真海鞘根索和被囊乙醇提取物抑癌活性成分的分離及其作用機(jī)制研究?

韓善浩, 李建輝, 祝玉婷, 高宏偉, 董 波,3??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2. 青島海關(guān)檢測(cè)技術(shù)中心, 山東 青島 266114; 3. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所, 山東 青島 266003)

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在中國(guó),癌癥發(fā)病率和死亡率一直在上升[1]。死亡率最高的癌癥為肺癌,其次是肝癌和胃癌[2]。腫瘤的治療方法主要有手術(shù)療法、放射療法以及化學(xué)藥物療法。其中化學(xué)藥物療法的成效已初步顯現(xiàn),腫瘤患者的生存時(shí)間明顯增長(zhǎng)。但對(duì)于一些死亡率較高的癌癥,化學(xué)藥物仍具有毒副作用大、治療效率低、腫瘤細(xì)胞易耐藥等問題。因此,尋求高效、毒性小、特異性強(qiáng)的抗腫瘤化學(xué)藥物成為解決癌癥疾病的當(dāng)務(wù)之急[3]。

海鞘作為被囊動(dòng)物,在生物進(jìn)化史上處于無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的進(jìn)化節(jié)點(diǎn)[4]。由于其多樣性和廣泛的適應(yīng)性,決定了海鞘次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)新穎性和功能多樣性[5]。第一個(gè)在海鞘中發(fā)現(xiàn)的具有活性的化合物為香葉醇對(duì)苯二酚,具有抗白血病的細(xì)胞毒性[6]。此后,越來(lái)越多海鞘來(lái)源的天然活性化合物被報(bào)道,包括生物堿、多肽、聚酮、醌類以及甾體等物質(zhì),表明海鞘具有極大的藥用挖掘價(jià)值[7],是海洋天然活性產(chǎn)物的重要來(lái)源[8]。從海鞘(Trididemnumsolidum)中分離得到的環(huán)肽Didemnin B在1984年進(jìn)入一期臨床試驗(yàn)階段,成為第一個(gè)進(jìn)入臨床研究的海洋藥物[9]。Didemnin B具有環(huán)狀脫氫肽的新穎結(jié)構(gòu),對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,此外還具有抗病毒的生物功能[10]。Didemnin B通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的生物合成來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞毒性及免疫抑制作用[11]。而在這之后,又從加勒比海海鞘(Ecteinascidiaturbinate)中分離得到Ecteinascidin 743(ET-743),該化合物屬于生物堿,具有廣譜的抗癌活性,被稱為海洋藥物史上里程碑式的發(fā)現(xiàn)之一[12]。ET-743具有獨(dú)特的作用機(jī)制,在體外能夠抑制轉(zhuǎn)錄依賴的核苷酸切除修復(fù)途徑,以及通過(guò)影響細(xì)胞周期來(lái)促進(jìn)非p53途徑依賴的細(xì)胞凋亡[13]。在臨床上ET-743也顯示出較高的應(yīng)用價(jià)值[14]。

真海鞘屬于脊索動(dòng)物門、尾索亞門、海鞘綱[15]。主要分布于日本海南鹿半島以北以及韓國(guó)東、南海岸。由于其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、類胡蘿卜素、?；撬?、血漿原和其他微量營(yíng)養(yǎng)素等[16],日本、韓國(guó)和中國(guó)都開展了真海鞘的人工養(yǎng)殖[17]。近年來(lái),在真海鞘中發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的真海鞘內(nèi)囊酶解物[18]、抗微生物的血細(xì)胞凝集素等[19]。但關(guān)于真海鞘抗腫瘤活性的天然小分子報(bào)道甚少,且缺乏作用機(jī)制方面的研究工作[20]。

本研究采用真海鞘為原料,以乙醇為介質(zhì)提取真海鞘根索及被囊中的天然活性產(chǎn)物。利用硅膠柱層析、液相層析等方法對(duì)其進(jìn)行分離純化,并利用腫瘤細(xì)胞系研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

真海鞘采于山東省榮成市尋山集團(tuán)。高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和1X磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購(gòu)買于Biological Industries (Israel)。噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)買于Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。有機(jī)試劑均購(gòu)買于國(guó)藥。薄層層析(TLC)所用硅膠制備板來(lái)自默克。硅膠來(lái)自于青島海洋化工集團(tuán)。HepG2細(xì)胞來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)陳西廣教授實(shí)驗(yàn)室,HeLa細(xì)胞和L929細(xì)胞來(lái)自中科院上海細(xì)胞庫(kù),HT-1080細(xì)胞來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。細(xì)胞培養(yǎng)所用耗材包括96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Thermo Fisher,167008)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING,3524)、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Thermo Fisher,140675)和細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Thermo Fisher,156367)。

