基于哺乳動物細胞表達S1蛋白的豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體

李虎林 顏仁和 陳澤典 仇珍珍 李堪賀 馬曼欣 毛瑩瑩 李建軍 呂宗吉李紅衛(wèi)，★

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種、臨床上以豬的急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉、脫水為特征的高度接觸性腸道傳染病，哺乳仔豬的死亡率可高達100%［1］。該病毒在70 年代初首次在英國發(fā)現(xiàn)［2］，我國從80 年代初開始相繼報道，并于2010 年開始大面積流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失［3］。因此建立快速、敏感、特異性強的檢測方法，對于該病的防控顯得尤為重要。

PEDV屬于冠狀病毒科，α冠狀病毒屬成員，其基因組是大小約為28 kb 的單股正鏈RNA，主要編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白，包括纖突（Spike，S）蛋白、膜（Membrane，M）蛋白、包膜（Envelope，E）蛋白、核衣殼（Nucleocapsid，N）蛋白，3 個非結(jié)構(gòu)蛋白（復制酶1a和1b，ORF3）［4］。其中，S 蛋白是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，參與病毒與宿主細胞的吸附和融合，同時它也是誘導宿主產(chǎn)生中和抗體的主要抗原分子。另外，S 基因位于PEDV 基因組的高變異區(qū)，PEDV 經(jīng)典毒株和變異毒株的核苷酸序列的主要差別也位于S 基因，因此S 基因可用于PEDV 毒株的鑒別診斷［5-6］。本研究在課題組前期研究基礎(chǔ)上［7-8］，利用哺乳動物細胞表達的S1重組蛋白免疫小鼠，制備抗S1 蛋白的單克隆抗體，為豬流行性腹瀉病毒血清學檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株、實驗動物

哺乳動物細胞表達的重組PEDV S1 蛋白，豬流行性腹瀉病毒（PEDV，GDS10 毒株），豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PPRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus 2，PCV2）、豬細小病毒（Porcine parvovirus，PP），豬瘟病毒石門株（Classical swine fever virus，CSFV），Vero 細胞等均由廣州伯尼茲生物科技有限公司和佛山科學技術(shù)學院制備或保存。6～8 周齡BALB/C 小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT試劑購自Sigma 公司，HRP 標記的羊抗鼠IgG，F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG；雙組分TMB 顯色液購自北京索萊寶科技有限公司。二氨基聯(lián)苯胺購自上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司；二甲基亞砜；0.25%胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基及南美胎牛血清均為Hyclon公司產(chǎn)品。

1.3 重組PEDV S1 抗原制備及免疫小鼠

293T 細胞表達的重組PEDV S1 蛋白為廣州伯尼茲生物科技有限公司生產(chǎn)純化，并與佐劑充分混合制備抗原。

將重組S1 抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，以每只小鼠50 μg 的量皮下注射BALB/c小鼠，一次免疫后，每隔兩周，按同樣方法將同等劑量的抗原與弗氏不完全佐劑乳化后分別進行兩次加強免疫。三次免疫10 天后小鼠尾靜脈取血。以重組S1 抗原包被，ELISA 檢測血清效價。取效價大于1∶105的小鼠，用100 μg 的抗原加強免疫，并于免疫后3 天取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合。

1.4 雜交瘤細胞的制備和篩選

將免疫小鼠的脾細胞懸液與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0 按1∶1 的比例混合，在50%PEG 的作用下進行細胞融合。將融合細胞置于含20%血清的HAT-DMEM 培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細胞數(shù)量，分至96 孔板中，每孔200 μL。培養(yǎng)三天后，觀察細胞融合情況，更換一半HAT 培養(yǎng)液，連續(xù)數(shù)日，直至有克隆形成，更換HT 培養(yǎng)液培養(yǎng)一天，更換DMEM 完全培養(yǎng)基。間接ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清，選擇效價較高的陽性克隆雜交瘤細胞，并用有限稀釋法連續(xù)克隆化2～3 次，直至100%細胞陽性率，最后獲得穩(wěn)定分泌抗PEDV S1 蛋白單克隆抗體細胞株。將克隆化后陽性率達100%的細胞擴增培養(yǎng)后液氮凍存。

1.5 單克隆抗體抗體的Western Blot 鑒定

將重組PEDV S1 蛋白及空白組HEK-293 細胞培養(yǎng)上清用1×SDS 裂解緩沖液裂解后進行SDSPAGE，然后后用Bio-Rad 電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶封閉過夜，用純化的PEDV S1 蛋白單克隆抗體為一抗，羊抗小鼠IgG為二抗，進行Western Blot 反應(yīng)。

