健脾化濕通絡(luò)方對(duì)佐劑型關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞凋亡和炎癥影響的研究

劉劍橋，張明媚，劉曉闖，霍星星，姜娟娟，李傳潤(rùn)*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230013）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其主要病理特征是滑膜內(nèi)膜增生，大量成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like Synoviocytes,FLSs）活化?；罨蟮腇LSs 表現(xiàn)出過(guò)度增殖以及凋亡減少的腫瘤樣行為，通過(guò)與T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及多種細(xì)胞因子相互作用，分泌大量炎癥細(xì)胞因子和分解代謝酶，形成持續(xù)的關(guān)節(jié)炎癥[1]。在FLSs增生的慢性破壞下，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情逐步加重[2-3]，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞，功能喪失[4]。因此，了解FLSs作為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理因素的分子機(jī)制對(duì)于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及相關(guān)疾病非常重要。佐劑型關(guān)節(jié)炎模型因其與人類(lèi)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程類(lèi)似，同樣存在被激活的FLSs，并且制備方便、成模率高，被廣泛用作類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究的動(dòng)物模型。

健脾化濕通絡(luò)方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院劉健教授在臨床實(shí)踐中，基于新安醫(yī)學(xué)“脾虛致痹”“健脾化濕”理念創(chuàng)制的中藥復(fù)方，由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣組成。前期臨床研究表明，健脾化濕通絡(luò)方可抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮治療作用[5]。本研究首先建立佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，通過(guò)分離培養(yǎng)佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠FLSs，觀察健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 過(guò)度增殖的抑制作用和炎癥水平影響，探究健脾化濕通絡(luò)方治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7 ～ 8 周齡SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量為（250±10）g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003]。標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室溫為 22 ～24℃，濕度為50%～60%。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)論證批準(zhǔn)（許可證號(hào)：AHUCM-Rats-2021005）。

1.2 藥品與試劑

健脾化濕通絡(luò)方（組方：黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣；飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)水煎后濃縮為含生藥量為1.0 g/mL 的藥液，冷藏保存）。CCK-8 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：CR2112050）、DMEM 高 糖 培 養(yǎng) 基（批 號(hào)：GP21050050710）、D-Hank’s（批 號(hào)：GP2006080873）、PBS（批 號(hào)：GP20060701001），均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；ELISA 定量檢測(cè)試劑盒IL-1β（批號(hào)：RX302869R）、IL-10（批號(hào)：RX302880R）、IL-4（批號(hào)：RX302858R），均購(gòu)自泉州市睿信生物科技有限公司；胰酶（批號(hào)：C0201）、DAPI（批號(hào)：C1002）、Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG（H + L）（批號(hào)：A0516），均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；凋亡試劑盒（批號(hào)：BB20081，上海貝博生物科技有限公司）；弗氏完全佐劑（批號(hào)：C13083712，上海麥克林生化公司）。

1.3 主要儀器

CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；CKX53 型倒置顯微鏡[奧林巴斯（中國(guó)）公司]；3111 型細(xì)胞培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；RT6100 型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；JW-10 型離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；LIOO XC20 型成像系統(tǒng)[奧林巴斯（中國(guó)）公司]。

2 方法

2.1 模型組大鼠模型建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常組和模型組，每組10 只。第0 天，模型組大鼠右后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL 弗氏完全佐劑，正常組大鼠注入液體石蠟。第8 天起每3 天測(cè)量左后足趾腫脹度（mL）。第20 天3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔麻醉大鼠，分離膝關(guān)節(jié)，多聚甲醛固定。于超凈臺(tái)中分離大鼠滑膜組織，分離培養(yǎng)原代FLSs。

2.2 膝關(guān)節(jié)組織HE 染色觀察

將經(jīng)過(guò)多聚甲醛固定的膝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行脫鈣；乙醇脫水，二甲苯透化；石蠟包埋切片，66℃ 烤片20 ～30 min；依次二甲苯、乙醇脫蠟；蘇木素浸染2 ～ 5 min，1%鹽酸酒精分化后伊紅染液浸染；依次過(guò)苯酚-二甲苯、二甲苯I、II 透明；中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察結(jié)果。