1.2 活性物質(zhì)制備與純化

1.2.1 真海鞘根索和被囊乙醇提取物的制備 解剖取真海鞘根索和被囊,破碎機(jī)打碎約40目,將碎屑在95%乙醇中震蕩浸泡1周。

1.2.2 硅膠柱層析 乙酸乙酯-石油醚體系作為流動(dòng)相。將乙醇提取物原液拌于200～300目硅膠中。待樣品干于硅膠中后進(jìn)行干法裝柱。最下端為300～400目硅膠,高度約為40 cm,上層為樣品,最上層為60～80目硅膠用于緩沖。裝好層析柱之后,使用極性較小的石油醚對(duì)硅膠柱進(jìn)行浸潤(rùn)。浸潤(rùn)完成后依次采用洗脫劑石油醚∶乙酸乙酯=1∶3(800 mL)、1∶2(400 mL)、1∶1(200 mL)、甲醇(500～700 mL)進(jìn)行洗脫,得到ST-Ⅱ。采用二氯甲烷-甲醇體系進(jìn)行制備型薄層層析(PLC)。將ST-Ⅱ點(diǎn)于默克制備型硅膠板上,流動(dòng)相條件為二氯甲烷∶甲醇=30∶1。層析結(jié)束后得到目的樣品。

1.2.3 制備液相純化 以色譜級(jí)甲醇(國(guó)藥)、純水為流動(dòng)相,流動(dòng)相極性由小到大(甲醇含量逐漸減小)進(jìn)行分離條件的摸索,在甲醇∶水=7∶3時(shí)對(duì)ST-Ⅱ-Ⅱ的分離效果最佳。制備時(shí)每次進(jìn)樣量為200 μL,按照各樣品出峰時(shí)間手動(dòng)接樣。制備液相所用色譜柱為Kromasil C18反向色譜柱,液相型號(hào)為日立L-2000型液相。

1.2.4 化合物的結(jié)構(gòu)解析1H NMR譜,1H-1H COSY譜均來(lái)自BRUKER AVANCE III HD 600 MHz核磁共振波譜儀。約1 mg樣品加入含有0.03%四甲基硅烷(Tetramethylsilane,TMS)的氘代DMSO,混合均勻,裝入核磁管中待測(cè),室溫測(cè)定。NMR譜圖通過(guò)Bruker Topspin 4.0.8及Mest Re Nova9.0.1軟件處理。

1.3 體外活性及機(jī)理研究

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均使用含15%胎牛血清(BI)和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。L929細(xì)胞使用含15%胎牛血清(Gibco)和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞在提供95%空氣,5%二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱(Thermo scientific)中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT(噻唑藍(lán))比色法 采用MTT體外檢測(cè)法檢測(cè)ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)Ω骷?xì)胞系的增殖抑制率[21]。將各細(xì)胞系種在96孔板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞的密度長(zhǎng)到60%左右時(shí)吸去舊培養(yǎng)液,加入含有不同濃度ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液。繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)48 h后吸去舊培養(yǎng)液,加入配置好的MTT染液,MTT染液由90%無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基和10%的MTT染液組成。37 ℃孵育4 h后吸去染液,每孔加入100 μL DMSO,37 ℃孵育5 min后在490 nm吸光度下檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光度值,并計(jì)算增殖抑制率。

1.3.3 DAPI細(xì)胞核染色 使用4,6-二脒基-乙-苯基吲哚(DAPI)染細(xì)胞核,觀察細(xì)胞核形態(tài)的方法作為細(xì)胞凋亡的一種指標(biāo)[22]。將HepG2細(xì)胞種在6孔板上,6孔板底部放置一片細(xì)胞爬片,使HepG2細(xì)胞爬片,便于后續(xù)拍照,37 ℃孵育24 h。待細(xì)胞密度達(dá)到孔的60%～70%后,吸去舊的培養(yǎng)液,加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液。之后37 ℃孵育24 h,取出細(xì)胞爬片,放置于載玻片上,DAPI染色后封片,激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM-900)拍照。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將HepG2細(xì)胞種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,然后37 ℃再次孵育24 h。用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集于EP管中后,加入染料,避光染色15 min,隨后置于冰浴中。1 000 r/min離心去除染液,加入適量PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特Cyto FLEX)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞比例。

