基于計(jì)算機(jī)模擬的丹參中黃酮類化合物抗腫瘤活性篩選

蒯振彧，朱正飛，曾宣，陳泓蓉

作者單位：馬鞍山職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)教研室，安徽 馬鞍山243031

丹參是唇形科鼠尾草屬植物，又名赤參，紫丹參，紅根等，為常見中藥，有“一味丹參，功同四物”之說(shuō)，歷代本草皆有收載，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)。具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養(yǎng)血安神等功效［1］?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明丹參中主要含有丹參酮類［2］、丹酚酸類［3］、揮發(fā)油［4］等化學(xué)成分，具有保護(hù)心血管、抗心律失常、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用［5］。近年來(lái)體外藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參中黃酮類化合物如丹參酮Ⅰ、ⅡA、Ⅵ、隱丹參酮、異隱丹參酮等抗腫瘤活性［6-7］，其中丹參酮ⅡA 的作用機(jī)制研究的較為深入，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［8］，抑制腫瘤細(xì)胞遷移［9］，抑制腫瘤細(xì)胞增殖［10］等作用。研究表明，丹參類制劑臨床上聯(lián)合放化療治療，在增加抗腫瘤療效的同時(shí)能夠減輕放化療產(chǎn)生的毒副反應(yīng)，改善病人生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期［10-13］。

目前對(duì)于丹參黃酮類的化合物主要集中在提取分離和單體分子的體外活性實(shí)驗(yàn)，抗腫瘤作用機(jī)制的研究不夠系統(tǒng)。分子對(duì)接通過(guò)模擬候選藥物與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合，分析作用機(jī)制，預(yù)測(cè)結(jié)合模式，促進(jìn)了藥物設(shè)計(jì)和新藥研發(fā)的效率［14-16］。本研究于2021 年12 月至2022 年3 月利用對(duì)接模擬預(yù)測(cè)活性分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能力，Lipinski五法則及一系列ADMET（吸收，分布，代謝，排泄，毒性）特性對(duì)化合物進(jìn)行類藥性分析，為天然藥物丹參中活性成分的篩選以及抗腫瘤藥物的研發(fā)提供參考及線索。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，網(wǎng)址：http：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php）和TCM@TAIWAN（網(wǎng)址：http：∕∕tcm.cmu.edu.tw∕）數(shù)據(jù)庫(kù)；有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem，網(wǎng)址：https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB，Protein Date Bank，網(wǎng) 址：https：∕∕www1.rcsb.org）；Sybyl-X 2.1 軟件；Molegro Virtual Docker（MVD）軟件；Discovery Studio 2019 Client軟件。

1.2 方法

1.2.1小分子配體準(zhǔn)備 在TCMSP 和TCM@TAIWAN數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索關(guān)鍵詞“丹參”，選擇丹參黃酮類分子，從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載相應(yīng)sdf 格式的化合物，并采用Chem 3D 軟件中Calculations 程序?qū)λ蟹肿舆M(jìn)行Minimize Energy 力場(chǎng)優(yōu)化后完成mol2 格式轉(zhuǎn)換，建立此次分子對(duì)接的小分子化合物庫(kù)，配體信息見表1。

表1 丹參黃酮類對(duì)接的配體分子信息

1.2.2受體蛋白優(yōu)化處理 根據(jù)文獻(xiàn)［15，22-24］，選擇了20個(gè)腫瘤相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白作為受體，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)，以pdb結(jié)構(gòu)保存，蛋白信息見表2，利用Sybyl-X 2.1軟件Application模塊中Docking suite 對(duì)靶蛋白進(jìn)行去水，加氫等蛋白結(jié)構(gòu)優(yōu)化處理，根據(jù)靶點(diǎn)蛋白自身配體生成對(duì)接空腔位點(diǎn)口袋。

