腦泰方含藥血清對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

宋洋　陳瑤　胡立娟　王璇　葛金文

〔摘要〕 目的 探討腦泰方含藥血清通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路調(diào)控缺氧缺糖/復(fù)氧PC12細(xì)胞凋亡，從而闡明腦泰方對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法 將PC12細(xì)胞分為正常組（常規(guī)培養(yǎng)）、模型組（OGD/R）、抑制劑（4-PBA）組及腦泰方低濃度（10%）、中濃度（15%）、高濃度（20%）組。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力；采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）試劑盒檢測(cè)LDH活性；Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化；Tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；免疫熒光法和Western blot檢測(cè)細(xì)胞Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、PERK蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 模型組LDH活性增加，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞存活率下降（P＜0.01），GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯增加，LC3Ⅰ蛋白表達(dá)減少（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，抑制劑（4-PBA）組、腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組LDH活性降低，細(xì)胞凋亡率減少，細(xì)胞存活率明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯降低，LC3Ⅰ蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 腦泰方含藥血清可有效抑制缺氧缺糖/復(fù)氧PC12細(xì)胞的凋亡，調(diào)控GRP78/PERK/CHOP信號(hào)通路，表明腦泰方可能緩解受損神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的過度自噬狀態(tài)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 腦泰方；腦缺血再灌注損傷；缺氧；缺糖；復(fù)氧；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；自噬

〔中圖分類號(hào)〕R259? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.009

Protective effects of Naotai Formula medicated serum on oxygen-glucose

deprivation/reoxygenation-induced injury of PC12 cells

SONG Yang CHEN Yao HU Lijuan WANG Xuan GE Jinwen

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the regulation of Naotai Formula medicated serum on the apoptosis of PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） through endoplasmic reticulum stress-related pathways， so as to demonstrate the mechanism of Naotai Formula's protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI）. Methods PC12 cells were divided into normal group （conventional culture）， model group （OGD/R）， inhibitor （4-PBA） group and low- （10%）， medium- （15%） and high- （20%） concentration Naotai Formula groups. CCK8 method was used to examine cell viability; LDH activity was detected by LDH quantification kit. Hoechst 33258 staining was used to observe the nuclear morphological changes and the apoptosis rate was checked by Tunel staining. The expressions of Beclin-1， LC3， GRP78， CHOP and PERK proteins was examined by immunofluorescence method and the Western blot. Results In the model group， the LDH activity of PC12 cells increased， the apoptosis rate increased and the cell survival rate decreased （P<0.01）， the expressions of GRP78， PERK， CHOP， LC3Ⅱ， and Beclin-1 were notably elevated， while LC3Ⅰ expression was lower （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， the LDH activity of PC12 cells in the inhibitor （4-PBA） group， the medium- and high- concentration groups of Naotai Formula decreased， the apoptosis rate was lower and the cell survival rate increased significantly （P<0.05， P<0.01）. The expressions of GRP78， PERK， CHOP， LC3Ⅱand Beclin-1 proteins were reduced significantly， while the expression of LC3Ⅰ protein increased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Naotai Formula medicated serum can effectively inhibit the apoptosis of PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation and regulate the GRP78/PERK/CHOP signaling pathway. It indicates that Naotai Formula may alleviate the excessive autophagy caused by endoplasmic reticulum stress of the injured nerve cells， and then inhibit the apoptosis of cells， so as to play a certain neuroprotective role.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Naotai Formula; cerebral ischemia-reperfusion injury; oxygen deprivation; glucose deprivation; reoxygenation; endoplasmic reticulum stress; autophagy

缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）是腦卒中最常見的類型，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率等特點(diǎn)[1]。目前，血管內(nèi)溶栓是治療IS的主要手段，但當(dāng)腦缺血責(zé)任血管再通后常繼發(fā)腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI），導(dǎo)致更加嚴(yán)重的腦功能障礙。CIRI發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress， ERS）、自噬、炎癥反應(yīng)等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CIRI發(fā)生時(shí)大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum， ER）中會(huì)進(jìn)一步蓄積，跨膜受體被激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response， UPR）的發(fā)生，從而減輕未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累[3]，然而當(dāng)UPR不能有效代償ERS時(shí)，會(huì)激活促凋亡相關(guān)通路，加速細(xì)胞的凋亡[4]。因此，抑制ERS或可成為防治CIRI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。腦泰方具有補(bǔ)氣活血、化瘀通絡(luò)的功效，對(duì)IS氣虛血瘀證患者具有良好的臨床效果[5]。本研究擬建立缺氧缺糖/復(fù)氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R）PC12細(xì)胞模型體外模擬CIRI，然后使用不同濃度腦泰方含藥血清進(jìn)行給藥培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞存活情況及GRP78、CHOP、PERK、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)，旨在基于ERS相關(guān)通路探討腦泰方對(duì)CIRI腦組織損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)雄性SD大鼠8只，體質(zhì)量180～200 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（湘）2021-0005。本研究由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，審查號(hào)：2021-0086。高分化PC12細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技公司（批號(hào)：CM0481）。

