百香果全果制備果醋發(fā)酵工藝研究

龐情 劉四新 余森艷 盧珍蘭

摘要：以成熟次級紫皮百香果全果為原料，采用酶解法降解果皮中的纖維素等大分子物質(zhì)，并用纖維素酶、果膠酶復(fù)合酶解果漿，經(jīng)過酵母菌、醋酸菌兩次發(fā)酵作用釀制果醋。利用單因素試驗、正交試驗優(yōu)化果醋發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。最終確定百香果果醋酒精發(fā)酵階段的最佳工藝參數(shù)為酵母添加量0.05%、初始糖度20 °Brix、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間9 d；醋酸發(fā)酵階段的最佳工藝參數(shù)為醋酸菌添加量8%、初始酒精度7%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間9 d。通過指標(biāo)分析和感官評價，最終制得的百香果果醋口感品質(zhì)好，風(fēng)味優(yōu)良。

關(guān)鍵詞：果醋；百香果全果；酒精發(fā)酵；醋酸發(fā)酵；復(fù)合酶解

中圖分類號：TS205.5? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0098-06

Abstract： The whole fruit of mature secondary purple-peel passion fruit is used as the raw material， the cellulose and other macromolecular substances in the peel are degraded by enzymolysis method， the fruit pulp is enzymolyzed by cellulase and pectinase， and the fruit vinegar is brewed by twice fermentation of yeast and acetic acid bacteria. The optimum technological parameters for brewing fruit vinegar are determined by single factor test and orthogonal test. Finally， the optimum technological parameters of alcohol fermentation of passion fruit vinegar are determined as follows： yeast addition amount is 0.05%， initial sugar content is 20 °Brix， fermentation temperature is 28 ℃ and fermentation time is 9 d; the optimum technological parameters of acetic acid fermentation are as follows： acetic acid bacteria addition amount is 8%， initial alcohol content is 7%， fermentation temperature is 32 ℃ and fermentation time is 9 d. Through index analysis and sensory evaluation， the obtained passion fruit vinegar has good taste quality and flavor.

Key words：fruit vinegar; whole passion fruit; alcohol fermentation; acetic acid fermentation; compound enzymolysis

收稿日期：2022-11-04

基金項目：2021年海南省科技創(chuàng)新發(fā)展計劃專項資金項目（HD-SYSZX-202109）；2021年海南省食品營養(yǎng)與功能食品重點實驗室項目（HD-SYSZX-202109）；2020年度廣西民族師范學(xué)院科研經(jīng)費資助項目（2020FG001）；2022年度廣西高等教育本科教學(xué)改革工程項目（2022JGB387）

作者簡介：龐情（1997－），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：盧珍蘭（1982－），女，高級工程師，碩士，研究方向：食品生物發(fā)酵技術(shù)及發(fā)酵產(chǎn)品。

百香果是草本植物西番蓮（Passiflora edulis）的果實，因富含多種水果的綜合香味而得名，又因其果實形狀和大小與雞蛋相似，故又名雞蛋果[1]。百香果果汁不僅香氣濃郁而且富含多種天然生理活性成分，如果膠類、多糖類、黃酮類、生物堿類、維生素類、必需氨基酸和多種微量元素，具有護(hù)膚美容、潤腸通便、抗癌、抗衰老、解毒、降血脂等多種保健功能[2]，尤其是黃酮類物質(zhì)，具有消減浮躁和減輕壓力的作用，并能益氣生津、養(yǎng)血寧神、增強食欲、促進(jìn)消化[3-4]。

近年水果消費市場十分活躍，優(yōu)良新品種層出不窮。百香果是近年水果市場的網(wǎng)紅品種，直接帶動了其種植和消費。目前其大多是以鮮果銷售或制成果汁，但百香果果皮約占鮮果重量的50%～55%，在制作果汁時成為廢棄物，利用度較低，因此對于糖酸比低、鮮食商品性差的次級果類開展全果利用的深加工研究十分必要，也具有重要的現(xiàn)實意義。況且果皮也含有較豐富的天然活性成分，如果膠類、黃酮類、多酚類、維生素類等，如果對果皮也能加以利用，便能充分發(fā)揮這些成分的功效[5-6]，這是有效提高百香果加工利用附加價值的手段，值得研究探討。