表2 與丹參黃酮類分子對(duì)接受體蛋白信息

1.2.3分子對(duì)接 利用Sybyl-X2.1 軟件Surflex-dock模塊，以23 個(gè)丹參黃酮類化合物分子為配體，20 個(gè)抗腫瘤靶點(diǎn)蛋白為受體進(jìn)行分子對(duì)接，以打分函數(shù)Total Score 為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)小分子配體與靶點(diǎn)蛋白的相互結(jié)合作用，Total Score 分?jǐn)?shù)高低反應(yīng)了配體與受體的結(jié)合能力大小，該函數(shù)計(jì)算綜合考慮了極性作用、疏水作用、焓和熔劑化等因素，該數(shù)值越大，表明小分子配體與大分子靶點(diǎn)蛋白的匹配結(jié)合活性較好，親和力較大。

1.2.4類藥性篩選 根據(jù)Lipinski五法則，使用Discovery Studio 2019 Client 的Filter by Lipinski 模塊進(jìn)行類藥性預(yù)篩選評(píng)估，預(yù)測(cè)氫鍵受體和供體的數(shù)量、油水分配系數(shù)（LogP）、分子量（MV）和極性表面積等屬性。

1.2.5基于計(jì)算機(jī)模擬的藥動(dòng)學(xué)和毒性研究 將篩選出的與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合力強(qiáng)的化合物進(jìn)行ADMET預(yù)測(cè)，采用Discovery Studio 2019 Client 軟件中small molecules 模塊中ADMET descriptors 進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，對(duì)化合物的吸收、分布、代謝、排泄和毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.6對(duì)接分析與圖像處理 采用Discovery Studio 2019 Client 軟件中Receptor-Ligand Interactions模塊對(duì)Total Score＞7［17］的分子對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行分析，并制作對(duì)接圖。

2 結(jié)果

2.1 分子對(duì)接結(jié)果將19 個(gè)丹參中黃酮類小分子配體與20 個(gè)腫瘤靶蛋白進(jìn)行結(jié)合評(píng)估，打分函數(shù)Total Score 顯示數(shù)值提示，紅根草鄰醌與腫瘤壞死因子-α（TNF-α），硫草酮與Polo樣激酶1（PLK-1），鼠尾酮與胰島素樣生長(zhǎng)因1 受體（IGF1R），二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2（ARL2），異丹參酮Ⅱ與酪氨酸和蘇氨酸蛋白激酶（TTK）結(jié)合最好，新隱丹參酮與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4），丹參酮ⅡA 與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），丹參酮Ⅵ與血小板源生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）的Total Score＞7，說(shuō)明結(jié)合作用較強(qiáng)。丹參中黃酮類小分子配體與靶蛋白對(duì)接結(jié)果，具體函數(shù)得分情況見表3。

本研究評(píng)價(jià)了8個(gè)具有高結(jié)合能力黃酮類化合物的類藥性，見表4，鼠尾酮、二氫丹參酮Ⅰ、異丹參酮Ⅱ、新隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅵ表現(xiàn)出合理的理化性質(zhì)：LogP≤5，MV＜500 g∕mol，氫鍵受體數(shù)≤10，氫鍵供體數(shù)≤5和PSA≤140?。

表4 對(duì)篩選的化合物進(jìn)行Lipinski五規(guī)則預(yù)測(cè)

2.2 ADMET 分子動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果篩選出的8個(gè)丹參黃酮類化合物進(jìn)行ADMET 預(yù)測(cè)結(jié)果見表5。根據(jù)水溶性預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，非常低：-8.00＜log（SW）＜-6.00；低：-6.00＜log（SW）＜-4.00；好：-4.00＜log（SW）＜-2.00；二氫丹參酮Ⅱ、新隱丹參酮和丹參酮Ⅵ水溶性評(píng)價(jià)處在-4.00＜log（SW）＜-2.00的區(qū)間里，水溶性較好；分子透過(guò)血腦屏障難易程度等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，極高：0；高：1；中等：2；低：3；不確定：4。二氫丹參酮Ⅱ、異丹參酮Ⅱ和丹參酮Ⅵ血腦屏障透過(guò)能力強(qiáng)，優(yōu)于其他化合物；根據(jù)細(xì)胞色素P450 的主要亞型CYP2D6對(duì)化合物代謝行為進(jìn)行評(píng)估，篩選出的化合物對(duì)細(xì)胞色素P450 2D6都無(wú)抑制作用；篩選出的化合物都與血漿蛋白有較高的結(jié)合率；根據(jù)總清除率（log mL·min-1·kg-1）來(lái)判斷藥物排泄的能力?？偳宄首罡叩氖嵌涞⑼狪，其次是丹參酮Ⅵ和新隱丹參酮；篩選出的化合物二氫丹參酮Ⅰ、異丹參酮Ⅱ、新隱丹參酮和丹參酮Ⅵ不具有肝毒性。綜上所述，化合物二氫丹參酮Ⅰ具有最佳藥物樣特性。