1.2? 主要試劑與儀器

4-苯基丁酸購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress公司（批號(hào)：HY-A0281）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司（批號(hào)分別為19106、8121279）；LDH試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技公司（批號(hào)：20211218）；CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物科技公司（批號(hào)：BA08198127）；Tunel凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司（批號(hào)：C1086）；兔抗大鼠Beclin-1抗體、兔抗大鼠LC3-B抗體、兔抗大鼠LC3-A抗體、兔抗大鼠GRP78抗體、兔抗大鼠CHOP抗體、兔抗大鼠PERK抗體均購(gòu)自美國(guó)Affinity公司（批號(hào)分別為AF-5128、AF-4650、AF-4007、AF-5366、DF-6025、AF-5304）；Hoechst 33258購(gòu)自北京索萊寶科技公司（批號(hào)：B8030）。

低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器公司，型號(hào)：7DZ5-WS）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkinelmer公司，型號(hào)：Enspire）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：HERACE）；細(xì)胞成像分析系統(tǒng)（廣州明美顯微儀器公司，型號(hào)：MSX2）；超高分辨激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司，型號(hào)：LSM880）。

1.3? 腦泰方含藥血清制備

腦泰方由黃芪50 g、川芎12.5 g、地龍18.75 g、僵蠶18.75 g組成。腦泰方濃縮顆粒購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，每100 g生藥相當(dāng)于濃縮顆粒劑8.44 g。溶解于60 ℃雙蒸水中，配成終濃度為0.281 g/mL的中藥溶液，4 ℃密封保存。8只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為含藥血清組、空白血清組，每組4只，按照人臨床用量的等效劑量和動(dòng)物體表面積[6]計(jì)算，含藥血清組以0.9 g/kg濃度的腦泰方濃縮顆粒灌胃，每天灌胃2次，持續(xù)5 d，空白血清組大鼠予以2 mL生理鹽水灌胃。末次灌胃結(jié)束1.5 h后，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h，以3000 r/min（半徑13.5 cm）離心10 min，將同組大鼠血清進(jìn)行混裝，水浴鍋56 ℃滅活30 min，然后過濾除菌，分裝，于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? OGD/R PC12細(xì)胞損傷模型制備與分組給藥

采用1%雙抗+10%胎牛血清+89% DMEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞，每2～3 d傳代一次，置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞2遍，0.25%胰蛋白酶消化后，終止，離心，重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按2000個(gè)/孔接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞密度為70%融合時(shí)進(jìn)行OGD/R模型建立[7]，其中缺氧缺糖4 h，復(fù)氧18 h，以鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化及細(xì)胞存活率（CCK8法）小于50%作為模型制備成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)。將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組、抑制劑組（2 mmol/L的4-PBA）、腦泰方低濃度組（10%含藥血清）、腦泰方中濃度組（15%含藥血清）、腦泰方高濃度組（20%含藥血清）6個(gè)組，各組在復(fù)氧的同時(shí)加入相應(yīng)濃度的藥物或等量培養(yǎng)基處理，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5? CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔2000個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，后續(xù)造模與給藥步驟同“1.4”。棄掉孔內(nèi)液體，然后加入完全培養(yǎng)基200 μL，同時(shí)每孔加入20 μL的CCK8溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，最后用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光密度（optical density， OD）值，并計(jì)算各組藥物的細(xì)胞存活率。

1.6? 細(xì)胞乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）活性檢測(cè)

按上述方法造模并分組給藥培養(yǎng)后，收集各組細(xì)胞上清液，以1500 r/min（半徑13.5 cm）離心15 min，嚴(yán)格參照試劑盒說明書，采用LDH試劑盒檢測(cè)各組LDH活性，主要步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書。

LDH活性（U/L）=（測(cè)定OD值-對(duì)照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)×1000。

