈉溶液配置成100.00 ml 藥液。給大鼠灌胃1 次/d，10.00 ml/kg，連續(xù)5 d。最后1 次灌胃后1 h，采用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血3.00 ml，3 000 r/min 離心10 min，吸取上層血清，置于56 ℃水浴中滅活30 min，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藥物濃度及干預(yù)時(shí)間篩選 采用CCK-8 法。取Bel-7402細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整密度至3×103/孔；培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，棄去上清液，加入含0、15%、20%、25%和30%體積分?jǐn)?shù)含藥血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，100 μl/孔，培養(yǎng)24、48 和72 h。加入10 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光值，分別計(jì)算細(xì)胞抑制率，篩選含藥血清干預(yù)的最佳體積分?jǐn)?shù)和時(shí)間。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組及處理 取正常培養(yǎng)細(xì)胞，分為對照組、含藥血清組、順鉑組、含藥血清+順鉑組。對照組使用常規(guī)RPMI 1640，含藥血清組細(xì)胞使用含25%含藥血清的RPMI 1640，順鉑組使用含5 mmol/L 順鉑的RPMI 1640[13]，含藥血清+順鉑組使用25%含藥血清和含5 mmol/L 順鉑的RPMI 1640。正常培養(yǎng)24～48 h，待用。

1.7 指標(biāo)測定

1.7.1 細(xì)胞增殖數(shù)量的檢測 采用EdU 染色法。收集各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6 孔板，加入含100 μl EdU（50 μmol/L）的培養(yǎng)基。孵育2 h 后，加入100 μl/孔含4%多聚甲醛的PBS 室溫繼續(xù)孵育30 min。根據(jù)EdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書方法，先后加入100 μl Apollo?染色反應(yīng)液和100 μl Hoechst 33258 反應(yīng)液，均避光搖床孵育30 min。使用熒光顯微鏡觀察染色情況，EdU 染色后呈紅色（細(xì)胞DNA 染色），Hoechst 33258 染色后呈藍(lán)色（細(xì)胞核染色），將DNA 染色和核染色圖疊加合并呈圖，比較各組細(xì)胞數(shù)量的變化。

1.7.2 細(xì)胞周期檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6 孔板，正常培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/孔，1 350 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，PBS 重懸后，加入700 μl 無水乙醇，-20 ℃固定24 h。取出細(xì)胞，4 ℃，1 787 r/min 離心5 min，加入1.00 ml PBS 洗滌細(xì)胞2 次。加入0.5 ml PI/Rnase 染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，室溫孵育15 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞DNA 含量，確定待測細(xì)胞在細(xì)胞周期（G1期、S 期和G2期）所占比例，利用NovoExpress 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7.3 細(xì)胞凋亡率檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6 孔板，正常培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/孔，1 350 r/min 離心5 min。加入200 μl PBS 重懸細(xì)胞，加入10 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI，4 ℃避光孵育30 min。加入300 μl PBS，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測處于第二象限（Q2-2）和第四象限（Q2-4）的細(xì)胞所占比例，利用NovoExpress 分析軟件進(jìn)行分析。

1.7.4 細(xì)胞遷移能力的檢測 采用劃痕法。使用6 孔板培養(yǎng)各組細(xì)胞，背后用馬克筆豎著均勻畫5 條直線，橫穿過孔。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/孔，培養(yǎng)過夜。用無菌槍頭垂直于背后直線劃痕。PBS 清洗去劃下的細(xì)胞，分別于0、48 h 拍照，比較不同分組細(xì)胞劃痕寬度變化幅度，計(jì)算劃痕閉合率，以此判斷各組細(xì)胞遷移能力。

1.7.5 細(xì)胞侵襲能力的檢測 采用Transwell 法。Transwell 小室用PBS 浸泡5 min 后取出，底部鋪80 μl基底膠，靜置30 min。收集各組細(xì)胞，用含1% FBS 的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。小室上室中加入0.50 ml 細(xì)胞懸液，下室中加入0.75 ml 含10% FBS 的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。加入1.00 ml 4%多聚甲醛固定20 min，加入1.00 ml/孔0.5%結(jié)晶紫溶液，染色30 min。擦去小室內(nèi)沒有侵襲的細(xì)胞，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)視野中的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7.6 細(xì)胞p-PI3K、p-AKT 和Caspase-3 蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot 法。各組取1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法進(jìn)行蛋白定量后，SDS-PAGE 電泳分離。轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗（稀釋比1∶1 000）室溫孵育1 h，洗膜。加入二抗室溫孵育1 h，洗膜。加入化學(xué)發(fā)光試劑，顯影曝光。采用圖像處理軟件Image J 計(jì)算各蛋白條帶灰度值，檢測p-PI3K、p-Akt 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清作用濃度及時(shí)間篩選 隨培養(yǎng)基中加入的含藥血清體積增加，細(xì)胞抑制率逐漸升高，在25%時(shí)達(dá)到穩(wěn)定。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，含藥血清對細(xì)胞抑制率逐漸升高，在48 h 達(dá)到穩(wěn)定，見圖1。因此，選擇含25%參芍消瘤方血清的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