1.6 單抗的制備純化及亞型鑒定

將雜交瘤細胞株在150 mm 細胞培養(yǎng)皿中用DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)生長至細胞密度達到80%以上進行擴大培養(yǎng)，一個150 mm 培養(yǎng)皿細胞用無血清培養(yǎng)基傳代5 個150 mm 培養(yǎng)皿細胞，培養(yǎng)96 h 后收集無血清培養(yǎng)基，并更換等量新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h，再次收集細胞上清液合并后進行純化。采用親和色譜法Protein G Sepharose Fast Flow 純化單克隆抗體，并通過Sepharose S-200 分子篩脫鹽，PBS 洗脫，以SDS-PAGE 測定單克隆抗體的純度。

單克隆抗體采用Hbt 公司的鼠單抗亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細胞株的亞型。間接ELISA 的方法［8］檢測雜交瘤細胞DMEM 培養(yǎng)上清液和無血清培養(yǎng)基上清的抗體效價

1.7 單抗的穩(wěn)定性試驗

將凍存的雜交瘤細胞復蘇后連續(xù)傳代20 代。并收集每代的細胞培養(yǎng)液，用間接ElisA 的方法測定第2、5、10、15、20 代的細胞培養(yǎng)液抗體效價，以分析雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.8 間接免疫染色試驗及單克隆抗體敏感性檢測

將PEDV 病毒稀釋后接入提前長成單層Vero細胞的96 孔板中，培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，加入預(yù)冷的固定液（冰丙酮：乙醇=2∶3），室溫固定20 min；PBST 洗滌2 次后加入羊血清37℃封閉30 min；加入10%脫脂奶稀釋的單克隆抗體，置于37℃溫箱中孵育1 h；用PBST 漂洗三次，二抗用10%脫脂奶按1∶1 000 稀釋，每孔100 μL，37℃避光放置1.5 h；PBST 洗滌后每孔加入適量的DAB，室溫作用10 min，用蒸餾水洗3 次，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。同時設(shè)不接毒的正常細胞為陰性對照。

取單克隆抗體按100、500、1 000、2 000、4 000、8 000 倍進行稀釋，按上述方法進行免疫染色實驗，然后置顯微鏡下觀察并拍照。同時設(shè)正常細胞為空白對照

1.9 單克隆抗體特異性的測定

采用上述建立的間接ELISA 方法檢測篩選得到的單克隆抗體與PEDV、PPRV、PRRSV、PCV2、PP 和CSFV 等是否發(fā)生交叉反應(yīng)，以正常SP2/0 細胞培養(yǎng)上清為陰性對照，驗證單克隆抗體的特異性檢測。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細胞株的篩選

免疫小鼠的脾細胞和SP2/0 骨髓瘤細胞融合后，經(jīng)多次克隆及亞克隆篩選，共得到5 株能與PEDV S1 蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)的單抗表達細胞株。分別命名為：12D14H4、13F5B9、10D2B10、11A7C9 和14E6F5，其分泌的抗體效價分別為：1∶51 200、1∶25 600、1∶12 800、1∶12 800、1∶3 200。

2.2 單克隆抗體能與PEDV-S 蛋白特異性結(jié)合

Western Blot 結(jié)果顯示，5 株單抗與PEDV S1蛋白反應(yīng)后，均在130 KDa 附近出現(xiàn)清晰條帶。見圖1。

圖1 單克隆抗體與PEDV-S1 蛋白的Western-Blot 鑒定圖Figure 1 Western blot analysis of PEDV S1 monoclonal antibody

2.3 單抗的純化

單克隆抗體培養(yǎng)上清經(jīng)Protein G 親和層析法純化后的單克隆抗體進行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果顯示，無血清培養(yǎng)液中的單克隆抗體雜蛋白較少，純化后目的蛋白在55 KDa 和25 KDa 附近出現(xiàn)清晰條帶，無雜帶，純化后單抗純度95%以上。見圖2。

圖2 PEDV 單克隆抗體純化結(jié)果圖Figure 2 Purification of the PEDV S1 monoclonal antibody

2.4 抗體亞型及效價測定

通過多次亞克隆篩選出1 株穩(wěn)定分泌抗PEDV S1 單克隆抗體的效價最高的雜交瘤細胞株，命名為PEDV-12D14H4。經(jīng)ELISA 方法鑒定，該雜交瘤細胞株的DMEM培養(yǎng)上清及無血清培養(yǎng)上清產(chǎn)生的抗體效價分別為1∶51 200 和1∶1 024 000。經(jīng)過鼠單抗亞型鑒定試劑盒鑒定，PEDV-12D14H4分泌抗體的亞型為IgGⅠ型，輕鏈為k 鏈。

