三種投入品對(duì)克氏原螯蝦抗氧化酶、丙二醛、磷酸酶和溶菌酶的影響

王 寧，鄭 堯，，劉祝萍，張鳳翔，孔繁彬，孟順龍，陳家長(zhǎng)，

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214128；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214081；3.興化市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，江蘇興化 225700；4.興化市香湖糧食種植家庭農(nóng)場(chǎng)，江蘇興化 225700)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)又名小龍蝦，也稱為紅螯蝦和淡水小龍蝦，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，其風(fēng)味獨(dú)特，肉質(zhì)鮮美且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[1]，隨著其種群的擴(kuò)展和養(yǎng)殖活動(dòng)的增加，在長(zhǎng)江中、下游地區(qū)，已形成可供利用的龐大種群[2]。在克氏原螯蝦養(yǎng)殖過(guò)程中，養(yǎng)殖戶常使用硫酸銅和青苔凈殺滅因投料過(guò)多以及使用水質(zhì)改良劑產(chǎn)生的藍(lán)藻及青苔。在其他水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中硫酸銅應(yīng)用也比較廣泛，但存在過(guò)量使用的情況，且面源殘留的銅離子也會(huì)流入養(yǎng)殖水體，造成銅離子超標(biāo)[3]。興化蝦蟹混養(yǎng)模式在江蘇等省份廣泛推廣，該模式主要特點(diǎn)是收集和定量放養(yǎng)抱仔蝦[4]，期間養(yǎng)殖戶為了管理方便，常使用草甘膦去除塘邊雜草，部分草甘膦便隨地表徑流流入池塘導(dǎo)致克氏原螯蝦面臨染毒風(fēng)險(xiǎn)。

肝胰腺是甲殼動(dòng)物消化、吸收、儲(chǔ)存和代謝功能的重要器官[5]，環(huán)境脅迫會(huì)導(dǎo)致肝胰腺中抗氧化酶活力和其他相關(guān)酶活力的變化，研究表明銅離子對(duì)鯉(Cyprinuscarpio)[3]、麥穗魚(yú)(Pseudorasboraparva)[6]、銀鮭(Oncorhynchuskisutch)[7]、泥魚(yú)(Labeocapensis)和大口黑鱸(Micropterussalmoides)[8]等魚(yú)類造成肝胰臟急性毒性，青苔凈進(jìn)入動(dòng)物體后會(huì)引起繼發(fā)性溶血反應(yīng)[9]，草甘膦對(duì)水生動(dòng)物也具有一定的毒性[10，11]，但實(shí)驗(yàn)中的投入品濃度是否會(huì)影響克氏原螯蝦肝胰臟毒性不得而知。本研究旨在探究三種常用投入品對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化酶、丙二醛、磷酸酶和溶菌酶活性的影響，為克氏原螯蝦健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)蝦體長(zhǎng)(81.69±3.65)mm，體質(zhì)量(21.31±2.07)g，取自興化市香湖糧食種植家庭農(nóng)場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)室中暫養(yǎng)7 d后，挑選體格健壯、健康的克氏原螯蝦置于玻璃缸(63 cm×43 cm×45 cm)中，注入15 L曝氣自來(lái)水，暫養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水溫控制在(18.5±2.3)℃，pH為7.5±0.6，溶解氧為(8.6±2.9)mg/L，正常投餌，每日光暗比12 h ∶12 h。

硫酸銅(優(yōu)級(jí)純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，青苔凈[主要成分二甲戊樂(lè)靈(Pendimethalin)含量40%]購(gòu)自中水漁藥有限公司，草甘膦(有效成分草甘膦含量為30%，草甘膦異丙胺鹽含量41%)購(gòu)自澳大利亞拜迪斯有限公司。

參考實(shí)際生產(chǎn)中使用濃度設(shè)置對(duì)照、CuSO4(1和2 mg/L，分別記為CuⅠ、CuⅡ組)、青苔凈(5和10 μg/L，分別記為PⅠ、PⅡ組)、草甘膦(5 μg/L和10 μg/L，分別記為GⅠ、GⅡ組)，每組設(shè)置三個(gè)平行，每個(gè)平行10只個(gè)體。實(shí)驗(yàn)期間正常投餌，采用半靜水式養(yǎng)殖方法，不間斷微量充氧，暴露期間每24 h換水1/3并補(bǔ)足藥物，分別于第4、8和12 d于冰上采集克氏原螯蝦的肝胰腺，取出后放置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 酶活性測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取待測(cè)組織的質(zhì)量，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1 ∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，用電動(dòng)研磨器充分研磨后，在冷凍離心機(jī)(2 500 r/min，4 ℃)離心10 min，取上清液(10%組織勻漿液)，放入2 mL離心管中，待測(cè)。

