廣西人群miR-30基因rs16827546C/T和rs10095483A/C多態(tài)性分布特征及其與血脂水平的關(guān)系

韋葉生 羅艷萍 劉潮 谷嬉嬉 王騰 曾志能 藍艷

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是由人類基因組編碼的單鏈非編碼小RNA分子，近年來逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，其長約22 個核苷酸，是人類基因組的重要組成部分，在真核細胞中廣泛存在。miRNA參與基因表達調(diào)控的多個方面，它們通過靶向作用mRNA使mRNA不穩(wěn)定、抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)生或抑制靶基因翻譯，在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。近年來，心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈急劇上升趨勢，然而其發(fā)病機制尚未完全闡明，可能與基因組背景、生活方式、環(huán)境因素、血脂水平的改變以及它們之間的相互作用有關(guān)，其中血脂水平的改變是心腦血管疾病發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)［2-3］。因此，研究miRNA 在血脂調(diào)控中的潛在分子機制有助于預(yù)防以血脂異常為發(fā)病基礎(chǔ)的心腦血管疾病的發(fā)生。miR-30基因已被證實為參與血脂調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并且可以在血漿中穩(wěn)定測定［4］，然而，國內(nèi)外鮮見關(guān)于miR-30基因遺傳多態(tài)性以及其多態(tài)性與血脂關(guān)系的報道。因此，本研究采用SNPscan 技術(shù)分析廣西人群miR-30基因簇位點rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 的遺傳多態(tài)性特征，并與人類基因組計劃（HapMap）公布的不同地區(qū)、不同人群的基因多態(tài)性分型數(shù)據(jù)進行比較，以探究其在不同地區(qū)、不同種族人群中的分布差異，并進一步探討其與血脂的關(guān)系，為構(gòu)建我國人群的基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫以及早期預(yù)防和控制血脂提供參考資料，同時也可為今后研究miR-30基因多態(tài)性相關(guān)疾病以及群體遺傳學(xué)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象

隨機選取2020 年9 月至2021 年7 月到桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的志愿者289 例，其中男性167例，女122 例，年齡在23～72 歲。排除自身免疫性疾病、心血管、腦血管和器質(zhì)性疾病，各臨床檢查及實驗室指標(biāo)正常，均為健康無親緣關(guān)系的獨立個體。本研究在院倫理委員會批準(zhǔn)下進行，所有志愿者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取

使用北京天根生化科技有限公司血液基因組DNA 提取試劑盒（批號：DP348-03，規(guī)格：200preps）提取基因組DNA 進行分裝并冷凍儲存（-70℃）備用。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成

登錄NCBI 查詢miR-30基因rs16827546 和rs10095483 的DNA 序列，引物序列的設(shè)計采用Premier 3.0 在線軟件進行設(shè)計，引物序列的設(shè)計由上海天昊生物科技有限公司公司完成。引物序列：rs16827546 C/T，上游：TTTTCTGGAACGTGGCAAACTT，下游：ATCTGCGGAGTGGAGACTGTTC，rs10095483 A/C：上游：CCAACTACCAAACAAGGGCATTC，下游：CTCCCAGAGAAAAAG TGTGTTAATTG

1.2.3 連接和多重PCR 反應(yīng)及基因分型檢測

1.2.3.1 連接反應(yīng) 連接反應(yīng)按以下程序運行：94℃1 min，58℃4 h，循環(huán)4 次，94℃2 min，72℃forever。

1.2.3.2 多重?zé)晒釶CR 反應(yīng) 反應(yīng)總體積為20 μL，PCR 擴增按以下程序進行：96℃1 min，94℃20 s，60℃40 s（每個循環(huán)降低0.5℃），72℃2 min，循環(huán)9 次；94℃20 s，57℃40 s，72℃1.5 min，循環(huán)25 次；68℃60 min；4℃forever。

1.2.3.3 基因分型檢測 將多重PCR 產(chǎn)物10 倍dd H2O 稀釋，振蕩混勻，取1.0 μL PCR 產(chǎn)物與1 μL LIZ500+8.9 μL Hi-Di 混勻，95℃變性5 min 后ABI3730XL 測序儀檢測，GeneMapper 4.1 分析原始數(shù)據(jù)。