1.3.5 細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè) 將HepG2種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,再次37 ℃孵育24 h。使用DCFH-DA探針染色15 min。15 min后,使用不含血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌染料3次。洗滌完成后,板中加入適量PBS緩沖液,倒置于熒光顯微鏡(品牌:尼康)拍攝。

1.3.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 將HepG2接種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,再次37 ℃孵育24 h。使用JC-1探針對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色,染色時(shí)在37 ℃培養(yǎng)箱中染色20 min。使用JC-1染色緩沖液洗滌2次,隨后孔內(nèi)加入適量PBS緩沖液防止細(xì)胞干燥。最后采用酶標(biāo)儀(Tecan Infinite E Plex)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。JC-1單體采用490 nm激發(fā)波長(zhǎng),530 nm發(fā)射波長(zhǎng)。JC-1聚合物采用525 nm激發(fā)波長(zhǎng),590 nm發(fā)射波長(zhǎng)。

1.3.7 Western Blot檢測(cè) 將HepG2接種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,37 ℃再次孵育24 h。孵育完成后,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,并收集于EP管中。隨后裂解細(xì)胞提取蛋白。蛋白提取完成后,上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完成后,濕法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后,使用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后將一抗按照1∶500比例稀釋后4 ℃過(guò)夜孵育。一抗孵育完成后,將PVDF膜(默克)取出,使用TBST清洗3次,每次15 min。二抗按照1∶1 000比例稀釋后在室溫下孵育1 h。二抗孵育完成后,再次在TBST中清洗3次,每次15 min。清洗完成后,顯色拍照。

2 結(jié)果

2.1 真海鞘根索被囊乙醇提取物活性物質(zhì)的分離與活性驗(yàn)證

真海鞘的構(gòu)造可以分為3部分:外部包圍著一層堅(jiān)硬的殼,呈橙紅色;殼頂部有生殖根;殼內(nèi)部為其身體組織,呈橙色(見圖1A)。

(A. 真海鞘成體及其3個(gè)組成部分;B. 根索和被囊乙醇提取物與內(nèi)囊乙醇提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性,2組實(shí)驗(yàn)組濃度均為200 μL/mL ,對(duì)照組加入含有與實(shí)驗(yàn)組等量乙醇的培養(yǎng)液,p<0.001,0.01

首先本文作者使用95%乙醇提取根索被囊以及內(nèi)囊中的天然活性產(chǎn)物。利用MTT比色法檢測(cè)兩部分的乙醇提取物是否具有細(xì)胞毒性。MTT比色法檢測(cè)結(jié)果表明根索被囊乙醇提取物對(duì)HepG2細(xì)胞具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性,內(nèi)囊乙醇提取物對(duì)HepG2細(xì)胞具有較弱的細(xì)胞毒性(見圖1B)。同時(shí)根索被囊乙醇提取物對(duì)L929細(xì)胞的毒性較小(見圖1C)。采用硅膠柱層析分離根索被囊乙醇提取物得到兩部分,第一部分命名為ST-Ⅰ,第二部分命名為ST-Ⅱ。MTT比色法檢測(cè)結(jié)果表明ST-Ⅱ?qū)epG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性(見圖1D)。

2.2 ST-Ⅱ的分離與活性驗(yàn)證

得到ST-Ⅱ后,采用PLC法,在二氯甲烷∶甲醇=30∶1的情況下對(duì)ST-Ⅱ進(jìn)行分離得到9個(gè)組分(見圖2A)。MTT比色法對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明,在加樣濃度為50 μg/mL、作用時(shí)間為48 h時(shí),第二組樣品的細(xì)胞毒性較為明顯(見圖2B),并將其命名為ST-Ⅱ-Ⅱ。對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的MTT比色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)ζ錈o(wú)明顯細(xì)胞毒性(見圖2C)。同時(shí)本文作者選擇發(fā)病率和死亡率較高的癌癥細(xì)胞系-人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞、人纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞,來(lái)檢測(cè)ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)λ鼈兊募?xì)胞毒性,結(jié)果表明,100 μg/mL濃度下,ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)eLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均顯示出細(xì)胞毒性,其中HepG2細(xì)胞對(duì)ST-Ⅱ-Ⅱ最為敏感(見圖2D)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均利用HepG2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

(A. PLC分離ST-Ⅱ得到1～9組組分;B. PLC分離ST-Ⅱ得到的9組組分(ST-Ⅱ-Ⅰ～ST-Ⅱ-Ⅸ)對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖影響,實(shí)驗(yàn)組濃度均為50 μg/mL,對(duì)照組加入含有與實(shí)驗(yàn)組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,0.001