2.3 含藥血清制備

健脾化濕通絡(luò)方經(jīng)體表面積比值折算以相當(dāng)于人臨床等效用量0.324 mg/g 為基礎(chǔ)給藥劑量，大鼠以10倍劑量灌胃3.24 mg/g，每日2 次，連續(xù)給藥3 d，末次給藥1 h 后，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min 離心10 min分離血清，56 ℃水浴30 min 滅活，無(wú)菌操作分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 原代FLSs 培養(yǎng)與鑒定

分離模型組大鼠膝關(guān)節(jié)中滑膜組織；4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌D-Hank’s 液沖洗；2 倍體積Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化2 h；將組織塊均勻置于培養(yǎng)瓶，加入1 ～ 2 mL 20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基；免疫熒光法鑒定FLSs 特定波形蛋白（Vimentin）：破膜，血清室溫封閉20 min，200 μL一抗（1∶200）4 ℃ 過(guò)夜孵育；二抗（1∶500）37 ℃避光孵育30 min。200 μL DAPI 染液，室溫避光孵育5 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄R檢拍照。FLSs 在含20%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)。

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

正常組：由正常組大鼠滑膜分離培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞；模型組：模型組大鼠滑膜中分離培養(yǎng)的FLSs；給藥組：模型組細(xì)胞經(jīng)10%含藥血清干預(yù)。

2.6 CCK-8 法評(píng)價(jià)健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLS增殖能力影響

FLSs 以1×105個(gè)/mL 接種于96 孔板，5% CO2、37 ℃孵育過(guò)夜，選用前期實(shí)驗(yàn)確定的最佳含藥血清濃度（10%含藥血清）分別干預(yù) 0、24、48、72 h 后終止培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK-8，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm 處測(cè)量各孔的吸光值（A）。細(xì)胞增殖率 =（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 凋亡影響

胰酶消化貼壁FLSs，收集0.5 ～ 1×106個(gè)細(xì)胞，1 500 r/min 離心3 min，棄上清。PBS 清洗2 次，按凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用FlowJo VX 軟件對(duì)流式細(xì)胞凋亡的圖像進(jìn)行分析，凋亡細(xì)胞數(shù) = Q2 + Q3。

2.8 炎癥因子水平檢測(cè)

采用ELISA 方法，取FLSs 培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)IL -1β、IL-4、IL-10 水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立

從造模第8 天模型組大鼠足趾腫脹度明顯高于正常組（P＜ 0.01），并且在造模期間始終維持高腫脹度，見(jiàn)圖1。

圖1 模型足趾腫脹度（±s，n = 10）Fig.1 Swelling degree of toe in model（±s，n = 10）

光鏡觀察大鼠膝關(guān)節(jié)HE 切片，正常組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見(jiàn)滑膜組織為2 ～ 3 層滑膜細(xì)胞組成，光潔平整，無(wú)增生和血管翳；模型組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見(jiàn)滑膜細(xì)胞過(guò)度增生，滑膜組織乳頭狀突起，褶皺，血管翳明顯增多，見(jiàn)圖2。綜上表明佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型成功建立，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 HE 病理（×200）Fig.2 Pathological of HE（×200）

3.2 FLSs 分離培養(yǎng)及鑒定

原代滑膜細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后，滑膜組織基本消失，大量滑膜細(xì)胞游離，呈卵圓形、梭形。經(jīng)過(guò)三次傳代，通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)波形蛋白（Vimentin）鑒定FLSs，波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，呈梭形，細(xì)胞核清晰，呈橢圓形，位于細(xì)胞中央。波形蛋白的存在表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為FLSs，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖3。

圖3 FLSs 鑒定（×400）Fig.3 Identification of FLSs（×400）

3.3 健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 增殖影響

與正常組相比，模型組12、24、48、72 h 細(xì)胞增殖率均明顯上升（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組細(xì)胞增殖率明顯下降（P＜0.05），給藥時(shí)間的延長(zhǎng)增強(qiáng)了含藥血清對(duì)FLSs 的抑制增殖作用，在10%含藥血清干預(yù)72 h時(shí)FLSs的增殖率最低，見(jiàn)圖4。