蛋白定量(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、還原型谷胱甘肽(GSH)、總抗氧化能力(T-AOC))、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,測(cè)定步驟按試劑盒進(jìn)行。其中,TP、SOD、CAT、MDA的測(cè)定分別采用托馬斯亮藍(lán)法、WST-1法測(cè)定、鉬酸鹽法、TBA法。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，采用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，多個(gè)樣本均數(shù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以Duncan法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪圖采用OriginPro 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦抗氧化酶活性的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)暴露期間，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組的SOD、CAT和GPX活性均表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)(圖1a，圖1b，圖1f)，8 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組。CuⅠ實(shí)驗(yàn)組GR活性表現(xiàn)出持續(xù)升高的變化趨勢(shì)(圖1c)，8 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，而其他實(shí)驗(yàn)組則表現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢(shì)(圖1)。6個(gè)實(shí)驗(yàn)組的GSH活性表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)(圖1d)，4 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組。6個(gè)實(shí)驗(yàn)組的T-AOC活性表現(xiàn)出持續(xù)降低的變化趨勢(shì)(圖1e)，4 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組。8 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組的SOD、CAT、GR和GPX活性均顯著高于對(duì)照組且實(shí)驗(yàn)組的SOD、CAT、GSH和GPX活性在8 d時(shí)達(dá)到最大值；T-AOC活性在4 d時(shí)達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。

圖1 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of three inputs on the activity of antioxidant enzymes in the hepatopancreas of P.clarkii處理組與對(duì)照組之間存在顯著差異用不同小寫字母表示(P<0.05)，下同。

2.2 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦MDA含量的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)暴露期間，CuⅠ、CuⅡ、PⅠ、PⅡ、GⅡ組MDA含量表現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢(shì)(圖2)，GⅠ實(shí)驗(yàn)組MDA含量表現(xiàn)出持續(xù)升高的變化趨勢(shì)(圖2)，12 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組MDA含量顯著高于對(duì)照組，青苔凈和草甘膦暴露下MDA含量在12 d時(shí)達(dá)到最大。

圖2 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺M(fèi)DA含量的影響Fig.2 Effects of three inputs on MDA content in P.clarkii hepatopancreas

2.3 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦ACP和AKP活性的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)暴露期間，CuⅠ、PⅠ、GⅠ、GⅡ?qū)嶒?yàn)組ACP活性表現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢(shì)(圖3a)，CuⅡ、PⅡ?qū)嶒?yàn)組ACP活性表現(xiàn)出持續(xù)上升的變化趨勢(shì)(圖3a)。 CuⅠ、CuⅡ、PⅠ、PⅡ濃度組AKP活性表現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢(shì)(圖3b)，GⅠ、GⅡ濃度組AKP活性表現(xiàn)出持續(xù)上升的變化趨勢(shì)(圖3b)，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組12 d時(shí)ACP活性達(dá)到最大值。

圖3 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺磷酸酶(ACP和AKP)活性的影響Fig.3 Effects of three inputs on the activity of hepatopancreatic phosphatase(ACP and AKP)in P.clarkii

2.4 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦LZM活性的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)暴露期間，CuⅠ、CuⅡ、GⅠ、GⅡ?qū)嶒?yàn)組LZM活力表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)(圖4)，PⅠ、PⅡ?qū)嶒?yàn)組LZM活力表現(xiàn)出持續(xù)下降的變化趨勢(shì)，8 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組LZM活性均高于對(duì)照組。

圖4 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺LZM活性的影響Fig.4 Effects of three inputs on LZM activity of P.clarkii hepatopancreas

3 討論

3.1 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化酶活性的影響

T-AOC的大小反映了機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對(duì)外來(lái)刺激的代償能力以及自由基的代謝狀態(tài)[22]，可以反映機(jī)體的抗氧化能力。本研究結(jié)果也表明，當(dāng)機(jī)體內(nèi)與抗氧化相關(guān)的酶活性升高時(shí)，T-AOC的活性也出現(xiàn)了提升。投入品長(zhǎng)時(shí)間作用下會(huì)引起機(jī)體的代償失調(diào)、抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞[23]，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體損傷。本研究表明，克氏原螯蝦在本實(shí)驗(yàn)濃度投入品毒性下抗氧化酶類活性受到影響，12 d時(shí)抗氧化相關(guān)酶均有不同程度的降低，但若長(zhǎng)時(shí)間處于相應(yīng)環(huán)境下，可能因超過(guò)自由基清除能力進(jìn)而對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)造成損傷。