2.3 ST-Ⅱ-Ⅱ的分離與活性驗(yàn)證

確定ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)Π┘?xì)胞具有毒性后,使用UPLC-MS/MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ含有多種具有生物活性的天然產(chǎn)物。為了進(jìn)一步確定ST-Ⅱ-Ⅱ中的有效活性化合物,使用制備液相對(duì)ST-Ⅱ-Ⅱ進(jìn)行分離。結(jié)果表明,在甲醇∶水=7∶3的條件下,得到了9個(gè)組分(見圖3A)。隨后對(duì)這9組分進(jìn)行了活性驗(yàn)證,在30 μg/mL的濃度下,第Ⅸ組分對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性最強(qiáng)(見圖3B),其他組分活性較弱或沒有生物活性。在10 μg/mL濃度下,ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ和紫杉醇對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制率處于同一水平。同時(shí)ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ對(duì)正常細(xì)胞L929無(wú)明顯細(xì)胞毒性(見圖3C)。以上結(jié)果表明ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是ST-Ⅱ-Ⅱ中導(dǎo)致細(xì)胞毒性的主要組分。

(A. HPLC分離ST-Ⅱ-Ⅱ得到的9個(gè)組分;B. HPLC分離ST-Ⅱ-Ⅱ得到的9個(gè)組分的活性驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)組濃度均為30 μg/mL,對(duì)照組加入含有與實(shí)驗(yàn)組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,p<0.001,0.01

2.4 ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的結(jié)構(gòu)鑒定

2.5 ST-Ⅱ-Ⅱ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

以上結(jié)果表明海鞘根索被囊乙醇提取物的主要活性為組分為ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ,但實(shí)驗(yàn)中ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ制備得率極低。基于ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是ST-Ⅱ-Ⅱ中的主要活性組分(見圖3B),本研究后續(xù)利用ST-Ⅱ-Ⅱ進(jìn)行作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)。

為了研究ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)epG2增殖抑制作用機(jī)制,本研究中使用Annexin V-FITC/PI染色,DAPI細(xì)胞核染色以及細(xì)胞凋亡抑制劑Nicotiflorin確認(rèn)添加ST-Ⅱ-Ⅱ是否導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果說(shuō)明,在濃度為70 μg/mL時(shí),作用24 h后,凋亡細(xì)胞的比例較對(duì)照組有明顯提高(見圖5A)。DAPI細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核有了較明顯的形態(tài)變化。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核呈現(xiàn)不規(guī)則形狀,有核裂解情況發(fā)生(見圖5B)。細(xì)胞凋亡抑制劑Nicotiflorin與ST-Ⅱ-Ⅱ共同作用后,凋亡細(xì)胞比例顯著減少(見圖5C)。以上結(jié)果說(shuō)明添加ST-Ⅱ-Ⅱ后引起HepG2細(xì)胞顯著凋亡。

(A.ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的核磁氫譜(1H NMR);B. ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的1H-1H COSY譜。 A. 1H NMR of ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ; B.1H-1H COSY spectrum of ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ.) 圖4 ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的結(jié)構(gòu)鑒定

2.6 ST-Ⅱ-Ⅱ通過(guò)線粒體凋亡途徑引起HepG2細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步研究ST-Ⅱ-Ⅱ引起HepG2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,本文作者進(jìn)行了線粒體膜電位、細(xì)胞ROS以及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)。在ST-Ⅱ-Ⅱ作用濃度為70 μg/mL,作用時(shí)間24 h后,HepG2細(xì)胞的ROS水平顯著升高(見圖6A),線粒體膜電位顯著降低(見圖6B)。ST-Ⅱ-Ⅱ處理后,HepG2細(xì)胞中促細(xì)胞凋亡蛋白p53和Bax表達(dá)水平顯著升高,而抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著降低(見圖6C)。以上結(jié)果表明,海鞘根索被囊乙醇提取物通過(guò)線粒體凋亡通路引起HepG2細(xì)胞凋亡。

(①ST-Ⅱ-Ⅱ+Nicotiflorin. A. AV/PI染色檢測(cè)ST-Ⅱ-Ⅱ作用后早期凋亡細(xì)胞的比例,實(shí)驗(yàn)組濃度為70 μg/mL,對(duì)照組加入含有與實(shí)驗(yàn)組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,0.001

(A. ST-Ⅱ-Ⅱ作用后HepG2細(xì)胞相關(guān)ROS水平,實(shí)驗(yàn)組濃度為70 μg/mL,對(duì)照組加入含有與實(shí)驗(yàn)組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,倒置熒光顯微鏡拍攝及相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),0.001

