中藥復(fù)方緩壓樂對(duì)應(yīng)激性高血壓大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1信號(hào)通路的影響

納菲沙·卡德爾, 阿依西布·薩吾提, 鐘 莉, 庫熱西·玉努斯

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 2藥學(xué)院, 烏魯木齊 830017; 3新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830054,4浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái), 杭州 310000; 5新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830017)

全球30～79歲的高血壓患者人數(shù)自1990年至2019年由6.48億增加到12.78億[1]。雖然近年來高血壓的治療已經(jīng)取得了進(jìn)展,但對(duì)高血壓患者血管并發(fā)癥的新療法開發(fā)仍然是至關(guān)重要的研究方向[2]。高血壓是遺傳和環(huán)境因素共同起作用的復(fù)雜性疾病。慢性應(yīng)激在高血壓發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3],但其具體病理生理學(xué)機(jī)制仍不清楚。大量研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)參與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、缺血性心臟病及心力衰竭等多種心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)的發(fā)生和發(fā)展,可作為治療多種CVD的重要靶點(diǎn)[4-6]。ERS信號(hào)通路的研究可能為開發(fā)高血壓新療法和預(yù)防其并發(fā)癥提供重要的依據(jù)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)激性高血壓(Stress induced hypertension,SIH)大鼠模型中ERS標(biāo)志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein,GRP78/BiP)的表達(dá)水平上調(diào)[7],初步證實(shí)SIH模型中ERS的存在。ERS的發(fā)生進(jìn)而激發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR),激活其下游信號(hào)分子[4]。IRE1/XBP1通路是UPR三個(gè)重要信號(hào)通路之一[8]。X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein-1,XBP1)作為核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其下游基因mRNA表達(dá)水平。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與高血壓發(fā)生密切關(guān)聯(lián),其相關(guān)基因血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme,ace)和ANGII受體1型(ANGII type 1 receptor,at1r)的啟動(dòng)子區(qū)均存在潛在的XBP1應(yīng)答元件[9]。

中藥復(fù)方緩壓樂(HYL)是由本科研團(tuán)隊(duì)根據(jù)民間降壓驗(yàn)方組合而研制的。用HYL進(jìn)行干預(yù)后,SIH大鼠收縮壓和舒張壓降低[10],但其具體機(jī)制不明,因此本研究在建立SIH大鼠模型的基礎(chǔ)上,用HYL進(jìn)行干預(yù),探討ERS信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,為高血壓中藥防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只鼠齡為6～8周的SPF級(jí)Wistar大鼠,體重160～220 g,購買及飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(新)2016-0003]。

1.1.2 主要試劑與儀器 受磷蛋白(phospholamban,PLB)總蛋白、p-PLB、p-肌醇需求因子1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)及XBP1抗體(abcam,英國),DAB顯色試劑盒(陸壹科技,北京),免疫組化試劑盒(博士德生物,武漢),BCA試劑盒(索萊寶,北京),BSA封閉液(博士德生物,武漢),ECL化學(xué)發(fā)光底物(Biosharp,中國),無創(chuàng)血壓儀BP-600A(泰盟有限公司,成都),倒置顯微鏡(萊卡公司,德國)。

1.1.3 藥物 中藥復(fù)方緩壓樂主要藥物成分有倒提壺、玫瑰花、小茴香等,藥材均購自新疆維吾爾醫(yī)院。依普利酮片是一種新型的具有選擇性阻斷醛固酮受體的阻斷劑,有良好的降血壓作用。

1.2 方法

1.2.1 SIH模型制備 36只Wistar大鼠中隨機(jī)取6只作為正常組(不建模),剩余30只隨機(jī)分為模型組,高、中、低劑量藥物干預(yù)組和陽性對(duì)照組,每組6只,參照文獻(xiàn)[11]造模12周,造模期間使用無創(chuàng)血壓儀測定各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(Systolic blood pressure,SBP)和舒張壓(Diastolic blood pressure,DBP),每只大鼠測3次血壓,取平均值。以模型組12周應(yīng)激刺激結(jié)束后測得的血壓與應(yīng)激刺激開始前的初始血壓進(jìn)行比較,收縮壓升高≥20 mmHg說明造模成功[12]。

