酸棗仁皂苷A 和B 對(duì)小鼠睡眠情況干預(yù)的機(jī)制研究

姜 海 ，陳 健，王 祎，王 葳，續(xù)潔琨

［1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；4.長(zhǎng)春維石檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，吉林 長(zhǎng)春130102；5.吉林省農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)促進(jìn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130022; 6.中泰宜佳健康科技（北京）有限責(zé)任公司，北京101300］

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubeMill 的干燥成熟種子，自古被用作為安神養(yǎng)心類藥物[1]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)則證明了其具有顯著的催眠鎮(zhèn)定作用[2]。酸棗仁皂苷屬于四環(huán)三萜和五環(huán)三萜類皂苷化合物，目前已從酸棗仁中分離出超過50 種，其中以酸棗仁皂苷A 和B 為代表，具有顯著的藥理學(xué)功效，包括神經(jīng)保護(hù)、血管再生和催眠鎮(zhèn)靜作用等[4-5]。

相關(guān)研究表明，酸棗仁皂苷A 的功效要略高于酸棗仁皂苷B[6]，且對(duì)于酸棗仁皂苷A 輔助睡眠的研究也稍多[7]。酸棗仁皂苷A 和酸棗仁皂苷B 的攝入主要是改變腦中神經(jīng)遞質(zhì)GABA、5-HT 等的含量從而最終提高睡眠質(zhì)量，且兩者在腸道中依靠相關(guān)微生物代謝存在相互轉(zhuǎn)化機(jī)制[8]。但也有研究表明，皂苷類物質(zhì)除對(duì)機(jī)體中神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)代謝存在干預(yù)作用外，某些成分或次生代謝產(chǎn)物可能會(huì)影響血腦屏障甚至直接對(duì)腦組織產(chǎn)生一定的影響[9]。而酸棗仁皂苷對(duì)腦組織的影響尚未見研究。本研究旨在借助蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)等方法，通過對(duì)受試動(dòng)物下丘腦組織在蛋白水平的變化情況及兩者的差異研究，為酸棗仁皂苷A 和酸棗仁皂苷B 對(duì)機(jī)體睡眠情況干預(yù)的潛在機(jī)制解析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 受試動(dòng)物及場(chǎng)地

SPF 級(jí)雄性昆明小鼠，8 ～ 12 周齡，體質(zhì)量為22 ～28 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；SPF 潔凈級(jí)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為觀測(cè)曠場(chǎng)、動(dòng)物行為監(jiān)測(cè)錄制設(shè)備由長(zhǎng)春維石檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

1.2 藥物與試劑

酸棗仁皂苷A（CAS：55466-04-1）、酸棗仁皂苷B（CAS：55466-05-2）購(gòu)自成都格利普生物科技有限公司；地西泮（國(guó)藥準(zhǔn)字H21022887，東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司）。TMT? Mass Tagging Kits and Reagents 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific；Bradford 蛋白定量試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二硫蘇糖醇（DTT，D9163-25G）、三乙基碳酸氫銨緩沖液（TEAB，T7408-500ML）、氨水（221228-500ML-A）、三氟乙酸（TFA，T6508-100ML）及碘代乙酰胺（IAM，I6125-25G）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich；LC-MS 級(jí)超純水、乙腈（A955-4）和 甲 酸（A117-50）購(gòu) 自 美 國(guó)Thermo Fisher Chemical；丙酮（11241203810051）購(gòu)自北京化工廠；ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒（1633007）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；十二烷基硫酸鈉（SDS）和尿素購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 儀器與設(shè)備

EASY-nLCTM 1200 納升級(jí)UHPLC（LC140）、Q ExactiveTM HF-X 型質(zhì)譜儀、Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；D3024R 型低溫離心機(jī)（美國(guó)Scilogex）；Scan Speed 40 型冷凍干燥機(jī)（丹麥Labogene）。