3 討論

本研究通過(guò)硅膠柱層析、PLC和HPLC等方法從真海鞘根索及被囊中分離得到具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的天然活性組分。采用制備液相分離ST-Ⅱ-Ⅱ后得到高效抑制HepG2細(xì)胞增殖的ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分。由于樣品制備得率極低,無(wú)法制備足夠量的ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ,不能對(duì)其進(jìn)行完整核磁圖譜檢測(cè),只檢測(cè)了氫譜和1H-1H COSY譜,結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,推測(cè)ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ為硬脂酸與二取代苯環(huán)酯化后形成的一類結(jié)構(gòu)新穎的化合物。此構(gòu)效關(guān)系與姜酚類活性產(chǎn)物類似。姜酚類活性產(chǎn)物具有抗腫瘤功效,并且其苯環(huán)所帶碳鏈越長(zhǎng),抗腫瘤作用越顯著[23]。另外也有多不飽和脂肪酸能夠引起人源癌細(xì)胞鐵死亡的報(bào)道[24]。通過(guò)本研究推測(cè)的結(jié)構(gòu)同樣為二取代苯環(huán)加長(zhǎng)碳鏈結(jié)構(gòu)。所以在此結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)類似物的基礎(chǔ)上,可能存在著高效的抗腫瘤天然活性產(chǎn)物。

ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ無(wú)法制備得到更多樣品,但ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分占ST-Ⅱ-Ⅱ的40%左右(見圖3A),且ST-Ⅱ-Ⅱ的抗腫瘤活性集中在ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分,所以本研究中用ST-Ⅱ-Ⅱ進(jìn)行作用機(jī)制的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ抑制人肝癌細(xì)胞(HepG2)增殖的機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡也稱為細(xì)胞程序性死亡,是細(xì)胞通過(guò)死亡來(lái)減少細(xì)胞增殖或?qū)?xì)胞DNA損傷做出反應(yīng)的一種機(jī)制[25]。細(xì)胞凋亡主要通過(guò)兩種途徑(線粒體信號(hào)通路和死亡受體信號(hào)通路)來(lái)實(shí)現(xiàn),而在線粒體信號(hào)通路控制的細(xì)胞凋亡中,Bcl-2蛋白家族起了非常關(guān)鍵的作用[26]。本文作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ能夠促使HepG2細(xì)胞活性氧水平升高,線粒體膜電位降低,線粒體凋亡通路中的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低,促凋亡蛋白Bax、p53蛋白的表達(dá)量升高,所以證實(shí)ST-Ⅱ-Ⅱ通過(guò)線粒體凋亡通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡。線粒體是細(xì)胞的能量中心,是有氧呼吸的主要場(chǎng)所[27]。多種疾病都與線粒體有關(guān),如帕金森病[28],糖尿病等[29]。此外,線粒體參與凋亡調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,被認(rèn)為是治療癌癥的一個(gè)重要靶點(diǎn)[30]。因此,ST-Ⅱ-Ⅱ通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,表明ST-Ⅱ-Ⅱ具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,本研究中的發(fā)現(xiàn)為該化合物在癌癥治療中的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

到目前為止,越來(lái)越多來(lái)源于海鞘的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn),其中的功能也各有異同。一些天然產(chǎn)物來(lái)源于海鞘本身,另一些來(lái)自海鞘的共生微生物。生物堿類物質(zhì)是在海鞘及其共生微生物中發(fā)現(xiàn)的最多的天然化合物種類[7]。來(lái)源于海鞘(Aplidiummeridianum)本身的生物堿類化合物Meridianins[31]是多種蛋白激酶的抑制劑。已經(jīng)應(yīng)用于臨床的生物堿類化合物ET-743來(lái)源于海鞘的共生微生物Ca.E. frumentensis[32]。關(guān)于ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是來(lái)源于真海鞘自身還是來(lái)源于其共生微生物這個(gè)問題目前還不清楚,后續(xù)工作將會(huì)提高ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ制備得率,來(lái)確定其結(jié)構(gòu)及來(lái)源。真海鞘根索及被囊中天然活性產(chǎn)物的報(bào)道極少,本研究結(jié)果表明,真海鞘根索及被囊中含有高效的抗腫瘤天然活性產(chǎn)物,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所譚昌恒老師對(duì)核磁圖譜以及化合物解析方面的指導(dǎo)。感謝中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院王長(zhǎng)云老師,邵長(zhǎng)倫老師給予的實(shí)驗(yàn)上的指導(dǎo)以及實(shí)驗(yàn)儀器上的幫助。感謝中國(guó)海洋大學(xué)食品學(xué)院徐杰老師給予的實(shí)驗(yàn)儀器上的幫助。