表5 8個(gè)黃酮類化合物的ADMET預(yù)測(cè)

2.3 篩選化合物的親和力分析為了驗(yàn)證篩選出的化合物二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2受體的結(jié)合情況，使用基于SPR技術(shù)的Biacore T200生物分子互作分析系統(tǒng)，將二氫丹參酮Ⅰ稀釋到32 μmol∕L，通過(guò)響應(yīng)值觀察小分子與蛋白的結(jié)合強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2 受體的響應(yīng)值高，結(jié)合具有較高的特異性，見圖1。

圖1 在Biacore系統(tǒng)中二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2受體蛋白結(jié)合響應(yīng)情況 圖2 二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2受體分子對(duì)接效果圖：2A為二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2作用的三維模式圖；2B為氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2作用的二維圖

2.4 對(duì)接結(jié)果分析二氫丹參酮Ⅰ相較于其余丹參黃酮類化合物，與ADP-核糖基化因子樣2 受體結(jié)合函數(shù)打分最高，Total Score 為8.140 2，分子對(duì)接得分為-85.040 8，為了明確二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2 受體的相互作用情況，采用分子對(duì)接技術(shù)分析其結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示，二氫丹參酮Ⅰ落入蛋白活性口袋中，且二氫丹參酮Ⅰ與氨基酸殘基精氨酸61（ARG61）形成氫鍵，與谷氨酰胺78（GLN78）形成C-H 鍵，與異亮氨酸29（ILE29）、蛋氨酸（MET20）等形成疏水鍵，見圖2。

3 討論

本研究將丹參中的19 個(gè)黃酮類小分子化合物與20個(gè)已知腫瘤靶點(diǎn)蛋白通過(guò)對(duì)接評(píng)估，將篩選出的化合物進(jìn)行類藥性、生物利用度和ADMET 預(yù)測(cè)，確定最佳藥物相似成分。其中二氫丹參酮Ⅰ具有最佳藥物樣特性。目前多數(shù)的丹參中黃酮類化合物的藥理研究多集中在隱丹參酮和丹參酮ⅡA，隱丹參酮能夠選擇性的抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的活性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［24］，丹參酮ⅡA 可通過(guò)下調(diào)COX-2的表達(dá)抑制大腸癌和直腸癌的血管生成［25］，本研究結(jié)果提示丹參酮ⅡA 與COX-2 的Total Score 優(yōu)于其余黃酮類化合物，初步驗(yàn)證了計(jì)算機(jī)篩選的準(zhǔn)確性。

此外，通過(guò)體外Biacore 系統(tǒng)檢測(cè)，二氫丹參酮Ⅰ與ADP-核糖基化因子樣2 受體具有較高的結(jié)合力。模擬對(duì)接分析結(jié)合受力方式，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中的醚鍵和酮基基團(tuán)可與靶點(diǎn)蛋白中的多個(gè)氨基酸以氫鍵及疏水鍵等作用力相結(jié)合。

綜上所述，虛擬篩選和分子對(duì)接有助于提高藥物篩選效率，本研究為丹參中黃酮類化合物二氫丹參酮Ⅰ抗腫瘤作用提供了理論基礎(chǔ)，為后續(xù)靶向ADP-核糖基化因子樣2 受體的小分子抑制劑的研發(fā)提供了良好的先導(dǎo)化合物。