2 方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

受試動(dòng)物分為A 組（酸棗仁皂苷A）、B 組（酸棗仁皂苷B）、陽(yáng)性對(duì)照組（地西泮干預(yù)）、空白對(duì)照組（生理鹽水）；設(shè)置給藥量低劑量組：10 mg/（kg·d），中劑量組：20 mg/（kg·d），高劑量組：30 mg/（kg·d）；地西泮攝入量：6 mg/（kg·d）；受試動(dòng)物均按照給藥體積200 μL/d 給藥；給藥時(shí)間為下午4 時(shí)。所有動(dòng)物在適應(yīng)環(huán)境5 d 后進(jìn)行連續(xù)21 d 給藥，隨后脫頸處死，在無菌環(huán)境下進(jìn)行開顱，取下丘腦組織液氮速凍后于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 睡眠穩(wěn)定性判定

單只受試動(dòng)物若連續(xù)10 min 未出現(xiàn)行動(dòng)跡象視為入睡；每組受試動(dòng)物睡眠穩(wěn)定性按照1 h 內(nèi)進(jìn)入睡眠狀態(tài)的數(shù)量進(jìn)行判定，即1 h 內(nèi)睡眠多并且在一段時(shí)間內(nèi)沒有出現(xiàn)蘇醒即睡眠穩(wěn)定，反之則不穩(wěn)定。

2.3 TMT 定量蛋白組學(xué)

選取空白對(duì)照組、A 組和B 組的高劑量組下丘腦組織進(jìn)行TMT 定量蛋白組學(xué)試驗(yàn)。

2.3.1 總蛋白提取 在嚴(yán)格低溫條件下使用PASP蛋白裂解液對(duì)下丘腦蛋白進(jìn)行提取，保存?zhèn)溆肹10]。

2.3.2 SDS-PAGE 凝膠電泳 使用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)“2.3.1”中提取液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，使用上樣量20 μg 進(jìn)行12% SDS-PAGE 凝膠電泳，濃縮膠電泳條件為80 V、20 min，分離膠電泳條件為120 V、90 min。電泳完成后使用R-250 染色后進(jìn)行洗脫。

2.3.3 TMT 標(biāo)記 根據(jù)ZHANG H 等[11]方法對(duì)蛋白進(jìn)行TMT 標(biāo)記，除鹽后凍干備用。

2.3.4 餾分分離 按照GAO J 等[12]的條件使用液相色譜法進(jìn)行餾分分離。過程中每分鐘收集1 管，合并10 個(gè)餾分，凍干后各加入0.1%甲酸溶解，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.5 液質(zhì)檢測(cè) 將“2.3.4”中各餾分上清液取1 μg 上機(jī)按GAO J 等[12]的條件進(jìn)行液質(zhì)分析，生成質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)（.raw）用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.4 數(shù)據(jù)分析

2.4.1 蛋白質(zhì)的鑒定和定量 根據(jù)Mus_musculus_uniprot_2021_7_15.fasta.fasta (86544 sequences) 蛋 白數(shù)據(jù)庫(kù)使用Proteome Discoverer 2.4 軟件搜索結(jié)果譜圖。所得結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，將定量差異顯著的蛋白質(zhì)（P＜ 0.05, |log2FC|＞0.25（FC＞1.2 orFC＜0.83[fold change,FC]）定義為差異表達(dá)蛋白（DE 蛋白）。

2.4.2 DE 蛋白功能分析 使用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能蛋白家族及通路分析[13]；針對(duì)DE 蛋白進(jìn)行聚類熱圖分析和KEGG 的通路富集分析[14]，并使用STRING DB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://STRING.embl.de/）預(yù)測(cè)可能的蛋白質(zhì)間相互作用[15]。