1.7? Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度，按每孔2000個(gè)細(xì)胞接種于黑色96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，靜置培養(yǎng)24 h，后續(xù)造模與給藥步驟同“1.4”。棄掉孔內(nèi)液體，PBS洗2次，加入Hoechst 33258工作液，室溫避光孵育15 min，PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.8? Tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度，按每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于黑色24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，靜置培養(yǎng)24 h，后續(xù)造模與給藥步驟同“1.4”。棄掉孔內(nèi)液體，PBS洗2次，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min、0.25% Triton X-100處理10 min及3% H₂O₂作用2 min后，PBS洗3次；加入預(yù)先配制的Tunel反應(yīng)混合液（50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP），37 ℃濕盒避光孵育1 h，棄掉孔內(nèi)液體，PBS洗3次；加入DAPI工作液（1∶800），室溫避光孵育15 min，PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)的比值計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.9? 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、PERK蛋白表達(dá)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔2000個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，后續(xù)造模與給藥步驟同“1.4”。棄掉孔內(nèi)液體，PBS洗2次，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min、0.25% TritonX-100處理15 min及5% BSA封閉30 min后，PBS洗3次；加入兔抗大鼠Beclin-1、LC3-A、LC3-B、GRP78、CHOP或PERK一抗工作液（1∶100或1∶200），4 ℃避光孵育過夜，棄掉孔內(nèi)液體，PBS洗5次；加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液（1∶400），37 ℃避光孵育30 min，棄掉孔內(nèi)液體，PBS洗4次；加入DAPI工作液（1∶800），室溫避光孵育15 min，PBS洗3次，最后于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.10? Western blot檢測(cè)細(xì)胞Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、PERK蛋白表達(dá)

PC12細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔50 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，靜置培養(yǎng)24 h，后續(xù)造模及分組給藥同“1.4”。加入含1%蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30 min，以12 000 r/min（半徑13.5 cm）離心15 min，取上清，-80 ℃冰箱內(nèi)保存、備用。BCA法蛋白定量。適量蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，5%濃縮膠60 V，10%分離膠90 V；然后濕轉(zhuǎn)90 min，電流300 mA，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗（1∶1000），4 ℃搖床過夜。次日，TBST漂洗3次，二抗（1∶5000）室溫孵育60 min，TBST漂洗3次，添加ECL發(fā)光液暗室曝片。用ImageJv1.8.0軟件分析各條帶灰度值，統(tǒng)計(jì)各組與β-actin灰度值的比值。

1.11? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“ｘ±s”表示，組間數(shù)據(jù)比較采用ANOVA方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett's T3作組間多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組PC12細(xì)胞存活率及LDH活性

與正常組比較，模型組LDH活性明顯升高（P＜0.01），細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組、腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組LDH活性明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖1。

2.2? 各組PC12細(xì)胞核形態(tài)改變

模型組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，凋亡細(xì)胞核聚集，染色質(zhì)濃染，呈馬蹄形或月牙狀的典型凋亡特征；抑制劑組、腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組均能顯著抑制PC12細(xì)胞凋亡，染色質(zhì)濃染、細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減輕，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示其能有效抑制OGD/R造模損傷后的PC12細(xì)胞凋亡，并改善細(xì)胞凋亡狀態(tài)。詳見圖2。

2.3? 各組PC12細(xì)胞凋亡率比較

與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組、腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖3—4。

2.4? 各組PC12細(xì)胞Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、PERK蛋白表達(dá)情況

與正常組比較，模型組GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；抑制劑組GRP78、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；腦泰方低濃度組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），LC3Ⅰ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。詳見圖5—6。

2.5? 各組PC12細(xì)胞內(nèi)GRP78、PERK、CHOP、LC3、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)情況

與正常組比較，模型組GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組和腦泰方高濃度組GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；腦泰方中濃度組PERK、CHOP、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），LC3Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。詳見圖7—8。

3 討論

IS可歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”“仆擊”“偏枯”等疾病范疇。素體氣血虧虛，正氣漸衰，或情志飲食失調(diào)、長(zhǎng)期勞逸失度等導(dǎo)致機(jī)體陰陽失調(diào)，臟腑功能紊亂，氣血運(yùn)行失常，后由風(fēng)、火、痰、瘀、虛五端相互交作引觸，遂發(fā)中風(fēng)[8]。清代名醫(yī)王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中提出中風(fēng)之氣虛血瘀理論，認(rèn)為中風(fēng)是由于元?dú)馓澨搶?dǎo)致血液運(yùn)行不暢而為瘀，強(qiáng)調(diào)在治療中風(fēng)時(shí)須補(bǔ)氣藥與活血藥合用，并創(chuàng)益氣活血之代表方“補(bǔ)陽還五湯”，為后世醫(yī)家治療中風(fēng)提供了新的方向[9]。腦泰方正是根據(jù)中風(fēng)之氣虛血瘀理論創(chuàng)制，由黃芪、川芎、地龍、僵蠶4味藥組成，方中重用黃芪為君，取其補(bǔ)氣以行氣、補(bǔ)氣以養(yǎng)血活血之意；川芎“血中之氣藥”為臣，可活血行氣，祛內(nèi)外之邪風(fēng)；地龍性善走竄，長(zhǎng)于通絡(luò)，與黃芪、川芎之品合用，大大增強(qiáng)行氣活血通絡(luò)之功效；僵蠶長(zhǎng)于祛外風(fēng)、息內(nèi)風(fēng)，還可化痰散結(jié)，具有祛風(fēng)化痰通絡(luò)之功效。全方藥簡(jiǎn)而力宏，共奏補(bǔ)氣活血、化瘀通絡(luò)之功效。腦泰方是葛金文教授課題組研發(fā)的專利處方（專利號(hào)：ZL201110178359.4），臨床試驗(yàn)表明腦泰方對(duì)于腦卒中氣虛血瘀證患者具有良好的臨床效果，目前已成熟運(yùn)用于臨床[10]。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腦泰方可有效抑制CIRI大鼠病灶內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鐵死亡，減少鐵沉積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)；腦泰方含藥血清對(duì)血紅蛋白刺激的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞也表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)SOD酶、GPX4等抗氧化因子的活性，進(jìn)而提高神經(jīng)細(xì)胞抗氧化能力有關(guān)[11-14]。