百香果富含糖酸成分，且香味濃郁，很適合釀制果醋，利用微生物的發(fā)酵作用將其成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可加工形成果香濃郁的新型發(fā)酵醋飲品[7]。研究表明，果醋因具有降血糖、降膽固醇、促進(jìn)血液循環(huán)、抗氧化、增強免疫力、延緩衰老等功能而被國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行廣泛研究[8-10]，相比于其他類型的飲料，果醋飲料集化食、保健和風(fēng)味于一身，市場開發(fā)有待加強拓展，而百香果因其品質(zhì)特征獨特，開發(fā)成醋飲料具有較好的市場前景。用百香果釀制的果醋最大程度上保留了百香果原料中的有益活性成分，還額外增加了發(fā)酵過程中微生物生長代謝產(chǎn)生的有益成分，具有較好的保健作用[11-12]。本研究充分利用成熟次級百香果，解決了百香果飲料加工產(chǎn)業(yè)浪費果皮資源的問題，以期為百香果全果果醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

成熟紫皮百香果（原料）：市售；白砂糖：昆明多悅多工貿(mào)有限公司；葡萄酒果酒專用酵母SY：安琪酵母股份有限公司；果醋菌（Acetobacterium Balch.）：煙臺帝伯仕酵母有限公司；纖維素酶（酶活力10 000 U/g）、果膠酶（酶活力≥60 000 U/g）：河南萬邦實業(yè)有限公司；0.05 mol/L NaOH（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 主要儀器

YS-002榨汁機(jī) 深圳市龍華區(qū)金尼熊電器廠；多功能電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司；GHP-9050恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；BSA24S電子分析天平 德國賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PAL-1數(shù)顯糖度計 廣州市愛拓電子科技有限公司；HB-512 ATC酒精度檢測儀 南北科儀（北京）科技有限公司；IS28C pH計 上海儀邁儀器科技有限公司；H1650臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 百香果全果制備果醋發(fā)酵工藝流程

新鮮百香果→挑選、清洗→破碎打漿→加纖維素酶、果膠酶酶解→加白砂糖調(diào)整糖度→裝罐→殺菌→冷卻→酵母活化→接種酵母→酒精發(fā)酵→粗過濾→果酒→蒸餾水調(diào)節(jié)酒精度→殺菌→冷卻→醋酸菌活化→接種醋酸菌→醋酸發(fā)酵→過濾離心→殺菌、口感調(diào)配→成品。

1.3.2 操作要點

原料：成熟無腐爛新鮮紫皮百香果。

制備果漿：百香果沖洗干凈后，其中百香果與水的質(zhì)量比為1∶3進(jìn)行打漿，然后加入酶總量為果漿質(zhì)量的0.12%，纖維素酶與果膠酶的配比為5∶1[13]，在50 ℃條件下酶解3.5 h。

滅菌：用糖液調(diào)節(jié)初始糖度后于65 ℃滅菌30 min，冷卻到常溫。

酵母活化：用5%的糖水溶解酵母后置于32 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min。

酒精發(fā)酵：將活化好的酵母接種到調(diào)整好初始糖度的發(fā)酵液中，置于一定恒溫發(fā)酵箱中恒溫發(fā)酵1～9 d進(jìn)行酒精發(fā)酵的單因素試驗，發(fā)酵過程中定期排氣，并定期定點測定發(fā)酵液的酒精度和可溶性固形物含量。

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，根據(jù)正交試驗結(jié)果并結(jié)合方差分析獲得最佳工藝條件。

取最佳工藝條件下制得的果酒，調(diào)節(jié)其初始糖度在7 °Brix左右，裝罐后于65 ℃殺菌30 min，冷卻至室溫。

醋酸發(fā)酵：在100 mL蒸餾水中加入0.1 g醋酸菌進(jìn)行活化，將活化后的醋酸菌按所需要量添加到果酒中，并用蒸餾水調(diào)節(jié)初始酒精度，用紗布蓋住瓶口，在一定溫度條件下恒溫發(fā)酵1～11 d，定期定點測定總酸度（以乙酸計）、可溶性固形物含量。

將醋酸發(fā)酵單因素試驗得到的結(jié)果進(jìn)行正交試驗分析，通過方差分析得到最佳組合，再進(jìn)行重復(fù)試驗，驗證試驗條件的準(zhǔn)確性。