3.2 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺M(fèi)DA含量的影響

脂質(zhì)過(guò)氧化之后的主要產(chǎn)物是MDA，MDA含量可直接反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)弱[24]，間接反映氧化損傷的程度，MDA能降低細(xì)胞膜的通透性與流動(dòng)性[25]，其含量隨機(jī)體的氧化應(yīng)激水平的升高而增加[26]，且含量越高表明機(jī)體遭受損傷的程度越大。含污染物化工區(qū)溪流水體中斑馬魚(yú)肝臟MDA含量隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢(shì)[27]，實(shí)驗(yàn)中4～8 d時(shí)，Cu Ⅰ、Cu Ⅱ、P Ⅰ、P Ⅱ、G Ⅱ處理組CAT活性處于升高趨勢(shì)，MDA含量出現(xiàn)降低，這是由于CAT可以抑制MDA的生成；8～12 d，CAT活性降低，此時(shí)實(shí)驗(yàn)中各濃度組MDA含量表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，并在12 d時(shí)除CuⅡ濃度組外均達(dá)到最大值，宋玥頤[15]也發(fā)現(xiàn)0.1、0.5和1 mg/L氟苯蟲(chóng)酰胺處理斑馬魚(yú)14 d后，斑馬魚(yú)肝臟MDA含量顯著增加，這與本實(shí)驗(yàn)吻合。

3.3 三種投入品對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺磷酸酶(ACP、AKP)和LZM活性的影響

ACP、AKP和LZM是參與生物體生長(zhǎng)代謝、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及維持機(jī)體健康所必需的酶，對(duì)生物體的免疫作用具有重要意義。王麗梅等[28]發(fā)現(xiàn)0.83、4.15和20.77 mg/L環(huán)氧丙烷處理刺參(Stichopusjaponicus)48和72 h后其體腔液AKP、ACP活性增強(qiáng)，彭軍輝等[29]證實(shí)擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)體內(nèi)ACP和AKP活性隨氨氮脅迫時(shí)間的增加而升高，沈敏等[30]發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫下凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)體內(nèi)ACP活性升高，酸性磷酸酶(ACP)是溶酶體的一種標(biāo)志酶，主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的消化和吸收。其中ACP會(huì)在生物體血淋巴免疫反應(yīng)中被釋放，對(duì)入侵物質(zhì)進(jìn)行吞噬和包圍[31]，AKP參與生物體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如脂質(zhì)、糖類、鈣和無(wú)機(jī)磷酸鹽的吸收[32]，AKP能提高生物對(duì)體內(nèi)物質(zhì)的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)和清除異物能力[33]。實(shí)驗(yàn)中ACP和AKP活性總體上表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，表明外來(lái)物質(zhì)增多或機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的降解速度升高，需要ACP和AKP活性的增高來(lái)應(yīng)對(duì)這種變化。溶菌酶來(lái)自單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，是一種具有抗菌能力的水解酶，能使細(xì)菌破裂，可以在一定程度上反映魚(yú)類非特異性體液免疫狀態(tài)，是非常重要的非特異性免疫評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。張瑞標(biāo)等[34]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加沼澤紅假單胞菌后，皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)LZM活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這與本實(shí)驗(yàn)CuⅠ、CuⅡ、GⅠ、GⅡ濃度組的變化趨勢(shì)是一致的，LZM活力下降可能是長(zhǎng)時(shí)間的投入品脅迫導(dǎo)致克氏原螯蝦肝胰腺內(nèi)生理紊亂，導(dǎo)致其免疫功能降低，從而LZM活力下降。

4 結(jié)論

(1)三種投入品擾亂克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化酶系統(tǒng)，造成脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高。

(2)克氏原螯蝦肝胰腺SOD、CAT、GPX、GSH活性先被誘導(dǎo)后抑制減弱，處理后期ACP和AKP活性均被誘導(dǎo)；青苔凈和草甘膦暴露下GR活性先被誘導(dǎo)后抑制減弱；MDA含量顯著增加；硫酸銅和草甘膦暴露下，LZM活性先被誘導(dǎo)后抑制減弱。