ER是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重要的細(xì)胞器，主要參與蛋白質(zhì)的合成、加工與修飾，大多數(shù)膜脂的合成、細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)物質(zhì)Ga2+的儲(chǔ)存以及重要激素的合成等多種生理活動(dòng)與ER關(guān)系同樣密切[15]。當(dāng)CIRI引起腦組織損傷時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ER平衡狀態(tài)被打破，大量未折疊/錯(cuò)誤折疊的蛋白在ER囊腔內(nèi)蓄積，引發(fā)ERS，進(jìn)一步代償性激活UPR，減少蛋白質(zhì)的合成，清除未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白以緩解ERS狀態(tài)[16]，但是當(dāng)ERS時(shí)間及強(qiáng)度超過UPR承載范圍后，則會(huì)激活下游凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。GRP78是ERS發(fā)生的標(biāo)志性效應(yīng)蛋白，在正常生理狀態(tài)下，GRP78主要與ER的應(yīng)激下游受體PERK、ATF6和IRE1相結(jié)合，以保持它們處于失活狀態(tài)，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，GRP78則與之發(fā)生解離，導(dǎo)致GRP78含量增加。羅書萍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CIRI模型組大鼠腦內(nèi)缺血半暗帶區(qū)GRP78 mRMA表達(dá)明顯增加，并且隨著灌注時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，在12 h達(dá)到高峰，24 h后表達(dá)才開始減少。PERK是ER中重要的跨膜感受蛋白之一，在過度ERS狀態(tài)下，GRP78與PERK解離，PERK通過同源二聚化或自身磷酸化而自我激活，最終激活CHOP基因轉(zhuǎn)錄，從而進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。細(xì)胞自噬與凋亡關(guān)系非常密切且復(fù)雜，自噬可以增強(qiáng)或抑制凋亡的發(fā)生，這主要取決于刺激強(qiáng)度和時(shí)間，而凋亡相關(guān)信號(hào)通路的某些部分又可與自噬蛋白相互作用而影響自噬的發(fā)生[19]。Beclin-1蛋白是細(xì)胞自噬過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白，同時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡也起著至關(guān)重要的作用[20]。呂棟輝等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CIRI大鼠LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加，經(jīng)過藥物干預(yù)之后，其表達(dá)均明顯下降，其機(jī)制可能是通過干預(yù)CIRI的神經(jīng)細(xì)胞自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。LC3Ⅱ是檢測(cè)細(xì)胞自噬發(fā)生的標(biāo)志蛋白，LC3前體合成后，通過自噬相關(guān)蛋白4水解形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ繼續(xù)被其他自噬相關(guān)蛋白片段激活與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合形成LC3Ⅱ，最后被轉(zhuǎn)移結(jié)合至自噬體膜上，而LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高則說明細(xì)胞的自噬活性增強(qiáng)[22-23]。

本研究采用OGD/R PC12細(xì)胞是目前最理想的體外模擬CIRI損傷的模型[24-25]。此次研究結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞內(nèi)LDH活性增加，細(xì)胞凋亡率增加，存活率下降，GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)增加，LC3Ⅰ蛋白表達(dá)減少，提示經(jīng)過OGD/R損傷的PC12細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，其機(jī)制可能與ERS導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)，與前人研究結(jié)果一致[26]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腦泰方含藥血清可降低OGD/R損傷的PC12細(xì)胞內(nèi)LDH活性，降低細(xì)胞凋亡率，負(fù)向調(diào)控GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白的表達(dá)，且15%及20%濃度的腦泰方含藥血清效果可能更優(yōu)，表明腦泰方可有效緩解受損神經(jīng)細(xì)胞ERS導(dǎo)致的過度自噬狀態(tài)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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