2.5 雜交瘤細胞穩(wěn)定性分析

分別選取雜交瘤細胞株P(guān)EDV-12D14H4 第2、5、10、15、20 代培養(yǎng)上清，進行抗體的效價測定，結(jié)果顯示，不同代次的雜交瘤細胞分泌的抗體效價基本一致。見表1。

表1 雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性分析結(jié)果Table 1 Stability of the hybridoma cells secreting antibody

2.6 PEDV 間接免疫染色檢測方法的建立

PEDV 感染Vero 細胞后加入單抗后按間接免疫染色（DAB）方法進行染色，結(jié)果表明，接種PEDV 的Vero 細胞有明顯的特異性顯色，而陰性對照組（不接毒的正常細胞）未見顯色。見圖3。

圖3 PEDV 間接免疫染色圖（DAB，×100）Figure 3 PEDV infection by indirect immunofluorescent assay（DAB，×100）

2.7 單克隆抗體敏感性檢測

接種PEDV 病毒液的細胞中加入不同稀釋度（1∶100，1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000）的Cy-3-12D14H4 單克隆抗體，同時設(shè)正常細胞為空白對照，在倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果表明，將單抗稀釋至4 000 倍仍可觀察到典型的特異性顯色。見圖4。

圖4 間接免疫染色敏感性檢測（100×）Figure 4 Sensitivity detection of the McAb by indirect immunofluorescent assay（100×）

2.8 單克隆抗體特異性測定

以豬PEDV、PPRV、PRRSV、PCV2、PP 和CSFV為包被抗原，檢測單克隆抗體的特異性。間接ELISA 結(jié)果顯示，PPRV、PRRSV、PCV2、PP 和CSFV 均不與12D12H4 雜交瘤細胞分泌的單抗發(fā)生交叉反應(yīng)，與陰性對照組基本一致。見表2。

表2 單克隆抗體的特異性分析Table 2 specificity analysis of the MAb

3 討論

根據(jù)研究報道，我國的養(yǎng)豬業(yè)因病毒感染而導致腹瀉的主要三大類病毒中，PEDV 占46%，PRV 占8%，TGEV 占15%，PEDV 儼然已成為當前國內(nèi)豬群腹瀉流行的最主要原因［9］。由于PED與TGE 等其他腹瀉疾病在流行病學、臨床癥狀等方面表現(xiàn)非常相似，加上病毒變異，給PED 的快速診斷與防治都帶來了一定困難［10］。因此亟需制備一種針對PEDV 的高滴度、高特異性抗體，用于病毒的血清學檢測。制備成功純度高、抗原性好的PEDV 抗原蛋白是獲得高質(zhì)量抗體單克隆抗體的前提和基礎(chǔ)。而PEDV 體外分離培養(yǎng)難度高，感染細胞病變不明顯，抗體滴度較低，純化過程比較繁瑣且純度不高。原核細胞表達的蛋白由于不具備翻譯后修飾過程，重組蛋白制備的單克隆抗體用于檢測天然蛋白時出現(xiàn)假陰性幾率較高，因此很難在臨床上進行推廣。目前，蛋白的表達系統(tǒng)主要包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)等，我們課題組前期實驗證明，哺乳動物表達的蛋白，結(jié)構(gòu)更接近于天然蛋白，具有更好的免疫原性，免疫動物后能產(chǎn)生高水平的特異性抗體［11-12］。

本研究利用哺乳動物細胞表達純化的PEDV S1 重組蛋白與佐劑一起乳化并免疫BABL/C 小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0 細胞進行雜交融合，經(jīng)間接ELISA 檢測篩選，獲得5 株抗體效價高、特異性強、穩(wěn)定性好的抗PEDV 單克隆抗體。單克隆抗體的體外生產(chǎn)相較于腹水生產(chǎn)具有顯著優(yōu)勢：一、可大規(guī)模制備，降低生產(chǎn)成本；二、避免其它鼠源抗體的干擾，易于得到高純度的單抗；三、質(zhì)量可控。本研究得到的單抗采用雜交瘤細胞培養(yǎng)，上清中抗體效價可達1∶51 200，更換為無血清培養(yǎng)基后，進一步避免了血清中的蛋白質(zhì)以及各種大分子物質(zhì)對單抗的影響，使得單抗的純度及回收率大大提高，效價可達到1∶1 024 000。無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用也降低了常規(guī)血清培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本及不穩(wěn)定性，為單抗的大規(guī)模應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。本研究制備的PEDV 單克隆抗體具有較高的特異性，該單抗的成功研制，為PEDV 免疫診斷、表位識別及蛋白研究奠定了良好基礎(chǔ)。