1.2.3.4 數(shù)據(jù)分析與比較 分析289 例廣西人群miR-30基因rs16827546 和rs10095483 的測序結(jié)果，直接法計算兩位點基因型和等位基因頻率，并與NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的人類基因組計劃（HapMap）的歐州人（CEU）、日本人（JPT）、約魯巴人（YRI）、意大利人（TSI）和北京漢族人（HCB）人群的SNP 分型數(shù)據(jù)進行比較分析。

1.2.4 血脂水平檢測

受試者空腹8 h 以上，于次日清晨采集靜脈血3 mL，分離收集血漿，生化分析儀分析總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycer-ide，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)；兩位點的基因型和等位基因頻率的分布用χ2檢驗進行分析；正態(tài)分布的計量資料用（）表示，行t檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 兩位點基因分型檢測結(jié)果

分型結(jié)果顯示rs16827546 C/T存在CC（86.2%）、CT（13.8%）兩種基因型。rs10095483 A/C 位點存在AA（89.3%）、AC（10.7%）兩種基因型。見圖1、2。

圖1 miR-30 基因簇rs16827546 位點測序圖Figure 1 The sequencing map of miR-30 gene rs1682754

2.2 廣西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 位點多態(tài)性在不同性別間的分布

廣西人群miR-30基因rs16827546 C/T 基因型以CC（86.2%）多見；rs10095483 A/C 基因型以AA（89.3%）多見，兩位點的基因型和等位基因頻率在男女性別間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 廣西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 基因型和等位基因頻率的比較［n（%）］Table 1 Comparison of rs16827546 and rs10095483 of miR-30 gene of Guangxi populationin in different genders［n（%）］

圖2 miR-30 基因rs10095483 位點測序圖Figure 2 The sequencing map of miR-30 gene rs10095483

2.3 廣西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 兩位點多態(tài)性與其他人群間的比較

廣西人群兩位點基因型和等位基因頻率與HanpMap 計劃公布的CEU、YRI 和TSI 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；廣西人群rs16827546 基因型和等位基因頻率與與JPT 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；廣西人群兩位點基因型和等位基因頻率與HCB 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、表3。

表2 廣西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 基因型和等位基因頻率與不同地區(qū)人群的比較［n（%）］Table 2 Comparison of rs16827546 C/T genotypes and allele frequencies of miR-30 gene of Guangxi population in different regions［n（%）］

表3 廣西人群miR-30 基因rs10095483 A/C 基因型和等位基因頻率與不同地區(qū)人群的比較［n（%）］Table 3 Comparison of rs10095483 A/Cgenotypes and allele frequencies of miR-30 gene of Guangxi population in different regions［n（%）］

2.4 廣西人群miR-30 基因rs16827546 C/T 和rs10095483 A/C 多態(tài)性與血脂水平相關(guān)性分析

rs16827546 C/T 位點攜帶CC 基因型LDL-C 和TC 與攜帶CT 基因型組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。rs10095483 A/C 位點AA 基因型的各項血脂指標(biāo)水平與AC 基因型相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表4 miR-30 基因rs16827546 C/T 基因型的各項血脂指標(biāo)比較［（±s）］Table 4 Comparison of blood lipid indexes of miR-30 rs16827546 C/T genotype［（±s）］

表4 miR-30 基因rs16827546 C/T 基因型的各項血脂指標(biāo)比較［（±s）］Table 4 Comparison of blood lipid indexes of miR-30 rs16827546 C/T genotype［（±s）］

表5 miR-30 基因rs10095483 A/C 基因型的各項血脂指標(biāo)比較（mmol/L）Table 5 Comparison of blood lipid indexes of miR-30 rs10095483 A/C genotype（mmol/L）