3 結(jié)果

3.1 受試動(dòng)物睡眠情況

受試動(dòng)物的睡眠情況見圖1。相較于對(duì)照組，各給藥組的睡眠情況均隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而穩(wěn)定。其中，陽(yáng)性對(duì)照組從第11 天開始全部在1 h 之內(nèi)入睡；A 組睡眠效果弱于陽(yáng)性對(duì)照組，但是高劑量組效果顯著優(yōu)于中、低劑量組，在第5 天時(shí)基本可以達(dá)到1 h之內(nèi)入睡；酸棗仁皂苷B 的效果略優(yōu)于酸棗仁皂苷A，低、中、高劑量組分別在第13、7、5 天達(dá)到1 h之內(nèi)入睡。過程中某一只受試動(dòng)物未入睡可能歸因于外界干擾。故酸棗仁皂苷A 和B 均產(chǎn)生了輔助睡眠作用，且存在一定的劑量依賴性。

圖1 受試動(dòng)物1 h 未入睡數(shù)量Fig.1 The number of test animals not falling asleep in 1 h

3.2 受試動(dòng)物下丘腦蛋白表達(dá)差異

3.2.1 蛋白差異分析 蛋白組學(xué)分析中共鑒定到6 740 個(gè)符合質(zhì)控要求的蛋白用于差異分析。各組中DE 蛋白的聚類熱圖分析結(jié)果如圖2 所示。與對(duì)照組相比，A 組（圖2A）下丘腦蛋白顯著上調(diào)39 種，顯著下調(diào)54 種；B 組（圖2B）顯著上調(diào)20 種，顯著下調(diào)131 種。所有DE 蛋白名稱及描述見熱圖右側(cè)圖注。

圖2 給藥組和對(duì)照組間差異蛋白聚類熱圖Fig.2 DE proteins heat map between test groups and control group

3.2.2 KEGG富集分析 DE蛋白的KEGG富集分析結(jié)果見圖3，將各組之間存在顯著性差異 （P＜0.05）的通路總結(jié)見表1。與空白對(duì)照組相比，除與腦組織蛋白表達(dá)不存在必然聯(lián)系的通路外，攝入酸棗仁皂苷A 還是酸棗仁皂苷B 引起了細(xì)胞緊密連接（Tight junction，ID：04530）中DE 蛋白的顯著差異，包括腫瘤抑制蛋白DLG1（ID：Q3UP61）、絲狀肌動(dòng)蛋 白AFADIN（ID：E9PYX7）、Rab8A 蛋 白（ID：Q0PD50）、多重PDZ 結(jié)構(gòu)域蛋白（ID：Q8VBX6）、非經(jīng)典蛋白激酶C iota（ID：Q62074）、微管鏈樣蛋 白TUBAL3（ID：Q3UX10）、Claudin-11（ID：Q60771）、絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白磷酸酶2A（ID：Q8BG02）、類InaD 蛋白（ID：A0A571BEG7）。同時(shí)，上述DE 蛋白的差異化表達(dá)，可能是造成酸棗仁皂苷A 和B 藥效差異的原因之一。

圖3 給藥組和對(duì)照組間KEGG 富集氣泡圖Fig.3 KEGG enrich results between test groups and control group

表1 KEGG 通路富集結(jié)果（P ＜ 0.05）Tab.1 KEGG pathways enrich results（P ＜ 0.05）

3.2.3 細(xì)胞緊密連接DE 蛋白互作分析 細(xì)胞緊密連接過程見圖4，其中標(biāo)注了已發(fā)現(xiàn)的DE 蛋白，較對(duì)照組均表達(dá)下調(diào)。酸棗仁皂苷A 的攝入引起了aPKC（ID：Q62074）、MUPP1（ID：Q8VBX6）、DLG1（ID：Q3UP61）、Rab8（ID：Q0PD50）及Afadin（ID：E9PYX7）的下調(diào)，這些蛋白和細(xì)胞極性與增殖、粘附連接的建立及細(xì)胞遷移等過程有關(guān)。酸棗仁皂苷B 的攝入引起了Claudin（ID：Q60771）、PP2A（ID：Q8BG02）、aPKC（ID：Q62074）、PATJ（ID：A0A571BEG7）、MUPP1（ID：Q8VBX6）、DLG1（ID：Q3UP61）、Claudin2（ID：Q60771）及Tuba（ID：Q3U-X10）的下調(diào)，這些蛋白同樣影響著細(xì)胞極性與增殖、緊密連接的建立等過程。