圖1 培養(yǎng)基含藥血清濃度及培養(yǎng)時(shí)間篩選（A：血清體積；B：培養(yǎng)時(shí)間）

2.2 含藥血清對細(xì)胞增殖數(shù)量的影響 與對照組相比，含藥血清組和順鉑組EdU 染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（均P＜0.05），即細(xì)胞增殖能力下降；與順鉑組相比，含藥血清+順鉑組EdU 染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2（插頁）。

圖2 含藥血清對細(xì)胞增殖數(shù)量的影響（A：4 組細(xì)胞增殖情況，×200；B：4 組細(xì)胞EdU 染色陽性數(shù)比較）

2.3 含藥血清對細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 與對照組比較，含藥血清組和順鉑組細(xì)胞凋亡率和S 期細(xì)胞占比顯著升高（均P＜0.05）；與順鉑組比較，含藥血清+順鉑組細(xì)胞凋亡率和S 期細(xì)胞占比顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 含藥血清對細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響（A：4 組細(xì)胞凋亡情況；B：4 組細(xì)胞凋亡率比較；C：4 組細(xì)胞周期情況；D：4 組細(xì)胞S期占比比較）

2.4 含藥血清對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 與對照組比較，含藥血清組和順鉑組細(xì)胞遷移速度減慢，侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少（均P＜0.05）；與順鉑組比較，含藥血清+順鉑組細(xì)胞遷移減慢，侵襲數(shù)量顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 含藥血清對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（A：各組細(xì)胞遷移情況，×100；B：各組細(xì)胞劃痕閉合率比較；C：各組細(xì)胞侵襲情況，×200；D：各組細(xì)胞侵襲數(shù)量比較）

2.5 含藥血清對細(xì)胞Caspase-3 和PI3K/Akt 通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，含藥血清組和順鉑組細(xì)胞p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與順鉑組比較，含藥血清+順鉑組細(xì)胞p-PI3K和p-Akt 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5。

圖5 含藥血清對細(xì)胞p-PI3K、p-Akt 和Caspase-3 蛋白表達(dá)影響（A：蛋白電泳圖；B：蛋白表達(dá)的比較）

3 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中并無“肝癌”這一病名，隨著時(shí)代發(fā)展，當(dāng)代醫(yī)生在傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)下，逐漸對其病因形成一定認(rèn)識[14]。氣滯血瘀是腫瘤形成發(fā)展的主要病理機(jī)制，氣滯可致血瘀，血瘀亦能加重氣滯，故疏肝理氣法是治療本病的主要治法之一。《金匱要略》言“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”。故健脾益氣法在肝癌及其轉(zhuǎn)移的治療中是一種極其重要的方法。參芍消瘤方中牛黃清熱化痰，散結(jié)解毒消腫；麝香辛香走竄，活血通絡(luò)止痛，并助牛黃化痰散結(jié)消腫；丹參活血化瘀，涼血消癰；莪術(shù)為血中氣藥，行氣破血消積；柴胡疏肝理氣行血，配以白芍養(yǎng)血柔肝，緩急止痛；黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓健脾益氣以助中土，使脾氣行則氣血行，痰水消；炮甲善疏通經(jīng)絡(luò)、活瘀血、消癰腫、治惡瘡；蛇舌草清肝熱，解邪毒，抗癌消癥。全方共奏清熱解毒，活血破瘀消癥，軟堅(jiān)散結(jié)，健脾理氣之功。血清藥理學(xué)是一種利用動物含藥血清進(jìn)行中藥體外藥理研究的藥理學(xué)方法，具有體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，在中藥藥理研究中被廣泛應(yīng)用[15-16]。本研究制備參芍消瘤方含藥血清作用于人肝癌細(xì)胞Bel-7402，結(jié)果顯示含藥血清可有效抑制Bel-7402 細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，含藥血清與順鉑聯(lián)合使用對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用比順鉑單獨(dú)使用更好，提示參芍消瘤方含藥血清可有效抑制Bel-7402 細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，建議與順鉑聯(lián)合使用。

不受控制地增殖和細(xì)胞長時(shí)間存活是癌細(xì)胞的主要特征，腫瘤的形成是各種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子異常表達(dá)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定或凋亡途徑改變的結(jié)果[17]。大量研究顯示，激活PI3K/Akt 信號通路可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18-19]。Caspase-3 是線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白，Caspase-3 蛋白表達(dá)上調(diào)時(shí)，肝癌細(xì)胞凋亡增加，Akt/Caspase-3 通路在肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[20-22]。本研究結(jié)果顯示，參芍消瘤方含藥血清干預(yù)Bel-7402 細(xì)胞后，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡率顯著升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 通路蛋白表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高，含藥血清與順鉑聯(lián)合使用對細(xì)胞周期、凋亡及PI3K/Akt 通路蛋白的作用比順鉑單獨(dú)使用更好，提示參芍消瘤方可能通過抑制PI3K/Akt 信號通路調(diào)控Bel-7402 細(xì)胞的周期、凋亡等生物學(xué)行為。

綜上所述，參芍消瘤方含藥血清可抑制Bel-7402細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且與抗癌藥物順鉑聯(lián)合使用后對人肝癌細(xì)胞Bel-7402 生物學(xué)行為的影響優(yōu)于順鉑單獨(dú)作用，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt 信號通路有關(guān)。后期研究可關(guān)注參芍消瘤方活性成分的分析，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為挖掘參芍消瘤治療肝癌的潛在靶點(diǎn)提供支持。