用紗布過濾后，放入離心機(jī)中進(jìn)行離心處理，以3 500 r/min離心15 min；取上清液裝罐，于65 ℃條件下滅菌30 min，再添加糖調(diào)節(jié)口感即可得到成品。

1.3.3 百香果果漿酒精發(fā)酵工藝的優(yōu)化

1.3.3.1 酒精發(fā)酵單因素試驗

以酒精度和可溶性固形物含量為指標(biāo)，分別考察酵母添加量（0%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）、初始糖度（16，18，20，22，24 °Brix）、發(fā)酵溫度（26，28，30，32，34 ℃）、發(fā)酵時間（1，3，5，7，9 d）對百香果全果酒精發(fā)酵的影響，以期獲得最佳的工藝參數(shù)。

1.3.3.2 酒精發(fā)酵正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L9（34）設(shè)計正交試驗，以酵母添加量、初始糖度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為自變量，以酒精度為因變量，進(jìn)行四因素三水平正交試驗，每個試驗重復(fù)操作3次，以期獲得最佳的發(fā)酵方案。

1.3.4 百香果酒醪醋酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化

1.3.4.1 醋酸發(fā)酵單因素試驗

以總酸含量和可溶性固形物含量為指標(biāo)，分別考察醋酸菌添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、初始酒精度（4%、5%、6%、7%、8%）、發(fā)酵溫度（28，30，32，34，36 ℃）、發(fā)酵時間（3，5，7，9，11 d）對百香果全果醋酸發(fā)酵的影響，以期獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)。

1.3.4.2 醋酸發(fā)酵正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L9（34）設(shè)計正交試驗，以醋酸菌添加量、初始酒精度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為自變量，以總酸含量為因變量，進(jìn)行四因素三水平正交試驗，每個試驗重復(fù)操作3次，以期獲得最佳的發(fā)酵方案。

1.4 果醋品質(zhì)測定

將最佳工藝參數(shù)制備的果醋口感調(diào)配后，進(jìn)行3次測定，取平均值，分別測定總酸和可溶性固形物含量。總酸含量采用GB 12456－2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》進(jìn)行測定，可溶性固形物含量采用數(shù)顯糖度計測定。

1.5 感官評定指標(biāo)

果醋感官評分細(xì)則見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Office 2019 Excel進(jìn)行分析并繪圖，采用IBM-SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行一般線性模型單變量方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實處理及果漿制備

將百香果全果破碎打漿，果漿經(jīng)過酶解后變澄清，不再呈現(xiàn)黏稠狀，此時果漿的初始糖度在5.4～6 °Brix之間，初始pH在4.3～4.8之間。

2.2 果漿的酒精發(fā)酵

2.2.1 酵母添加量的確定

由圖1可知，隨著發(fā)酵液中酵母添加量的增多，可溶性固形物含量降低，酒精度則先上升后趨于平緩；不添加酵母，有發(fā)酵但是發(fā)酵作用微小，可能是因為果漿中仍含有微生物，可以利用營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行微弱的酒精發(fā)酵。當(dāng)酵母添加量達(dá)到0.05%時，酒精度達(dá)到最大，為8.2%，且發(fā)酵液的可溶性固形物含量也趨于平緩，表明此時的添加量能使酵母充分利用可溶性固形物發(fā)酵產(chǎn)生酒精。當(dāng)酵母添加量大于0.05%時，發(fā)酵液的酒精度略微降低，可能是過多的添加量導(dǎo)致酵母菌之間相互爭奪養(yǎng)分而不能正常地生長和產(chǎn)生酒精，從而抑制了酒精發(fā)酵。因此，選擇酵母添加量0.05%較為合適。

2.2.2 初始糖度的確定

由圖2可知，初始糖度為20 °Brix時，酒精度達(dá)最大值，為9.2%。等量的酵母在相同的條件下進(jìn)行發(fā)酵，會消耗相同的可溶性固形物等營養(yǎng)物質(zhì)，則初始糖度高的發(fā)酵液所剩余的可溶性固形物相對較多，所以可溶性固形物會不斷升高。當(dāng)初始糖度高于20 °Brix后，酒精度開始下降，可能是因為發(fā)酵液初始糖度高使酵母菌所處環(huán)境滲透壓加大，抑制酵母的發(fā)酵作用，本試驗結(jié)論與楊玉霞[13]所得結(jié)論相同，不同的是本研究采用的是成熟次級百香果，原發(fā)酵果漿中所含糖類較多，也可以為微生物提供額外碳源。因此，選擇發(fā)酵液的初始糖度20 °Brix較為合適。