圖4 健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 增殖影響（±s，n = 3）Fig.4 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on the proliferation of FLSs cells（±s，n = 3）

3.4 健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6，模型組與正常組相比，模型組凋亡細(xì)胞明顯減少（P＜0.01）；給藥組和模型組比較，給藥組凋亡細(xì)胞明顯增加（P＜0.01）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 凋亡的影響（±s，n = 3）Fig.5 Effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on apoptosis of FLSs by flow cytometry（±s，n = 3）

圖6 健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 凋亡的影響（±s，n = 3）Fig.6 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum medicated serum on the apoptosis of FLSs（±s，n = 3）

3.5 健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 中IL-1β、IL-10 、IL-4 表達(dá)的影響

ELISA 結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，模型組IL-1β、IL-4 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），IL-10 的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）；健脾化濕通絡(luò)方含藥血清干預(yù)后，給藥組與模型組相比，IL-1β、IL-4 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），IL-10 表達(dá)水平明顯上升（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖7 健脾化濕通絡(luò)方含藥血清對(duì)FLSs 細(xì)胞因子表達(dá)的影響（±s，n = 3）Fig.7 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on the expression of FLS cytokines（±s，n = 3）

4 討論

FLSs 在慢性炎癥環(huán)境下激活導(dǎo)致滑膜組織增生與滑膜炎癥，是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎重要的病理特征。本研究在佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠中發(fā)現(xiàn)FLSs 激活，表現(xiàn)出過(guò)度增殖、凋亡減少，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子異常表達(dá)，HE 觀察到大鼠軟骨表面粗糙破壞，滑膜血管翳明顯增多，滑膜組織乳頭狀增生，這與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理特征一致。

IL-1β、IL-4 和 IL-10 等細(xì)胞因子的異常表達(dá)，形成了FLSs 激活需要的慢性炎癥環(huán)境。這些細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答過(guò)程中由免疫細(xì)胞分泌，在促進(jìn)炎癥、抑制炎癥和細(xì)胞生長(zhǎng)等方面起到重要作用。IL-1β是重要的促炎因子，由類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜液中巨噬細(xì)胞分泌，在滑膜液中高表達(dá)[6]，本研究在模型組中檢測(cè)到IL-1β 的明顯高表達(dá)，給藥組干預(yù)后表達(dá)明顯降低。IL-4 和IL-10 具有抑炎作用，可抑制T 細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-17 以及多種趨化因子，在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中起到抑制炎癥作用[7-9]，本研究中模型組中IL-4 表達(dá)升高，可能與疾病活動(dòng)時(shí)IL-4 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，含藥血清干預(yù)后IL-4 表達(dá)降低與治療后炎癥水平下降趨勢(shì)一致；健脾化濕通絡(luò)方含藥血清可以顯著提高模型組IL-10 表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。綜上所述，降低IL-1β 表達(dá)，增強(qiáng)IL-10 表達(dá)是健脾化濕通絡(luò)方治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。

臨床研究顯示，健脾化濕通絡(luò)方通過(guò)改善類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛和炎癥反應(yīng)，明顯提高類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的生活質(zhì)量[10]；健脾化濕通絡(luò)方通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路影響促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡[11-12]。健脾化濕通絡(luò)方的有效成分研究中，臣藥雷公藤中Macroregelines 成分對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人滑膜細(xì)胞有明顯的抗增殖作用；蜈蚣中的多肽可以通過(guò)調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞減輕炎癥和關(guān)節(jié)損傷[13-14]。這些研究共同證明了健脾化濕通絡(luò)方通過(guò)抑制FLSs發(fā)揮抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用。

5 結(jié)論

本研究從FLSs 的過(guò)度增殖這一類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要病理表現(xiàn)角度探討了健脾化濕通絡(luò)方在動(dòng)物模型中作用的可能機(jī)制。通過(guò)檢測(cè)FLSs 在健脾化濕通絡(luò)方干預(yù)后凋亡水平和炎癥因子水平變化，確定抑制FLSs 的過(guò)度增殖，降低炎癥因子表達(dá)是健脾化濕通絡(luò)方治療佐劑型關(guān)節(jié)炎的一種可能機(jī)制。但作為體外實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的局限性，有待于通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。