UPLC法測定嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1

楊雅雯 張美秀 蒲小春

摘 要：目的：研究嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的超高效液相色譜測定方法。方法：樣品經(jīng)甲醇-水溶液提取，上清液稀釋，經(jīng)免疫親和柱凈化和富集，再氮吹復(fù)溶后，用超高效液相色譜儀（熒光檢測器）分析測定。結(jié)果：黃曲霉毒素M1在0.051 5～5.150 0 ng·mL-1線性良好，回歸方程為Y=4.00×105X-8.74×103，相關(guān)系數(shù)為0.999 867，檢出限為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1；加標(biāo)回收率在81.0%～90.3%，變異系數(shù)為0.72%～3.18%，且正確度較好。結(jié)論：該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，適用于測定嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的測定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜；黃曲霉毒素M1；嬰幼兒配方奶粉

Determination of Aflatoxin M1 in Infant Formula Milk Powder by UPLC

YANG Yawen， ZHANG Meixiu， PU Xiaochun

（Meilu Biotech Co.， Ltd.， Jiujiang 332000， China）

Abstract： Objective： To study the determination of aflatoxin M1 in infant formula milk powder by ultra-high performance liquid chromatography. Method： The sample was extracted by methanol-water solution， diluted by supernatant， purified and enriched by immunoaffinity column， and then dissolved by nitrogen blowing， then analyzed and determined by ultra-high performance liquid chromatography （fluorescence detector）. Result： The linearity of aflatoxin M1 was good in 0.051 5～5.150 0 ng·mL-1， the regression equation was Y=4.00×105X-8.74×103， the correlation coefficient was 0.999 867， and the detection limit was 0.02 μg·kg-1， limit of quantitation was 0.05 μg·kg-1； The recovery rate of spiking was 81.0%～90.3%， CV was 0.72%～3.18%， and the accuracy was good. Conclusion： The method has high sensitivity and accuracy， and is suitable for the determination of aflatoxin M1 in infant formula milk powder.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography; aflatoxin M1; infant formula milk powder

黃曲霉毒素M1是一種有機(jī)化合物，主要用于新陳代謝和致癌性的研究。由于黃曲霉毒素具有強(qiáng)致癌性，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將其列為1類致癌物[1]。當(dāng)哺乳動(dòng)物食用黃曲霉毒素污染的食物后，代謝物會分泌到乳汁中造成污染[2-3]。黃曲霉毒素M1的檢測方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法[4-6]、液相色譜法[6-9]和酶聯(lián)免疫法[6，10]等。其中酶聯(lián)免疫法檢測操作快速、方便，檢測成本相對較低，應(yīng)用廣泛；液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法準(zhǔn)確度高，靈敏度好，但液質(zhì)聯(lián)用法所需設(shè)備昂貴，檢測成本高。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》（GB 5009.24—2016）中規(guī)定使用酶聯(lián)免疫法檢出有黃曲霉毒素M1時(shí)，需使用液相色譜法或是液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行確認(rèn)。在使用液相色譜法檢測黃曲霉毒素M1時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素M1對液相色譜儀熒光檢測器的靈敏度要求較高，一般的熒光檢測器靈敏度度無法滿足GB 5009.24—2016中規(guī)定的特殊膳食食品中黃曲霉毒素M1檢出限為0.02 μg·kg-1的要求。本研究采用超高效液相色譜儀（Ultra-High Performance Liquid Chromatography，UPLC）的快速高通量熒光檢測器進(jìn)行黃曲霉毒素M1的檢測，并對液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇，色譜級，F(xiàn)isher；氯化鈉、氯化鉀，分析純，天津永大；磷酸氫二鈉，分析純，西隴化工；磷酸二氫鉀，分析純，西亞試劑；鹽酸，分析純，科隆化學(xué)品；黃曲霉毒素M1免疫親和柱，浙江月旭。黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液，上海安譜。

超高效液相色譜儀（配有熒光檢測器），Waters；分析天平，賽多利斯；水浴鍋，江蘇金怡；旋渦振蕩器，海門其林貝爾；超聲波清洗儀，國環(huán)高科；離心機(jī)，湖南湘儀；固相萃取儀，博納艾杰爾；氮吹儀，奧盛儀器。

1.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18柱，100 mm×2.1 nm，1.7 μm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A相為水，B相為乙腈。等度洗脫條件：A，70%；B，30%。流速：0.2 mL·min-1。熒光檢測波長：發(fā)射波長365 nm；激發(fā)波長：435 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10.3 μg·mL-1）用乙腈稀釋成濃度為103 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL至10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，配制為0.051 5 ng·mL-1、0.103 0 ng·mL-1、0.515 0 ng·mL-1、1.030 0 ng·mL-1、2.060 0 ng·mL-1和5.150 0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

樣品提取參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》（GB 5009.24—2016）第二法高效液相色譜法12.1進(jìn)行處理后，樣液備用。