2.2.3 發(fā)酵溫度的確定

由圖3可知，可溶性固形物含量隨著溫度的升高呈先快速降低后緩慢降低的趨勢，可能是因為在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酵母的生長活動越活躍，利用可溶性固形物的能力越強，則剩余的可溶性固形物越少。隨著溫度梯度的升高，酒精度先升高后下降，溫度升高，酵母利用可溶性固形物的能力越強，則酵母生長過程中產(chǎn)生的代謝物、乙醇、CO2等越多，酒精度越高。在發(fā)酵溫度為30 ℃時，酒精度達(dá)最高值，為9.5%。當(dāng)溫度達(dá)到32，34 ℃時，發(fā)酵液的酒精度反而下降，可能是因為溫度太高，不在酵母最適生長溫度范圍，酵母的生長受到抑制，酵母利用可溶性固形物的能力也受到抑制，導(dǎo)致產(chǎn)乙醇等能力下降，酒精度也隨之下降。因此，選擇發(fā)酵溫度30 ℃較為合適。

2.2.4 發(fā)酵時間的確定

由圖4可知，酒精度隨著發(fā)酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢，這是因為酵母利用了可溶性固形物中的糖分等營養(yǎng)物質(zhì)不斷進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙醇、CO2等物質(zhì)，使得酒精度逐漸上升。當(dāng)繼續(xù)發(fā)酵到第7天時，酒精度達(dá)到最大，為8.4%，此時的可溶性固形物含量處于較低值，即可認(rèn)為發(fā)酵接近終點。當(dāng)發(fā)酵時間超過7 d后，酒精度反而降低，原因可能是發(fā)酵時間過長，發(fā)酵液中積累了大量的次級代謝產(chǎn)物，抑制了酵母的生長。因此，選擇發(fā)酵時間7 d較為合適。

2.3 酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化

由單因素試驗結(jié)果建立四因素三水平L9（34）正交試驗表，每個試驗重復(fù)操作3次。正交試驗因素與水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3極差R分析可知，4個因素對酒精發(fā)酵的影響順序為A>B>C>D，即酵母添加量>初始糖度>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間。由表4方差分析可知，酵母添加量對酒精發(fā)酵結(jié)果的影響極顯著（P<0.01），初始糖度的影響顯著（P<0.05），而發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對結(jié)果沒有顯著性影響（P>0.05）。再由k值確定最佳組合是A2B2C2D3，綜合考慮各因素對結(jié)果的影響情況，選擇最佳工藝參數(shù)為酵母添加量0.05%、發(fā)酵果漿初始糖度20 °Brix、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間9 d，此時酒精度達(dá)到11.18%。

2.4 果漿的醋酸發(fā)酵

2.4.1 醋酸菌添加量的確定

由圖5可知，隨著醋酸菌添加量的增大，總酸含量也隨之增加，而可溶性固形物含量卻逐漸降低。因為醋酸菌能夠?qū)⒕凭D(zhuǎn)化為醋酸，生成醋，醋酸菌添加量越大，其轉(zhuǎn)化酒精的速度越快，總酸含量越多，當(dāng)醋酸菌添加量為8%時，總酸含量達(dá)到峰值，為3.68 g/dL。為醋酸菌添加量超過8%后，總酸含量略微下降，原因可能是醋酸菌過多，醋酸菌之間相互爭奪生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，其中一部分醋酸作為醋酸菌的碳源被消耗掉，使得總酸含量降低，而可溶性固形物含量趨于平緩，所以選擇醋酸菌添加量8%較為合適。

2.4.2 初始酒精度的確定

由圖6可知，發(fā)酵液酒精度被稀釋后，隨著初始酒精度的增加，總酸含量呈先上升后下降的趨勢。初始酒精度為4%和5%時，產(chǎn)酸量低，當(dāng)酒精度增加到7%時，總酸含量達(dá)到最大值，為4.12 g/dL，當(dāng)酒精度增加到8%時，總酸含量反而下降，可能是酒精度高抑制了醋酸菌的生長，導(dǎo)致產(chǎn)酸量偏低?？扇苄怨绦挝锖侩S著酒精度的增加而降低，可能是醋酸菌生長繁殖過程中利用了可溶性固形物中的糖分等營養(yǎng)物質(zhì)。綜上，選擇發(fā)酵液的初始酒精度7%較為合適。