圖4 細(xì)胞緊密連接中的差異蛋白Fig.4 The DE proteins in tight junction process

4 討論

研究表明部分DE 蛋白與機(jī)體的睡眠或腦健康存在密切關(guān)系。楊芙蓉[16]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞中的Rab8蛋白差異表達(dá)可以干預(yù)GLUT4 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝，從而影響睡眠。劉勝杰[17]發(fā)現(xiàn)，腦組織中Afadin 的敲減將阻斷Rap1 活化，起到對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用并升高血腦屏障通透性，而Claudin 緊密連接蛋白家族在組成緊密連接的血腦物理屏障和維持細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定性方面具有重要作用[18]，PP2A 差異化表達(dá)可以抑制Tau 蛋白過磷酸化從而改善機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力[19]。其他DE 蛋白雖未見報(bào)道與機(jī)體睡眠存在直接關(guān)系，但大多與神經(jīng)調(diào)節(jié)存在密切關(guān)系，如DLG1 和Tuba 等[20-21]，所以推測(cè)酸棗仁皂苷A 和B 的攝入，一方面可以直接對(duì)下丘腦中緊密連接過程進(jìn)行調(diào)控，從而干預(yù)血腦屏障；另一方面，其攝入也對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到調(diào)節(jié)作用。

很多中藥成分被報(bào)道可以起到調(diào)節(jié)機(jī)體血腦屏障通透性的作用，如：益母草堿、冰片、丹參多酚酸等[22-24]，且冰片、川芎中活性成分可透過血腦屏障[25]。睡眠情況與血腦屏障通透性和緊密連接蛋白的表達(dá)也存在著密切關(guān)系[26]，很多藥物也被證明通過干預(yù)機(jī)體血腦屏障產(chǎn)生輔助睡眠作用，包括與本研究中類似的酸棗仁湯以及冰片等[27-28]。其中，王育虎[28]發(fā)現(xiàn)，酸棗仁湯的攝入增加了血液及腦組織一氧化氮合酶含量，推測(cè)其可能通過舒張毛細(xì)血管、增大血腦屏障通透性從而產(chǎn)生藥效。此外，郭艷麗等[29]的研究推測(cè)酸棗仁可能通過影響體內(nèi)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性而發(fā)揮抗焦慮作用。

中藥成分影響血腦屏障的途徑有很多，如：脂溶性小分子穿透血腦屏障、抑制P-糖蛋白對(duì)血腦屏障的限制、5-羥色胺對(duì)血腦屏障通透性的增強(qiáng)、一氧化氮對(duì)胞飲作用的增加等[30]。酸棗仁皂苷具有一定脂溶性，有可能透過血腦屏障進(jìn)入腦組織。但是本研究結(jié)果表明，酸棗仁皂苷A 和B 的攝入既引起細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白的差異化表達(dá)，也對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活性產(chǎn)生了干預(yù)作用，其他研究表明其攝入對(duì)某些神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生影響[31]，推測(cè)其也可能通過改變血腦屏障通透性從而使其他物質(zhì)進(jìn)入腦組織這一間接方式產(chǎn)生藥效。

5 結(jié)論

本研究證明了酸棗仁皂苷A 和B 的攝入均會(huì)對(duì)下丘腦中蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響，相關(guān)DE 蛋白集中于細(xì)胞緊密連接過程中，反映出藥物攝入后可能對(duì)血腦屏障及其通透性產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生輔助睡眠的作用，兩者攝入后DE 蛋白的差異可能是藥效差異的原因。此外，本研究還為酸棗仁皂苷的現(xiàn)代藥理學(xué)評(píng)價(jià)體系建立提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為該藥物后續(xù)藥效評(píng)價(jià)及機(jī)理探究提供了一定的理論基礎(chǔ)。兩種皂苷同時(shí)攝入是否會(huì)產(chǎn)生協(xié)同增效有待進(jìn)一步研究。