1.2.2 動(dòng)物給藥方法 高、中、低劑量藥物干預(yù)組和陽性對(duì)照組在給予間斷足底電和噪聲復(fù)合刺激的同時(shí)予以相應(yīng)藥物干預(yù)12周。模型組大鼠每天灌胃蒸餾水(0.1 g/100 g體質(zhì)量,1次/d),HYL藥物干預(yù)高劑量組(0.1 g/100 g體質(zhì)量,1次/d)、中劑量組(0.05 g/100 g體質(zhì)量,1次/d)、低劑量組(0.025 g/100 g體質(zhì)量,1次/d)大鼠每天灌胃HYL。陽性對(duì)照組大鼠每天灌胃依普利酮溶液(0.005 g/100 g體質(zhì)量,1次/d)。

1.2.3 收集樣本 取大鼠胸主動(dòng)脈組織并分兩段,一段置于-80℃冰箱保存,備用于RT-qPCR及Western blot實(shí)驗(yàn)。另一段放入包埋盒中固定于4%多聚甲醛溶液中,石蠟包埋,用于免疫組織化學(xué)(IHC)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RT-qPCR技術(shù)檢測胸主動(dòng)脈組織ace和at1rmRNA表達(dá)水平 液氮研磨適量胸主動(dòng)脈組織,使用Trizol試劑提取總RNA,測定其濃度,使用PCR循環(huán)儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用RT-qPCR定量檢測ace和at1rmRNA表達(dá)量,用2-ΔΔCt分析法計(jì)算結(jié)果,引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5 IHC技術(shù)檢測胸主動(dòng)脈組織中XBP1的表達(dá) 將石蠟切片常規(guī)脫水,3%過氧化氫去除內(nèi)源性酶,檸檬酸鈉修復(fù)抗原,5%BSA封閉液封閉,滴加一抗4℃過夜,HRP-山羊抗兔IgG30 min 37℃孵育,DAB顯色(顯微鏡下控制顯色時(shí)間),蘇木素復(fù)染,脫水、透明、中性樹膠封片。熒光倒置顯微鏡下觀察拍照,每只大鼠選取6張切片,每張切片隨機(jī)選4個(gè)視野。采用Image Pro Plus6.0軟件定量分析,計(jì)算各組大鼠累積光密度值(IOD),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 Western blot技術(shù)檢測胸主動(dòng)脈組織PLB總蛋白、p-PLB、p-IRE1及XBP1的表達(dá)水平 液氮中研磨適量胸主動(dòng)脈組織,加入RIPA裂解液提取蛋白。在4℃條件下,12 000 r/min離心10 min,取上清液,使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。適宜條件下,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育,二抗孵育等步驟。ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影,Image J圖像分析法進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)量資料服從正態(tài)性時(shí),兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析;當(dāng)計(jì)量資料不服從正態(tài)性時(shí),組間比較采用秩和檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尾動(dòng)脈血壓的變化造模前,各組大鼠收縮壓和舒張壓無明顯差異(P>0.05);造模12周結(jié)束后,與正常組相比,模型組、HYL藥物干預(yù)中及低劑量組大鼠SBP和DBP升高(P<0.05),高劑量組與陽性對(duì)照組大鼠與正常組比較,SBP和DBP變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,高劑量組與陽性對(duì)照組大鼠SBP和DBP降低(P<0.05),見圖1。

2.2 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織ace、at1r基因mRNA表達(dá)水平的變化與正常組相比,模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織ace和at1r基因mRNA表達(dá)水平均上調(diào);與模型組相比,高、中、低劑量組和陽性對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈組織ace基因mRNA表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05),高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈組織at1r基因mRNA表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05),見圖2。

注:與正常組比較, *P<0.05;與模型組比較, ΔP<0.05。

注:與正常組比較, *P<0.05; 與模型組比較, ΔP<0.05。

2.3 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織XBP1蛋白表達(dá)水平變化IHC染色中XBP1蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色,見圖3。與正常組相比,模型組和低劑量組大鼠胸主動(dòng)脈組織血管平滑肌細(xì)胞中XBP1蛋白總表達(dá)量明顯增多(P<0.05);相對(duì)于模型組,高劑量組和陽性對(duì)照組中XBP1蛋白染色淡、陽性表達(dá)低,且總表達(dá)量明顯減少(P<0.05),中、低劑量組無明顯差異(P>0.05),見表2。

注: A, 正常組; B, 模型組; C, 高劑量組; D, 中劑量組; E, 低劑量組; F, 陽性對(duì)照組。

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織XBP1蛋白表達(dá)水平變化

2.4 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織總PLB、p-PLB、p-IRE1、XBP1表達(dá)水平相較于正常組,模型組、中及低劑量組總PLB、p-IRE1、XBP1表達(dá)量均明顯上調(diào)(P<0.05),p-PLB表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05);與模型組相比,高劑量組及陽性對(duì)照組中總PLB、p-IRE1、XBP1表達(dá)量均明顯下調(diào)(P<0.05),而p-PLB表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)。與正常組相比,模型組、中及低劑量組p-PLB/總PLB顯著下降(P<0.01);與模型組相比,高劑量組及陽性對(duì)照組p-PLB/總PLB顯著增加(P<0.01),見圖4。