2.4.3 醋酸發(fā)酵溫度的確定

由圖7可知，總酸含量隨著溫度的升高而上升。當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃時，總酸含量達(dá)到最大值，為4.23 g/dL；溫度為34 ℃時總酸含量反而下降，可能是由于溫度過高抑制了醋酸菌的生長，導(dǎo)致產(chǎn)酸能力下降。所以，選擇發(fā)酵溫度32 ℃較為合適。

2.4.4 醋酸發(fā)酵時間的確定

由圖8可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵越充分，總酸含量越多，而可溶性固形物含量下降，當(dāng)發(fā)酵到第9天時，總酸含量達(dá)到最大值，為4.31 g/dL。發(fā)酵到第11天和第13天時，發(fā)酵液總酸含量略微下降，可能是因為代謝產(chǎn)物的積累抑制了醋酸菌的產(chǎn)酸能力。因此，選擇發(fā)酵時間9 d較為合適。

2.5 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，建立四因素三水平L9（34）正交試驗表，每個試驗重復(fù)操作3次。正交試驗因素與水平表見表5，正交試驗結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

由表6極差R分析可知，4個因素對醋酸發(fā)酵的影響順序為E>G>H>F，即醋酸菌添加量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>初始酒精度。由表7方差分析可知，醋酸菌添加量（E）對發(fā)酵產(chǎn)醋酸的影響極顯著（P<0.01），初始酒精度（F）、發(fā)酵溫度（G）、發(fā)酵時間（H）對發(fā)酵產(chǎn)醋酸的影響顯著（P<0.05）。對均值k大小分析可確定最佳組合是E2F2G3H2。由于此最佳組合不在正交分析試驗中，因此按照該工藝即醋酸菌接種量8%、初始酒精度7%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間9 d進(jìn)行驗證性試驗，重復(fù)平行試驗3次，測得發(fā)酵液中總酸含量分別為4.75，4.78，4.73 g/dL，即平均值為4.75 g/dL，與正交試驗中5號試驗測得數(shù)值相近，故確定E2F2G3H2為最佳發(fā)酵工藝組合，即百香果果醋最佳工藝參數(shù)為醋酸菌添加量8%、初始酒精度7%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間9 d。

2.6 感官、理化指標(biāo)

2.6.1 感官評價結(jié)果

將最佳工藝組合釀制的百香果全果果醋飲品口感調(diào)配后，進(jìn)行綜合感官評分。評價小組由經(jīng)過訓(xùn)練學(xué)習(xí)的食品專業(yè)同學(xué)組成（男、女各10人），分別根據(jù)表1果醋感官評分細(xì)則進(jìn)行評定后取平均值，結(jié)果見表8。

由表8可知，百香果果醋口感品質(zhì)和風(fēng)味均優(yōu)良，綜合評分為89分。

2.6.2 理化指標(biāo)

將最佳工藝參數(shù)制備的百香果全果果醋口感調(diào)配后，進(jìn)行3次平行測定取平均值，獲得總酸含量（以乙酸計）為3.75 g/dL；可溶性固形物含量為9 °Brix，符合GB 18187－2000《釀造食醋》中規(guī)定的總酸（以乙酸計）≥3.5 g/dL的指標(biāo)。

3 小結(jié)

本試驗設(shè)計是以成熟次級紫皮百香果全果為原料，采用復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶）對果漿中纖維素等大分子進(jìn)行降解處理，通過對酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵這兩個階段的試驗探究，最后獲得百香果全果果醋在酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。酒精發(fā)酵階段的最佳工藝參數(shù)為酵母添加量0.05%、初始糖度20 °Brix、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間9 d；醋酸發(fā)酵階段的最佳工藝參數(shù)為醋酸菌添加量8%、初始酒精度7%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間9 d。

與其他研究不同，本研究采用的是成熟次級紫皮百香果，水果中的糖類物質(zhì)會發(fā)酵成醇類，醇類與有機(jī)酸反應(yīng)會生成各種芳香酯類，所以果醋中百香果味更濃郁。且優(yōu)化后制得的百香果果醋成品，呈橙紅色且透亮清明；酸甜適宜無異味；液體均勻透亮、無肉眼可見雜質(zhì)。

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