1.4.2 凈化

免疫親和柱取出恢復(fù)至室溫。將免疫親和柱連接于50 mL注射器下，空氣壓力泵與免疫親和柱連接，免疫親和柱內(nèi)的液體放空后，將上述樣液移至50 mL注射器筒中，調(diào)節(jié)壓力使溶液以2～3 mL·min-1（1～2滴/s）流速緩慢通過免疫親和柱，至溶液全部抽空。更換10 mL注射器與親和柱連接，在注射器中加入10 mL水，調(diào)節(jié)壓力使水以6 mL·min-1流速清洗親和柱；準(zhǔn)確加入4 mL乙腈洗脫，流速為1～2 mL·min-1，收集全部洗脫液于玻璃試管中，在50 ℃下氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，用初始流?dòng)相定容至1 mL，渦旋30 s溶解殘留物，用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 檢測波長選擇

在相同儀器條件下噪音水平相當(dāng)，峰高越高靈敏度越高。對比不同波長的響應(yīng)效果，在其他條件一致的情況下，發(fā)射波長365 nm，激發(fā)波長435 nm處的峰響應(yīng)比發(fā)射波長360 nm，激發(fā)波長430 nm處的峰響應(yīng)更高，見圖1。因此選用發(fā)射波長365 nm，激發(fā)波長435 nm。

2.1.2 流動(dòng)相選擇

對比水-（甲醇+乙腈）（70∶30）、水-（甲醇+乙腈）（75∶25）、水-乙腈（70∶30）和水-乙腈（75∶25）4種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)使用水-乙腈、水-（甲醇+乙腈）均能夠有效分離黃曲霉毒素M1。由圖2可以看出，使用水-乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí)，峰響應(yīng)要優(yōu)于水-（甲醇+乙腈）的流動(dòng)相體系。水-乙腈（70∶30）的流動(dòng)相體系和水-乙腈（75∶25）的流動(dòng)相體系可以獲得相似的保留情況，但使用水-乙腈（70∶30）作為流動(dòng)相可以獲得更尖銳的峰形，從而提高靈敏度。因此本文選擇使用水-乙腈（70∶30）作為流動(dòng)相。

2.2 方法的線性范圍、檢出限及定量限

采用質(zhì)量濃度為0.051 5 ng·mL-1、0.103 0 ng·mL-1、0.515 0 ng·mL-1、1.030 0 ng·mL-1、2.060 0 ng·mL-1和5.150 0 ng·mL-1黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)樣分析，以黃曲霉毒素M1濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，黃曲霉毒素M1在0.051 5～5.150 0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，線性方程為Y=4.00×105X-8.74×103，相關(guān)系數(shù)為0.999 867。

2.3 方法的檢出限和定量限

以3倍基線噪音時(shí)的濃度為檢出限衡量指標(biāo)（S/N≥3），黃曲霉毒素M1在0.02 μg·kg-1濃度添加量的信噪比（S/N）12.06＞3。以10倍基線噪音時(shí)的濃度為定量限衡量指標(biāo)（S/N≥10），黃曲霉毒素M1在0.05 μg·kg-1添加量的信噪比38.62＞10。方法的檢出限、定量限符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 黃曲霉毒素M1的測定》（GB 5009.24—2016）的規(guī)定。

2.4 方法回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取空白樣品3組，每組6份，分低、中、高3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)量為0.07 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1，按照1.4步驟處理后進(jìn)行測定，計(jì)算平行樣品黃曲霉毒素M1測定結(jié)果的回收率和精密度，結(jié)果見表1?！秾?shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F.1回收率中規(guī)定被測組分含量＜0.1 mg·kg-1，回收率在60%～120%；附錄F.3精密度中規(guī)定被測組分含量≤0.1 μg·kg-1時(shí)，變異系數(shù)＜43%，被測組分含量在0.1～1.0 μg·kg-1時(shí)變異系數(shù)小于30%[11]。本實(shí)驗(yàn)平均加標(biāo)回收率為81.0%～90.3%，變異系數(shù)為0.72%～3.18%，符合要求。

2.5 正確度

選用中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心的能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行黃曲霉毒素M1的檢測，檢測結(jié)果見表2。由表2可知，本實(shí)驗(yàn)室與能力驗(yàn)證樣品指定值的檢測偏差為0.36%，說明該方法正確度較好。

2.6 樣品分析

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中規(guī)定嬰幼兒配方食品黃曲霉毒素M1不得超過0.5 μg·kg-1[12]。隨機(jī)抽取某公司的嬰幼兒配方產(chǎn)品3批次，使用該方法進(jìn)行黃曲霉毒素M1的測定，結(jié)果均為未檢出（＜0.02 μg·kg-1），檢測結(jié)果符合限量要求。

3 結(jié)論

本文建立了測定嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的超高效液相色譜法，結(jié)果表明該方法的檢出限、定量限、回收率、精密度及正確度較好，能夠用于嬰幼兒配方奶粉中黃曲霉毒素M1的準(zhǔn)確測定。

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作者簡介：楊雅雯（1987—），女，江西九江人，本科，助理工程師。研究方向：食品檢測。