3 討論

miRNA在生物體內(nèi)存在初級miRNA（pri-miRNA）、前miRNA（pre-miRNA）及成熟miRNA三種形式，pri-miRNA、pre-miRNA經(jīng)過Dicer 剪切和加工，成為成熟的miRNA，成熟的miRNA調(diào)控約60%的人類蛋白質(zhì)的編碼基因［5］。miR-30基因?qū)儆趍iRNA基因家族中重要的成員之一，其編碼基因位于人類1、6 和8 號染色體上。研究發(fā)現(xiàn)［6］，大量靶基因翻譯受到miR-30的調(diào)控，miR-30基因通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥和自噬等病理、生理過程，從而在細胞生長、組織分化和臨床相關(guān)疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。動脈粥樣硬化是冠心病、缺血性腦卒中、外周血管病的主要發(fā)病原因，血脂代謝障礙為動脈粥樣硬化的病變基礎(chǔ)，這是由于動脈壁巨噬細胞中膽固醇的積累和脂類代謝率的失調(diào)引起的，這種失調(diào)包括LDL-C、TG 和TC 水平的升高以及血清中HDL-C 的降低［7］。遺傳因素被認(rèn)為約占血脂代謝障礙發(fā)生率的50～80%［8］，Zhang 等［9］研究表明，上調(diào)miR-30對動脈粥樣硬化具有保護作用。LDL-C 和TC 作為心血管疾病的生物標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-30會降低血漿LDL-C和TC 水平［10］。此外，miR-30還可通過基因生物靶向作用減少脂質(zhì)合成和含LDL 脂蛋白的產(chǎn)生，以避免脂肪變性和降低血漿脂質(zhì)［11］。這些研究結(jié)果表明，miR-30可能是參與血脂調(diào)控的關(guān)鍵基因之一，其可能成為血脂異常類疾病治療的潛在新靶點。

近年來，基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系受到研究者的重視和廣泛關(guān)注，成為基因研究領(lǐng)域的熱點［12］。單核苷酸多態(tài)性（SNPs）是人類可遺傳變異中最常見類型，是由于單個苷酸變異而引起DNA序列的改變，研究表明，miR-30基因有多個功能性SNPs 位點，這些功能性SNPs 位點與miR-30基因調(diào)控的相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［13］，隨著人類基因組計劃的完成，多地區(qū)、多民族的分散研究成為基因多態(tài)性研究的前沿趨勢［14］，Wang 等［15］對中國毛南族和漢族人群單核苷酸多態(tài)性與血脂的關(guān)系進行了研究，結(jié)果顯示，G 等位基因攜帶者毛南人的高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平低于漢族人，其高膽固醇血癥、高三酰甘油血癥的患病率顯著高于漢族人群；Ling 等［16］對我國京族和漢族基因多態(tài)性與總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的相關(guān)性進行了研究，結(jié)果分析顯示不同基因型間血清TC 和LDL-C 水平存在顯著性差異，因此說明不同民族和種族人群脂代謝相關(guān)基因的某些遺傳特征和基因型可能有所不同。廣西位于中國西南地區(qū)，屬于中國少數(shù)民族的聚居地，本研究通過對289 例廣西人群rs16827546 C/T和rs10095483 A/C 基因型和等位基因頻率進行分析，結(jié)果顯示，廣西人群兩位點的基因型和等位基因頻率與人類基因組計劃公布的CEU、YRI、TSI 相比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而與我國北京漢族人群相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此結(jié)果說明，種族背景和地域差異是影響基因多態(tài)性的重要因素。在此次廣西人群基因多態(tài)性與血脂的相關(guān)性研究中，本研究在分析廣西人群位點rs16827546 C/T 和rs10095483A/C 不同基因型與血脂水平的差異后發(fā)現(xiàn)，rs16827546 C/T 位點兩種基因型血脂之間比較，攜帶CT 基因型的TC（膽固醇）和LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇）與CC 組比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明廣西人群miR-30多態(tài)性rs16827546與血脂的關(guān)系更為密切，今后在研究血脂相關(guān)疾病時，可優(yōu)先考慮rs16827546 位點。

本研究是首次對廣西地區(qū)人群miR-30基因簇rs16827546 和rs10095483 位點遺傳多態(tài)性展開研究，揭示了廣西人群miR-30基因上述兩位點遺傳多態(tài)性的分布特征，探討分析了其基因多態(tài)性分布差異的可能原因，加深了對基因多態(tài)性的認(rèn)識，為miR-30基因相關(guān)疾病的研究奠定了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。本研究還發(fā)現(xiàn)廣西人群rs16827546 C/T 多態(tài)性與血脂水平密切相關(guān)，這將為研究更多其他人群多態(tài)性數(shù)據(jù)及對以血脂異常為發(fā)病基礎(chǔ)的相關(guān)疾病提供方向。然而，本研究的樣本量較少，可能存在選擇偏倚，在今后的研究中本課題組將加大樣本量并且納入人類遺傳學(xué)中的環(huán)境、年齡、民族等因素進行多中心的前瞻性研究。