注: 與正常組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與模型組比較, ΔP<0.05, ΔΔP<0.01。

3 討論

長期處于模擬的應(yīng)激刺激環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)呼吸、心跳加快、血壓升高等“預(yù)警反應(yīng)”,導(dǎo)致神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)紊亂,內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡,最終引發(fā)SIH的發(fā)生[13]。本研究發(fā)現(xiàn),慢性電擊和噪聲刺激會(huì)引起大鼠SBP和DBP明顯上升,造模成功。用HYL干預(yù)后血壓明顯下降,以高劑量組尤為顯著。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是極其敏感的細(xì)胞器,參與胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊和分泌、跨膜蛋白易位、鈣穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)生物合成等多種重要的細(xì)胞功能。非磷酸化的PLB抑制肌漿網(wǎng)鈣ATP酶(Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)的活性,減弱肌漿網(wǎng)鈣回收作用[14]。[Ca2+]ER持續(xù)性降低是引起ERS的誘因之一。各種生理或病理刺激導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累,引起ERS[15]。本研究結(jié)果顯示,PLB總蛋白的表達(dá)上調(diào)且PLB磷酸化水平下調(diào),提示PLB非磷酸化水平升高,即對(duì)SERCA活性起抑制作用,是SIH大鼠血管組織發(fā)生ERS的可能原因。HYL通過反向調(diào)節(jié)PLB總蛋白表達(dá)量及PLB磷酸化水平、增加SERCA活性,進(jìn)而緩解ERS的發(fā)生。

ERS的發(fā)生進(jìn)而激發(fā)UPR,激活其下游信號(hào)分子[4]。IRE1作為UPR目前已發(fā)現(xiàn)的三個(gè)分支之一,從酵母到哺乳動(dòng)物都是最保守的,具有絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶和核糖核酸內(nèi)切酶功能[4]。在應(yīng)激狀態(tài)下,IRE1從GRP78解離,使自身磷酸化,觸發(fā)核糖核酸內(nèi)切酶功能,引發(fā)XBP1 mRNA的非常規(guī)胞質(zhì)剪接。未剪接的XBP1(XBP1u)不包含轉(zhuǎn)錄激活域,經(jīng)由IRE1剪去26個(gè)核苷酸后移碼導(dǎo)致有效的轉(zhuǎn)錄因子——XBP1的生成[16]。XBP1被移位至細(xì)胞核中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,上調(diào)與蛋白質(zhì)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(ER-associated degradation,ERAD)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生成有關(guān)的基因表達(dá)[4,17]。Choi等[18]的研究發(fā)現(xiàn),在自發(fā)性高血壓大鼠中,IRE1、XBP1表達(dá)上調(diào),并用ERS抑制劑?；切苋パ跄懰?Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)后其表達(dá)下調(diào),且降低大鼠動(dòng)脈收縮壓。本研究發(fā)現(xiàn),XBP1在SIH模型組大鼠胸主動(dòng)脈組織平滑肌細(xì)胞中高表達(dá),而在HYL高劑量組中低表達(dá)。在SIH模型組中IRE1磷酸化水平及XBP1蛋白表達(dá)水平上調(diào),而在HYL高劑量組中下調(diào),提示在SIH模型中IRE1/XBP1信號(hào)通路處于活化狀態(tài),高劑量HYL抑制此信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[9],在ace及at1r基因啟動(dòng)子區(qū)均存在潛在的XBP1應(yīng)答元件。IRE1/XBP1通路激活與ACE/ANGII/AT1R軸各成份在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上上調(diào)表達(dá)有關(guān)。高劑量的中藥復(fù)方緩壓樂可以通過抑制該通路,降低腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)相關(guān)基因ace和at1r的mRNA表達(dá)水平,進(jìn)而起到降低血壓的作用。

綜上所述,中藥復(fù)方緩壓樂通過調(diào)節(jié)由慢性應(yīng)激因素引起的SIH大鼠血管組織PLB的活性、且抑制IRE1/XBP1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平,降低血管組織ERS,從而發(fā)揮防治高血壓的作用,但是鑒于高血壓病理生理過程及其中藥復(fù)方干預(yù)機(jī)制的復(fù)雜性,有待進(jìn)一步深入研究。